Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Protocol

Etik Beyanı: Tüm hayvan çalışmaları New York Şehir Üniversitesi Hunter College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ön deneme İşlemleri

1. Hayvan tesis varışta, başlangıçta süzülmüş üst ve ahşap talaş yatak ile bir kafese 3 BALB / c fareler ev. Fareler yiyecek, purina kemirgen yemi ve su ücretsiz erişimi olduğundan emin olun. Kafesleri haftada bir kez temizlenmesi gerekir iken Yatak ve gıda haftada iki kez değiştirilmelidir.
2. Dakika başına 1 L sabit bir akış oranında oksijenle birlikte izofluran buharlaştırıcı kullanılarak farelerde, genel anestezi neden. Sistem kendine güvenen ve hassas buharlaştırıcı içerir.
3. Buna bağlı hassas buharlaştırıcı ve gaz / anestezik sistemine sahip bir plastik kutu içinde Pozisyon hayvan. Hayvan hangi noktada 2 buharlaştırıcı düşürmek, bilinçsiz kadar Başlangıçta 2.5 buharlaştırıcı ayarlayın.
4. O zaman, geçişVana hattı, kutu onu sızdırmazlık ve burun konisi onu açmadan.
5. Burun konisi (bakım anestezi için) düzgün yerleştirilmiş ve bağlanmış olan, hazırlık alanına hayvan hareket ettirin.
6. Fare başına implantasyon için 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücreleri hazırla. BNL 1ME A.7R.1 ortamında büyüyen olmalıdır (% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) hava ve% 5 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de bir hücre kültür kabı içinde inkübe CO _2.
7. Bir şırınga, bir 20 G iğne sahip olan, BALB / c farelerinin karaciğerinin bir kulak memesine 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 fare hepatoselüler karsinoma hücreleri ihtiva eden PBS implant 100 ul primer tümör üretmek. Sonrası emplantasyon ev ön implantasyonu ile aynı ev gereksinimleri olan bir kafese, BALB / c farelerinde indüklenmiştir.
8. Deneysel uç noktada, hepatosellüler karsinom klinik kanıt vücut kondisyonu önemli azalma olarak gözlemlenebilir(genellikle 4 hafta sonra tespit) skoru. Bu noktada, metastatik yatakları akciğerlerde oluşmuş ise primer tümörler, karaciğer gelişmiştir bir olasılık mevcuttur. Bundan sonra, dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonu ve yayılma süreci başlar.

Tümör Hücre İzolasyonu Sirkülasyon Tüm Kanı 2. Koleksiyonu

NOT: Düzgün cerrahi alan dezenfekte ve dağınıklıktan arınmış olduğundan emin olun. Tüm cerrahi aletler otoklav veya üreticinin tavsiyesine göre bir dezenfektan emmek

1. Deneysel sonu noktasında insani ötenazi (tümör gelişiminin klinik kanıt) tarafından fareler Kurban. Farelerin Euthanization _CO2 boğulmaya içermelidir. Anestezi onaylamak için düzgün fareler uyun doğru dağıtılır. Solunum durduracak şekilde 10 dakika - Karbondioksit 5 bir süre boyunca odaya yavaş yavaş serbest bırakılması gerekir. Intrakardiyak kan kaybından ve cervic tarafından takipal çıkığı. ⁵
2. Tam kan toplanması için bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 25 G iğne kullanın. 0,01 mi heparin ile şırınga Heparanize. Xyphisternum yaklaşık 45 ° açı ile aşağı iğne ile hemen Delinme cilt. Kalbi delinme yavaş yavaş iğne Advance, sonra iğnenin açısını azaltın. Mütemadiyen yerinde iğne ve şırınga tutun ve 500 ul dışarı çıkartalım - kalpten kanın 1.000 ul.
3. Şırınga ve iğne çıkarın ve önceden etiketlenmiş 1.5 ml'lik pirojensiz tüp içine kan transferi. 5 dakika boyunca 1167 x g'de 1.5 mi pirojensiz tüpe tam kan santrifüjleyin.
   Not: santrifüj, üç tabaka halinde, tüm kan örneğinin ayırır: kırmızı kan hücreleri, buffy coat bir ara ince tabaka, ve bir üst plazma katmanının oluşan alt ya da hematokrit katmanı.
4. Pipetle dikkatlice plazmayı çıkarın ve Furth için ayrı 1.5 ml pirojensiz tüp içine toplamaBu tür hücre içermeyen nükleik asitlerin ⁷ algılama gibi er deneyleri.
5. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) izolasyonu için, kırmızı kan hücresi (RBC) lizis hazırlanmasında ayrı bir 1.5 mi pirojensiz tüp içine buffy coat toplar. Bu ince beyaz tabaka tabakası kalıntı eritrositlerde kaldırmak için gereklidir.

Kırmızı kan hücresi (RBC) Liziz Tamponu 3. Tarif

1. RBC parçalama tamponu 1 L'lik bir çözelti sağlayın.
2. Bir amonyum klorür 500 ml Tris, 500 ml sağlayın. Daha sonra amonyum klorür 155 mM ve Tris, 10 mM bir son konsantrasyonda olan RBC parçalama tamponu 1 L'lik bir çözelti oluşturmak için karıştırılır.
3. 7.5 arasında bir pH değerine çözeltisi Tampon. 2 8 ° C'de RBC parçalama tamponu Mağaza ve kullanımdan hemen önce oda sıcaklığına getirin.

Buffy Coat 4. RBC Liziz

1. Toplanan ince beyaz tabakayı içeren steril pirojensiz bir 1.5 ml'lik tübe RBC parçalama tamponu 1 ml ilave edilir.
2. Tüpün içeriği karıştırınbirden çok kez ters yüz. Bankta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırılır tüpün içeriği inkübe edin. X g 1.167 5 dakika boyunca karıştırılır içeriği santrifüjleyin.
3. Santrifüj işleminden sonra, beyazımsı bir pelet elde edilir. Pelet herhangi bir kesinti olmadan yavaş ve dikkatli% 10 çamaşır suyu içine kırmızımsı süpernatant atın. 3.5 - pelet beyazımsı değilse, yeniden do 3.1 adımları tekrarlayın. 10 RBC parçalama tamponunda kuluçka süresinin arttırılması - 15 dakika da yararlı olabilir.
4. % 10 çamaşır suyu biyolojik atık arındırma 24 saat sonra tamamlandığında Güvenle biyolojik atıkların imha edin.

Hücre Kültürü 5. Yayılım

Not: Tümör hücreleri tipik olarak hızlı bir şekilde hücreler kabı içine ekilmiş hücrelerin özgün bir karışımı bol miktarda bulunan, beyaz kan hücreleri büyümektedir. Ortamının tekrar tekrar değiştirme ve kapalı zaman eğrilerinin sonraki geçişleri sonra tüm akyuvar çıkarılır ve kapalı zaman eğrilerinin nispeten saf popülasyon kalır.

1. Sonraki% 10 çamaşır suyu içine süpernatant atarak, hücre kültürü içinde yayılma için tam kültür ortamı içinde en az bir kez 1 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde beyaz pelet yıkayın ve süspansiyon haline getirin.
2. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, pelet tam BNL 1ME A.7R.1 kültür ortamında (FBS,% 10 ısı,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) 1 ml ekleyin ve kültür ortamında pelletini.
3. Bir hücre kültür çanak içine hücreleri yeniden süspanse karışımı Tohum. Hava ve% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de hücre kültürü çanağı inkübe edin.
4. Her iki veya üç gün hücre kültür ortamı değiştirin. Beş ila yedi gün sonra, KTC hücre kültürü çanak yapıştırılır ve çoğalan başlamış olacak. Bu hücreler 25 pasajlar ötesinde ve tekrarlanan donma ve çözülme döngüleri ⁵ sonra canlı kalacaktır.

Hepatosellüler karsinom 6. Doğrulama Tümör Hücre Hattı Sirkülasyon

1. Ap gerçekleştirinzincir reaksiyonu (PCR) bazlı bir yöntem olymerase, yeni bir CTC hücre çizgileri, orijinal implante BNL 1ME A.7R.1 HCC çizgi gibi fare hücreleri kurulan onaylamak için fare β-globin geninin sadece tek bir özel DNA bölümünün yükseltilmesi için. Yöntem aslında anlatılan ve Steube ark doğrulandı. ^5,8
2. Belirli bir antikor kullanarak protein 3 gibi 3 (CREB3L3) bağlanma hepatosite özel işaretleyici cAMP yanıt elemanı için immün gerçekleştirin. Bu kurulan KTC gerçekten orijinal implante BNL 1ME A.7R.1 hücre hattı gibi hepatositlerin bu romanı teyit edecektir. ⁵

Representative Results

Burada tarif edilen yöntem kapalı zaman eğrilerinin izole edilebilir olduğunu göstermiştir. Fareler insanca deneysel sonu noktasında ötenazi edildi. Süreç katılan karbondioksit asfiksi, intra-kardiyak kan kaybı ve servikal dislokasyon. Prosedürün temel aşamalarının bir şeması, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Intrakardiyak eksanguinasyon yoluyla toplanan tam kan örnekleri, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak işlenmiştir. Bundan sonra, santrifüjleme RBC lize tabi tutuldu ve ince beyaz tabaka tabaka belirlemek için kullanılmıştır. Bu, daha sonra PBS içinde yıkanmış, beyazımsı bir pelet toplamak için başka bir santrifüj aşaması takip ve hücre kültürü içinde çoğalma için tam bir hücre kültür ortamı içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. Çıkabilecek bir sorunu edilen pelet renkte net olmayabilir olmasıdır. Ek kez yaparak muhtemelen 15 dakika, ya da - Bu sorun kolayca 10 bunu artırarak RBC parçalama tamponunda inkübasyon süresi değiştirerek çözülebilir.BNL 1ME A.7R.1 hücreleri ile karşılaştırıldığında üç farklı fare Şekil 1 'de gösterilmiştir gelen kapalı zaman eğrilerinin temsili görüntüleri kültüründe yayılır edilir. Hızlı çoğalması ve morfolojisi seribaşı hücreler KTC ise belirlemenize yardımcı olacaktır. Ancak, adımlar 5.1 tarif PCR ve immün olarak doğrulama teknikleri - 5.2 yaşayabilir CTC hattının kurulmasını doğrulamak için gereklidir.

Ortotopik singenik Fare Modeli Hücre Kültürü tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) Sirkülasyon Şekil 1. Yayılma hepatoselüler karsinoma metastazı. Hücreler, BNL 1ME A.7R.1 kültür ortamı içinde 15 mm x 60 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında çoğaltılmıştır. Prolifere tümör hücreleri çanak yapıştırılır ve üç ayrı farelerden gösterilmiştir. Tümör hücreleri sürekli pasajlar aracılığıyla canlı kalmıştır. CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC08291 Faz kontrastlı görüntü1 ve CTCOLUF2419 BNL 1ME A.7R.1 hücreleri (40X büyütme) karşılaştırıldığında 40X büyütme (objektif lens) alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ayırma ve Çoğaltım bir fare kanser modeli System dolaşan tümör hücrelerinin Prosedür Şekil 2. şematik. Hepatoselüler karsinoma klinik kanıt gövdesi durumu skorunda belirgin azalma olarak gözlendiğinde, tam kan farelerden toplandı. Birkaç santrifüj RBC liziz ve birkaç yıkama aşamasından sonra, kapalı zaman eğrilerinin yayılması için hücre kültür kaplarına tohumlandı. Tümör hücresi çoğalması birkaç gün sonra gözlenmiştir. Diye tıklayınBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için yeniden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge