El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Protocol

Declaración de Ética: Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de Hunter College de la City University de Nueva York.

1. Procedimientos Pre-experimento

1. A su llegada a las instalaciones de animales, albergará inicialmente 3 ratones Balb / c con una jaula con una ropa de cama de arriba y astillas de madera filtrada. Asegúrese de que los ratones tienen libre acceso a la alimentación, purina comida para roedores y agua. Ropa de cama y comida deben cambiarse dos veces por semana, mientras que las jaulas deben limpiarse una vez a la semana.
2. Inducir la anestesia general en ratones usando un vaporizador de isoflurano junto con oxígeno a una velocidad de flujo constante de 1 L por minuto. El sistema es autosuficiente e incluye un vaporizador de precisión.
3. Posición animal en una caja de plástico que tiene el vaporizador precisión y gas / sistema de anestésico conectado a él. Inicialmente, ajuste el vaporizador para 2,5 hasta animal es inconsciente, en cuyo punto más bajo del vaporizador a 2.
4. En ese momento, cambie ellínea de válvulas, sellado a la caja y abrirla al cono de la nariz.
5. Mueva el animal a la zona de preparación, con el cono de la nariz colocado adecuadamente y conectado (para la anestesia de mantenimiento).
6. Preparar 5 × 10 ⁶ células HCC ratón BNL 1ME A.7R.1 para su implantación por ratón. BNL 1ME A.7R.1 debería estar creciendo en un medio (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) incubar en una placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% CO _2.
7. Con una jeringa que tiene una aguja G 20, el implante 100 l de PBS que contenía 5 x 10 ⁶ células de carcinoma hepatocelular ratón BNL 1ME A.7R.1 en un lóbulo de los hígados de los ratones BALB / c para producir los tumores primarios. Post-implantación, la casa de los ratones BALB / c en una jaula con los mismos requisitos de las casas como de pre-implantación.
8. En el punto final experimental, evidencia clínica de carcinoma hepatocelular es observable como la reducción significativa en la condición corporalanotar (usualmente detectada después de 4 semanas). En este punto, hay una probabilidad de que los tumores primarios han desarrollado en el hígado mientras que los depósitos metastásicos se han formado en los pulmones. A partir de entonces, comenzará el proceso de aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes.

2. Recolección de sangre entera para hacer circular Tumor Aislamiento celular

NOTA: correctamente desinfectado la zona de la cirugía y asegúrese de que está libre de desorden. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos o sumergirse en un desinfectante de acuerdo con las recomendaciones del fabricante

1. Sacrificar los ratones por eutanasia humanitaria al experimental de punto final (evidencia clínica de desarrollo de tumores). La eutanasia de los ratones debería involucrar _asfixia de CO 2. Observar los ratones adecuadamente para confirmar la anestesia se distribuye correctamente. El dióxido de carbono debe ser liberado lentamente en la cámara durante un período de 5 - 10 min, causando paro respiratorio. Siga por desangrado intracardiaca y CervicAl dislocación. ⁵
2. Use una aguja 25 G unida a una jeringa de 1 ml para la recogida de sangre completa. Heparanize la jeringa con 0,01 ml de heparina. Punción inmediatamente la piel con la aguja inferior al xyphisternum aproximadamente a 45 ° de ángulo. Avanzar la aguja lentamente para perforar el corazón, y luego bajar el ángulo de la aguja. Constantemente mantener la aguja y una jeringa en su lugar, y extraer 500 l - 1.000 l de sangre entera desde el corazón.
3. Retire la jeringa y la aguja y la transferencia de la sangre en un tubo libre de pirógenos pre-marcado con 1,5 ml. Centrifugar la sangre entera recogida en 1,5 ml tubo libre de pirógenos a 1.167 xg durante 5 min.
   NOTA: La centrifugación separa la muestra de sangre en tres capas: la capa inferior o el hematocrito que consiste en células rojas de la sangre, una capa delgada intermedia de la capa leucocitaria, y una capa de plasma superior.
4. Retire el plasma con cuidado con la pipeta y recoger en un tubo de 1,5 ml pirógenos separado para furthexperimentos er como la detección de ácidos nucleicos libres de células ^7.
5. Para el aislamiento de células tumorales circulantes (CTC), recoger la capa leucocitaria en un tubo libre de pirógenos 1,5 ml por separado en la preparación de glóbulos rojos (RBC) de lisis. Esto es necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales en la capa de la capa leucocitaria.

3. Receta de glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis

1. Hacer una solución 1 L de tampón de lisis RBC.
2. Hacer una 500 ml de cloruro de amonio y 500 ml de Tris. A continuación, mezclar para crear una solución de 1 l de tampón de lisis RBC con una concentración final de 155 mM de cloruro de amonio y 10 mM de Tris.
3. Amortiguar la solución a un pH de 7,5. Almacene el tampón de lisis RBC entre +2 y +8 ° C, y llevar a RT inmediatamente antes de su uso.

4. RBC lisis de Buffy Coat

1. Añadir 1 ml de tampón de lisis RBC al tubo de 1,5 ml estéril libre de pirógenos que contiene la capa leucocitaria recogida.
2. Mezclar el contenido del tubo porinvirtiendo varias veces. Incubar los contenidos mezclados del tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en el banquillo. Centrifugar los contenidos mezclados durante 5 min a 1167 x g.
3. Después de la centrifugación, se obtendrá un pellet blanquecino. Descartar el sobrenadante rojizo lentamente y con cuidado en 10% de lejía sin ninguna interrupción al sedimento. Si la pastilla no es blanquecina, volver a hacer los pasos 3.1 a 3.5. El aumento del tiempo de incubación en tampón de lisis RBC a 10 - 15 min también puede ser útil.
4. Deseche los residuos biológicos vez descontaminación de desechos biológicos en el 10% de lejía se completa después de 24 horas.

5. propagación en cultivo celular

NOTA: Las células tumorales son típicamente crecen rápidamente las células de glóbulos blancos que son abundantes en la mezcla original de células sembradas en el plato. Tras el cambio repetido de medio, y los pasajes posteriores de CTC, todas las células blancas de la sangre se retiran y una población relativamente pura de CTC permanece.

1. Despuésdescartando el sobrenadante en 10% de lejía, lavar el sedimento blanquecino en 1 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) al menos una vez, y resuspender en medio de cultivo completo para la propagación en cultivo celular.
2. Una vez que se ha completado lavado, añadir 1 ml de medio de cultivo A.7R.1 completa BNL 1ME (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) al sedimento y resuspender el precipitado en el medio de cultivo.
3. Sembrar la mezcla se volvieron a suspender las células en una placa de cultivo celular. Incubar la placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% de CO _2.
4. Cambiar el medio de cultivo celular cada dos o tres días. Después de cinco a siete días, los CTC se han adherido a la placa de cultivo celular y comenzó a proliferar. Estas células se mantendrán viable más allá de 25 pasajes y después de congelación y descongelación ciclos repetidos ^5.

6. Verificación de carcinoma hepatocelular circulantes línea de células tumorales

1. Realizar apolymerase reacción en cadena (PCR) método basado, para amplificar solamente un segmento de ADN específica del gen β-globina de ratón para confirmar que la novela estableció líneas celulares de CTC son células de ratón como la línea de BNL 1ME A.7R.1 HCC original implantada. Método fue originalmente descrito y validado por Steube et al. ^5,8
2. Realizar la inmunotinción para el elemento de respuesta a cAMP marcador específico de hepatocitos proteína de unión 3-like 3 (CREB3L3) mediante el uso de un anticuerpo específico. Esto confirmará que la novela CTC establecidos son de hecho los hepatocitos como el implantado línea original de células BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Representative Results

La metodología descrita aquí ha demostrado que las CTC se pueden aislar. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente al experimental de punto final. El proceso implicado carbono asfixia con dióxido, desangrado intra-cardiaca, y la dislocación cervical. Un diagrama esquemático de los pasos clave del procedimiento se ilustran en la Figura 2. Muestras de sangre total extraída por desangrado intra-cardiaca se procesaron utilizando el protocolo descrito anteriormente. Después de lo cual, se utilizó centrifugación para determinar la capa de la capa leucocitaria que se sometió a la lisis RBC. Esto fue seguido por otro paso de centrifugación para recoger un sedimento blanquecino que se lavó en PBS, y se resuspendió en medio de cultivo celular completa para la propagación en cultivo celular. Una cuestión que pueda surgir es que el sedimento obtenido puede no ser clara en color. Este problema se puede resolver fácilmente mediante la modificación del tiempo de incubación en tampón de lisis RBC por aumentarla a 10 - 15 min, o, posiblemente, mediante la realización de TI veces adicionales.Imágenes representativas de las CTC se propagaron en cultivo a partir se muestran tres ratones diferentes en la Figura 1 en comparación con células A.7R.1 BNL 1ME. La proliferación rápida y morfología le ayudará a identificar si las células sembradas son CTC. Sin embargo, las técnicas de verificación tales como la PCR y la inmunotinción descritos en los pasos 5.1 - 5.2 son necesarios para confirmar el establecimiento de una línea CTC viable.

Figura 1. La propagación de células tumorales circulantes (CTC) en cultivo celular de un modelo de ratón de ortotópico Singénico carcinoma hepatocelular Las células se propagaron en 15 mm x 60 mm placas de cultivo celular en medio de cultivo BNL 1ME A.7R.1 Metástasis.. La proliferación de las células tumorales adheridas al plato y se muestran a partir de tres ratones separados. Las células tumorales se han mantenido viables a través de pasos continuos. Imagen de contraste de fase de CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 y CTCOLUF2419 se tomaron a 40 aumentos (lente objetivo) en comparación con las células A.7R.1 BNL 1me (magnificación 40X). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Esquema del procedimiento de aislar y Difusión de células tumorales circulantes de un Sistema Modelo cáncer Mouse. Cuando se observó evidencia clínica de carcinoma hepatocelular como la reducción significativa en la condición corporal, la sangre entera se recogió de ratones. Después de varios centrifugaciones, RBC lisis, y varias etapas de lavado, los CTC se sembraron en placas de cultivo celular para la propagación. Proliferación de las células del tumor se observó después de varios días. Por favor, haga clic en élvolver para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge