Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Protocol

Declaração de Ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Hunter College of The City University of New York.

1. Procedimentos Pré-experimento

1. Após a chegada à facilidade animal, inicialmente casa de 3 camundongos BALB / c com uma gaiola com uma cama superior e lascas de madeira filtrada. Certifique-se de que os ratos têm acesso livre à comida, Purina para roedores e água. Roupa de cama e comida devem ser mudadas duas vezes por semana, enquanto as gaiolas devem ser limpas uma vez por semana.
2. Induzir a anestesia geral em ratinhos usando um vaporizador de isoflurano, juntamente com oxigénio a uma taxa de fluxo constante de 1 litro por min. O sistema é auto-suficiente e inclui um vaporizador de precisão.
3. Posição animal numa caixa de plástico que tem o vaporizador de precisão e de gás / sistema anestésico ligado a ele. Inicialmente definir o vaporizador para 2,5 até animal está inconsciente, altura em que o vaporizador para diminuir 2.
4. Naquele tempo, mude olinha de válvulas, selando-a para a caixa e abri-lo para o cone do nariz.
5. Mover o animal para a área de preparação, com o cone do nariz colocado adequadamente e ligado (para a manutenção da anestesia).
6. Prepare 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC para implantação por mouse. BNL 1ME A.7R.1 deve crescer num meio (10% de FBS inactivado pelo calor, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-Glutamina) incubar numa placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de ar e CO _2.
7. Com uma seringa tendo uma agulha G 20, o implante 100 ul de PBS contendo 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 células de carcinoma hepatocelular rato em um lóbulo do fígado de ratinhos BALB / C para produzir os tumores primários. Pós-implantação, a casa dos camundongos BALB / c em uma gaiola com os mesmos requisitos de casas como pré-implantação.
8. No ponto final experimental, evidência clínica de carcinoma hepatocelular é observável uma redução significativa na condição corporalpontuação (geralmente detectada após 4 semanas). Neste ponto, há uma probabilidade de que os tumores primários têm desenvolvido no fígado enquanto os depósitos metastáticos ter se formado nos pulmões. Em seguida, inicia o processo de isolamento e a propagação de células tumorais circulantes.

2. Recolha de Sangue Total para o isolamento de células de tumor circulantes

NOTA: devidamente higienizados área de cirurgia e verifique se ele está livre de desordem. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos ou mergulhar em um desinfectante de acordo com a recomendação do fabricante

1. Sacrifício camundongos por eutanásia humanitária no experimental ponto final (evidência clínica de desenvolvimento do tumor). Eutanásia dos ratos deve envolver CO ₂ asfixia. Observe a murganhos corretamente para confirmar a anestesia é distribuído corretamente. O dióxido de carbono deve ser libertado lentamente no interior da câmara ao longo de um período de 5 - 10 min, causando paragem respiratória. Siga por sangria intracardíaca e cérvicoal luxação. ⁵
2. Usar uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 mL para a recolha de sangue total. Heparanize a seringa com 0,01 ml de heparina. Punção da pele com a agulha imediatamente inferior ao xyphisternum a cerca de 45 ° de ângulo. Avance lentamente a agulha para perfurar o coração, e, em seguida, diminuir o ângulo da agulha. Firmemente segurar a agulha e seringa no lugar, e extrair 500 ul - 1.000 l de sangue total do coração.
3. Remover a seringa ea agulha e transferir o sangue para um tubo de 1,5 ml livre de pirogénio pré-rotulados. Centrifugar todo o sangue recolhido em 1,5 ml de tubo isento de pirogénios a 1167 xg durante 5 min.
   NOTA: A centrifugação separa a amostra de sangue em três camadas: a camada inferior ou de hematócrito que consiste em células vermelhas do sangue, uma fina camada intermédia de buffy coat, e uma camada de plasma superior.
4. Remover o plasma cuidadosamente por pipetagem e recolhendo-o em um tubo de 1,5 ml pyrogen-livre separado para furthexperimentos de er, tais como detecção de livre de células ácidos nucleicos ^7.
5. Para o isolamento de células tumorais circulantes (CTCs), recolher o buffy coat em um tubo de 1,5 ml livre de pirogénio separada em preparação para células vermelhas do sangue (RBC) de lise. Isto é necessário para eliminar os glóbulos vermelhos residuais na camada buffy coat.

3. Receita de glóbulos vermelhos (RBC) Tampão de Lise

1. Adicione uma solução de 1 L de tampão de lise dos glóbulos vermelhos.
2. Adicione a 500 ml de cloreto de amónio e 500 ml de Tris. Em seguida, misturam para criar uma solução de 1 L de tampão de lise dos glóbulos vermelhos com uma concentração final de 155 mM de cloreto de amónio e 10 mM de Tris.
3. Tamponar a solução a um pH de 7,5. Armazenar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos em 2-8 ° C, e levar a RT imediatamente antes do uso.

4. RBC Lise de Brasão Buffy

1. Adicionar 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para o tubo esterilizado de 1,5 mL isenta de pirogénio contendo buffy coat recolhido.
2. Misturar o conteúdo do tubo porinvertendo diversas vezes. Incubar os conteúdos misturados do tubo durante 5 min à temperatura ambiente no banco. Centrifugar os conteúdos foram misturados durante 5 min a 1167 x g.
3. Após a centrifugação, um sedimento esbranquiçado será obtida. Desprezar o sobrenadante avermelhada devagar e com cuidado em lixívia a 10%, sem qualquer interrupção para o sedimento. Se o sedimento não é esbranquiçado, voltar a fazer os passos 3,1-3,5. Aumentando o tempo de incubação em tampão de lise dos glóbulos vermelhos para 10 - 15 minutos também pode ser útil.
4. Com segurança descartar o lixo biológico, uma vez descontaminação de resíduos biológicos em 10% de alvejante está completa após 24 horas.

5. Propagação de Cultura de Células

NOTA: As células de tumor de crescimento rápido são tipicamente células de glóbulos brancos que são abundantes na mistura original de células semeadas para o prato. Depois da mudança de forma repetida, e de passagens subsequentes CTC, todas as células brancas do sangue são removidas e uma população relativamente pura de CTC permanece.

1. Depoisdescartando o sobrenadante para 10% de lixívia, lavar o sedimento esbranquiçada em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pelo menos uma vez, e ressuspender em meio de cultura completo para a propagação em cultura de células.
2. Depois de lavagem é completado, adicionar 1 ml de meio de cultura BNL 1ME A.7R.1 completo (10% de FBS inactivado pelo calor, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina) ao sedimento e ressuspender o sedimento em meio de cultura.
3. Semear o mix novamente suspensas de células em um prato de cultura de células. Incubar a placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora humidificada com ar e 5% de CO _2.
4. Mudar o meio de cultura celular a cada dois a três dias. Após cinco a sete dias, CTCs terão aderido à placa de cultura celular e começou a proliferar. Estas células permanecerá viável além de 25 passagens e após repetidos ciclos de congelamento e descongelamento ^5.

6. Verificação de carcinoma hepatocelular linha de células tumorais circulantes

1. Execute apolymerase reacção em cadeia (PCR) baseado, para amplificar um único segmento de DNA específica do gene globina do rato β-para confirmar que a nova linhas celulares estabelecidas CTC são células de ratinho, como a linha original é implantado BNL 1ME A.7R.1 HCC. Método foi originalmente descrito e validado por Steube et al. ^5,8
2. Realizar imunocoloração para o elemento de resposta específicos de hepatócitos marcador proteína de ligação cAMP como 3-3 (CREB3L3) usando um anticorpo específico. Isso irá confirmar que o romance CTCs estabelecidos são de fato hepatócitos como a linha de células BNL 1ME A.7R.1 original é implantado. ⁵

Representative Results

A metodologia aqui descrita CTC mostrou que pode ser isolado. Os ratos foram sacrificados aos experimental humanamente de ponto final. O processo envolveu asfixia dióxido de carbono, sangria intra-cardíaca e deslocamento cervical. Um esquema de fases principais do processo são ilustrados na Figura 2. As amostras de sangue total coletado por sangria intra-cardíaca foram processados ​​utilizando o protocolo descrito acima. Após o que, a centrifugação foi usada para determinar a camada de revestimento de Buffy, que foi submetido à lise dos glóbulos vermelhos. Este foi seguido por um outro passo de centrifugação para recolher um sedimento esbranquiçado que foi lavado em PBS e ressuspensas em meio completo de cultura de células para a propagação em cultura de células. Um problema que pode surgir é que o sedimento obtido pode não ser claro na cor. Este problema pode ser facilmente resolvido através da modificação do tempo de incubação em tampão de lise dos glóbulos vermelhos, aumentando-a 10 - 15 min, ou, possivelmente, realizando-vezes adicionais.Imagens representativas da CTC ser propagadas em cultura a partir de três ratos diferentes são mostrados na Figura 1 em comparação com células A.7R.1 BNL 1ME. Rápida proliferação e morfologia ajudará a identificar se as células são semeadas CTCs. No entanto, as técnicas de verificação, tais como PCR e imunocoloração descritos nos passos 5.1 - 5.2 são necessários para confirmar o estabelecimento de uma linha CTC viável.

Figura 1. A propagação de células tumorais circulantes (CTCs) em cultura de células a partir de um modelo de camundongo ortotópico Singênico carcinoma hepatocelular As células foram propagadas em 15 mm x 60 mm pratos de cultura de células em BNL 1ME A.7R.1 meio de cultura metástase.. Proliferam as células tumorais aderiram ao prato e são mostrados a partir de três ratinhos separados. As células tumorais têm permanecido viável através de passagens contínuas. Imagem de contraste de fase de CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 e CTCOLUF2419 foram tomadas em 40X (lente objetiva) em comparação com células A.7R.1 BNL 1ME (aumento de 40 vezes). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Esquema do Processo de isolar e da Propagação células tumorais circulantes de um Sistema Modelo Cancer Mouse. Quando evidência clínica de carcinoma hepatocelular foi observada redução significativa no escore de condição corporal, o sangue total foi coletado de ratos. Depois de várias centrifugações, RBC lise, e vários passos de lavagem, as CTCs foram semeadas em placas de cultura de células para propagação. Proliferação de células tumorais foi observada após vários dias. Por favor, clique elere para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge