Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Hunter College van de City University van New York.

1. Pre-experiment Procedures

1. Bij aankomst in het dierverblijf aanvankelijk huis 3 BALB / c muizen een kooi met een gefilterde top en houtsnippers beddengoed. Zorg ervoor dat de muizen hebben gratis toegang tot voedsel, Purina knaagdieren voer en water. Beddengoed en voedsel moet tweemaal per week worden gewijzigd terwijl kooien keer per week worden schoongemaakt.
2. Induceren algemene anesthesie bij muizen met behulp van een isofluraan vaporizer samen met zuurstof bij een constante snelheid van 1 liter per minuut. Het systeem is zelfstandig en heeft een precisie vaporizer.
3. Positie dier in een plastic doos die de nauwkeurigheid verdamper en gas / anesthesiesysteem aangesloten is. Aanvankelijk de verdamper tot 2,5 tot dier bewusteloos is, op welk punt lager de verdamper 2.
4. Op dat moment, schakelt deklep lijn, afdichting aan de doos en het openen van de neuskegel.
5. Beweeg het dier naar de bereidingszone, de neuskegel correct opgesteld en aangesloten (onderhoud anesthesie).
6. Bereid 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 muis HCC cellen voor implantatie per muis. BNL 1ME A.7R.1 moeten groeien in medium (10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) incuberen in een celkweek schaal bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% CO _2.
7. Met een spuit met een 20 G naald implantaat 100 pl PBS dat 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 muis hepatocellulaire carcinoomcellen in een kwab van de lever van BALB / c muizen om de primaire tumoren. Na implantatie, het huis van de BALB / c muizen in een kooi met hetzelfde huis voorschriften als pre-implantatie.
8. Aan het experimentele eindpunt klinisch bewijs van hepatocellulaire carcinoom is waarneembaar als significante vermindering van lichaamsconditiescore (meestal ontdekt na 4 weken). Op dit punt is er een kans dat primaire tumoren ontwikkeld in de lever, terwijl metastatische afzettingen in de longen hebben gevormd. Daarna begint het proces van de isolatie en vermeerdering van circulerende tumorcellen.

2. Verzameling van volbloed voor het circuleren van Tumor Cell Isolation

LET OP: Goed sanitized de operatie gebied en zorg ervoor dat het rommel-vrij. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten of weken in een desinfecterend middel volgens de aanbevelingen van de fabrikant

1. Offer muizen door humane euthanasie bij experimentele eindpunt (klinisch bewijs van de ontwikkeling van tumoren). Euthanization muizen moeten CO ₂ stikken betrekken. Neem de muizen naar behoren anesthesie bevestigen dat juist verdeeld. Kooldioxide dient langzaam vrijkomen in de kamer gedurende 5 - 10 min, waardoor ademhalingsstilstand. Volg door intracardiale verbloeding en cervicoal dislocatie. ⁵
2. Gebruik van een 25 G naald bevestigd aan een injectiespuit 1 ml voor het verzamelen van bloed. Heparanize de spuit met 0,01 ml heparine. Punctie de huid onmiddellijk met de naald inferieur aan de xyphisternum bij ongeveer 45 ° hoek. Advance naald langzaam naar het hart doorboren, en vervolgens de hoek van de naald. Gestaag Houd de naald en spuit in de plaats, en trekken uit 500 ul - 1000 pi volledig bloed uit het hart.
3. Verwijder de spuit en naald en bloed over in een gelabelde 1,5 ml pyrogeenvrij buis. Centrifugeer de volbloed in 1,5 ml pyrogeenvrij buis verzameld op 1167 g gedurende 5 min.
   Opmerking: De centrifugatie scheidt het monster van compleet bloed in drie lagen: de onderste laag bestaande of hematocriet van rode bloedcellen, een tussenliggende dunne laag buffy coat en een bovenste plasmalaag.
4. Verwijder de plasma voorzichtig door pipetteren en het verzamelen van het in een afzonderlijke 1,5 ml pyrogeen-vrij buis Further experimenten zoals detectie van celvrije nucleïnezuren ^7.
5. Voor isolatie van circulerende tumorcellen (CTCs), verzamelt de bufferlaag in een afzonderlijke 1,5 ml pyrogeenvrij buis voorbereiding voor rode bloedcellen (RBC) lysis. Dit is noodzakelijk om resterend RBC in de buffy coat laag te verwijderen.

3. Recept voor rode bloedcellen (RBC) Lysis Buffer

1. Maak een 1 L oplossing van RBC lysis buffer.
2. Wordt 500 ml ammoniumchloride en 500 ml Tris. Meng een 1 L oplossing van RBC lysis buffer te creëren met een eindconcentratie van 155 mM ammoniumchloride en 10 mM Tris.
3. Buffer de oplossing een pH van 7,5. Bewaar de RBC lysis buffer bij 2 tot 8 ° C en breng tot kamertemperatuur onmiddellijk voor gebruik.

4. RBC Lysis van Buffy Coat

1. Voeg 1 ml RBC lysis buffer om de steriele pyrogeenvrije 1,5 ml buis die de verzamelde buffy coat.
2. Meng de inhoud van de buis doorinverterende meerdere keren. Incubeer de gemengde inhoud van de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op de bank. Centrifugeer de gemengde inhoud gedurende 5 min bij 1167 x g.
3. Na centrifugeren wordt een witachtige korrel verkregen. Gooi de roodachtige supernatant langzaam en voorzichtig in 10% bleekmiddel, zonder verstoring van de pellet. Als de pellet is niet witachtig, re-do stappen 3,1-3,5. Het verhogen van de incubatietijd in RBC lysis buffer om 10 - 15 min kunnen eveneens nuttig zijn.
4. Veilig verwijderen van de biologisch afval eenmaal ontsmetting van biologisch afval in 10% bleekwater is voltooid na 24 uur.

5. Vermeerdering in celkweek

OPMERKING: Tumorcellen worden meestal snel groeiende cellen witte bloedcellen die overvloedig in de oorspronkelijke combinatie van cellen gezaaid in de schaal zijn. Na herhaalde verandering van medium en daaropvolgende passages van CTCs, worden alle witte bloedcellen verwijderd en een relatief zuivere populatie van CTCs blijft.

1. Naweggooien van het supernatant tot 10% bleekmiddel, was de witachtige pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ten minste eenmaal, en resuspendeer in volledig kweekmedium voor propagatie in celcultuur.
2. Was eenmaal is voltooid, voeg 1 ml compleet BNL 1ME A.7R.1 kweekmedium (10% door warmte geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) aan de pellet en resuspendeer de pellet in het kweekmedium.
3. Zaad de geresuspendeerde mix van cellen in een celkweek schotel. Incubeer de celkweekschaal bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% _CO2.
4. Verander het celkweekmedium elke 2-3 dagen. Na vijf tot zeven dagen, zal CTC's hebben gehandeld op grond van de celkweek gerecht en begonnen prolifererende. Deze cellen zullen levensvatbaar dan 25 passages en na herhaalde bevriezen en ontdooien cycli ⁵ blijven.

6. Keuring van Hepatocellulair Carcinoom doorgeven tumorcellijn

1. Voeren apolymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde methode slechts één specifieke DNA segment van het muizen β-globine-gen te amplificeren om te bevestigen dat de nieuwe CTC vastgestelde cellijnen muizencellen zoals de oorspronkelijke geïmplanteerde BNL 1ME A.7R.1 HCC lijn. Methode werd oorspronkelijk beschreven en gevalideerd door Steube et al. ^5,8
2. Voer immunokleuring van de hepatocyt-specifieke marker cAMP responsief element bindingseiwit 3-achtige 3 (CREB3L3) door een specifiek antilichaam. Dit zal dat nieuwe gevestigde CTC inderdaad hepatocyten als het origineel geïmplanteerde BNL 1ME A.7R.1 cellijn te bevestigen. ⁵

Representative Results

De hier beschreven methode heeft aangetoond dat CTCs worden geïsoleerd. Muizen werden op humane wijze gedood bij experimentele eindpunt. Het proces betrokken kooldioxide stikken, intra-cardiale leegbloeden en cervicale dislocatie. Een schema van de belangrijkste stappen van de procedure zijn weergegeven in figuur 2. Volbloedmonsters door intra-cardiale leegbloeden verzameld werden verwerkt volgens de hierboven beschreven protocol. Daarna werd centrifugeren toegepast om de buffy coat laag die werd onderworpen aan de RBC lysis te bepalen. Dit werd gevolgd door een centrifugatie stap een witachtige korrel die in PBS gewassen verzamelen en opnieuw gesuspendeerd in volledig celkweekmedium voor propagatie in celcultuur. Een probleem dat kan komen dat de pellet verkregen niet helder van kleur zijn. Dit probleem kan eenvoudig worden opgelost door aanpassing van de incubatietijd in RBC lysis buffer door het op 10 - 15 min, of eventueel door het uitvoeren van deze extra tijd.Representatieve beelden van CTCs wordt vermeerderd in cultuur uit drie verschillende muizen worden getoond in figuur 1 vergeleken met BNL 1ME A.7R.1 cellen. Snelle verspreiding en morfologie zullen helpen identificeren als cellen gezaaid zijn CTC. Echter, verificatie technieken zoals PCR en immunokleuring in de stappen 5.1 - 5.2 zijn nodig om de oprichting van een levensvatbare CTC lijn te bevestigen.

Figuur 1. Voortplanting van circulerende tumorcellen (CTC's) in celkweek van een orthotope Syngene muismodel van Hepatocellulair carcinoom metastase. De cellen werden gekweekt in 15 mm x 60 mm celkweek gerechten in BNL 1ME A.7R.1 kweekmedium. Delende tumorcellen gehandeld te schotelen en worden getoond van drie afzonderlijke muizen. Tumorcellen zijn levensvatbaar blijven door voortdurende passages. Fase contrast beeld van CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 en CTCOLUF2419 werden genomen bij 40x vergroting (objectief) in vergelijking met BNL 1ME A.7R.1 cellen (40x vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Schematische voorstelling van de orde van Isoleren en teelt- circulerende tumorcellen van een muis Cancer System. Bij klinisch bewijs van hepatocellulaire carcinoom werd waargenomen als significante vermindering van conditiescore, volbloed werd verzameld van muizen. Na een aantal centrifugaties, RBC lysis, en verscheidene wasstappen werden de CTC's geënt in celcultuur gerechten voor vermeerdering. Tumorcelproliferatie werd waargenomen na enkele dagen. Klik hijopnieuw voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge