Isolering och förökning av cirkulerande tumörceller från en mus Cancer

Protocol

Etik uttalande: Alla djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av Hunter College of The City University i New York.

1. Pre-experiment procedurer

1. Vid ankomsten till djuret anläggningen, initialt rymma 3 BALB / c-möss till en bur med en filtrerad topp och flis sängar. Se till att mössen har fri tillgång till mat, Purina rodent chow och vatten. Sängkläder och mat bör ändras två gånger i veckan medan burar bör rengöras en gång i veckan.
2. Inducera narkos på möss med användning av en isofluran förångare tillsammans med syre vid en konstant flödeshastighet av 1 L per minut. Systemet är självständiga och har en precision Vaporizer.
3. Positions djur i en plastlåda som har precisionen förångaren och gas / anestesisystem anslutet till den. Ställ först in förångaren till 2,5 tills djuret är medvetslöst, vid vilken punkt sänka förångaren till 2.
4. På den tiden växlaventillinje, tätning till lådan och öppna den till noskonen.
5. Flytta djuret till förberedelseområdet, med noskonen riktigt placerade och anslutna (för underhållsanestesi).
6. Förbered 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler för implantation per mus. BNL 1ME A.7R.1 bör växa i medium (10% värmeinaktiverat FBS, 1% penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin) inkubation i en cellodlingsskål vid 37 ° C i en fuktad inkubator med luft och 5% CO _2.
7. Med en spruta med en 20 G nål, att implantat 100 pl PBS innehållande 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulära karcinomceller i en lob hos levern hos BALB / c-möss producerar de primära tumörer. Efter implantationen, hus de BALB / c-möss i en bur med samma hus krav som pre-implantering.
8. Vid den experimentella slutpunkt, är observeras som betydande minskning av kondition kliniska tecken på hepatocellulär cancerpoäng (oftast upptäcks efter 4 veckor). Vid denna punkt, är det sannolikt att primära tumörer har utvecklats i levern medan metastaser avlagringar har bildats i lungorna. Därefter inleda processen att isolering och förökning av cirkulerande tumörceller.

2. Insamling av helblod för cirkulerande tumörcellisolering

OBS: Korrekt sanerad operationen området och se till att det är fritt från plotter. Autoklav alla kirurgiska instrument eller bada i ett desinfektionsmedel enligt tillverkarens rekommendation

1. Sacrifice möss genom humana dödshjälp vid experimentell slutpunkt (kliniska tecken på tumörutveckling). Eutanasi av möss bör involvera CO ₂ kvävning. Observera mössen ordentligt för att bekräfta anestesi korrekt fördelad. Koldioxid skall frisättas långsamt in i kammaren under en period av 5 - 10 minuter, vilket orsakar andningsstillestånd. Följ genom intrakardiell blodtömning och cervical störningen. ⁵
2. Använd en 25 G-nål fäst till en 1 ml spruta för uppsamling av helblod. Heparanize sprutan med 0,01 ml heparin. Punktering huden omedelbart med nålen underlägsen den xyphisternum vid approximativt 45 ° vinkel. Advance nålen långsamt att punktera hjärtat, och sedan sänka vinkel av nålen. Stadigt hålla nålen och sprutan på plats, och dra ut 500 pl - 1000 il helblod från hjärtat.
3. Ta bort sprutan och nålen och överföra blodet till en i förväg märkt 1,5 ml pyrogenfritt rör. Centrifugera helblodet samlas i 1,5 ml pyrogenfritt röret vid 1167 xg under 5 minuter.
   OBS: Centrifuger separerar helblodprovet i tre skikt: botten eller hematokrit skikt bestående av röda blodkroppar, ett mellanliggande tunt skikt av buffy coat och en övre plasmaskikt.
4. Ta plasman försiktigt genom pipettering och samla det i en separat 1,5 ml pyrogenfritt rör för furthER-experiment som detektion av cellfria nukleinsyror ^7.
5. För isolering av cirkulerande tumörceller (CTCs), samla lättcellskoncentratet till ett separat 1,5 ml pyrogenfritt röret som förberedelse för röda blodkroppar (RBC) lys. Detta är nödvändigt för att avlägsna kvarvarande röda blodkropparna i koncentratskiktet.

3. Recept på röda blodkroppar (RBC) Lysis Buffer

1. Gör en 1 L lösning av RBC-lyseringsbuffert.
2. Gör en 500 ml ammoniumklorid och 500 ml Tris. Blanda sedan för att skapa en 1 L lösning av RBC-lyseringsbuffert med en slutlig koncentration av 155 mM ammoniumklorid och 10 mM Tris.
3. Buffra lösningen till ett pH av 7,5. Förvara RBC lys buffert vid 2-8 ° C, och ta till RT omedelbart före användning.

4. RBC Lys av Buffy Coat

1. Tillsätt 1 ml av RBC-lyseringsbuffert till sterilt pyrogenfritt 1,5 ml rör innehållande det uppsamlade gula hinnan.
2. Blanda innehållet i röret genominverterande flera gånger. Inkubera blandade innehållet i röret under 5 min vid RT på bänken. Centrifugera blandade innehållet under 5 min vid 1167 x g.
3. Efter centrifugering, kommer ett vitaktigt pellet erhållas. Kasta den rödaktiga supernatanten långsamt och försiktigt i 10% blekmedel utan avbrott i pelleten. Om pellets är inte vitaktig, steg åter göra 3,1-3,5. Att öka inkubationstiden i RBC-lyseringsbuffert till 10 - 15 min kan också vara till hjälp.
4. Kassera den biologiskt avfall gång sanering av biologiskt avfall i 10% blekmedel är fullbordad efter 24 timmar.

5. Förökning i cellodling

OBS: Tumörceller är vanligtvis snabbt växande celler vita blodkroppar som är rikligt förekommande i den ursprungliga blandningen av celler sådda i skålen. Efter upprepad byte av medium, och efterföljande passager av CTCs, är alla de vita blodkropparna avlägsnas och en relativt ren population av CTCs står.

1. Efterkasta supernatanten i 10% blekmedel, tvätta vitaktig pelleten i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) åtminstone en gång, och återsuspendera i fullständigt odlingsmedium för förökning i cellkultur.
2. När tvätt är klar, tillsätt 1 ml komplett BNL 1ME A.7R.1 odlingsmedium (10% värmeinaktiverat FBS, 1% penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin) till pelleten och resuspendera pelleten i odlingsmediet.
3. Seed den återsuspenderade blandningen av celler in i en cellodlingsskål. Inkubera cellodlingsskål vid 37 ° C i en fuktad inkubator med luft och _5% CO2.
4. Ändra cellodlingsmediet var två till tre dagar. Efter fem till sju dagar, kommer CTC har anslutit sig till cellodlings skålen och började frodas. Dessa celler kommer att förbli livskraftig än 25 passager och efter upprepade frys- och upptiningscykler ^5.

6. Kontroll av Hepatocellulär cancer Cirkulerande tumörcellinjen

1. Utför apolymerase kedjereaktion (PCR) -baserad metod, för att amplifiera endast en specifik DNA-segment enligt mus β-globingenen för att bekräfta att den nya etablerade CTC cellinjer är musceller som originalet implanterade BNL 1ME A.7R.1 HCC linje. Metod beskrevs ursprungligen och validerats av Steube et al. ^5,8
2. Utför immunofärgning för hepatocyte specifik markör cAMP responsiva elementet bindande protein 3-liknande 3 (CREB3L3) med hjälp av en specifik antikropp. Detta bekräftar att nya etablerade CTC är verkligen hepatocyter som originalet implanterade BNL 1ME A.7R.1 cellinje. ⁵

Representative Results

Den metod som beskrivs här har visat att CTCs kan isoleras. Mössen humant avlivades vid experimentell ändpunkt. I processen medverkade kvävning med koldioxid, inom hjärt avblodning, och halsdislokation. En schematisk bild av de viktigaste stegen i förfarandet illustreras i figur 2. Hela blodprover som samlats in av Intrakardiella exsanguination bearbetades med användning av protokollet som beskrivs ovan. Efter som utfördes centrifugering användes för att bestämma koncentratskiktet som underkastades RBC-lys. Detta följdes sedan av ett annat centrifugeringssteg för att samla in en vitaktig pellet som tvättades i PBS och återsuspenderades i fullständigt cellodlingsmedium för förökning i cellkultur. En fråga som kan komma upp är att erhållna pelleten inte kan vara tydlig i färg. Detta problem kan lösas enkelt genom att modifiera inkubationstiden i RBC-lyseringsbuffert genom att öka den till 10 - 15 minuter, eller möjligen genom att utföra det ytterligare gånger.Representativa bilder av CTCs att förökas i odling från tre olika möss visas i figur 1 jämfört med BNL 1ME A.7R.1 celler. Snabb spridning och morfologi kommer att bidra till att identifiera om celler seedade är CTC. Men kontrolltekniker såsom PCR och immunfärgning som beskrivs i steg 5.1 - är 5.2 behövs för att bekräfta inrättandet av en livskraftig CTC linje.

Figur 1. Förökning av cirkulerande tumörceller (CTCs) i cellodling från en Orthotopic syngen musmodell för Hepatocellulär cancer Metastas. Cellerna förökades i 15 mm x 60 mm cellodlingsskålar i BNL 1ME A.7R.1 odlingsmedium. Prolifererande tumörceller följs dela och visas från tre separata möss. Tumörceller har förblivit lönsamt genom kontinuerliga passager. Faskontrastbild av CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 och CTCOLUF2419 togs vid 40X förstoring (objektiv) i jämförelse med BNL 1ME A.7R.1 celler (40X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Schematisk av ordningen för att isolera och föröknings Cirkulerande tumörceller från en mus Cancer modellsystem. När kliniska tecken på levercancer observerades betydande minskning av kondition poäng, var helblod från möss. Efter flera centrifuge, RBC lys, och flera tvättstegen, ades CTCs såddes i cellodlingsskålar för förökning. Tumörcellsproliferation observerades efter flera dagar. Klicka var hanre att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge