Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение повреждения и восстановления ДНК в мышиных спленоцитах После Хронический

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52912

⸱

3 июля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для оценки изменений уровней повреждения ДНК и способности к репарации ДНК, которые могут быть вызваны хроническим облучением низкой дозой in vivo в лимфоцитах селезенки мыши, путем измерения фосфорилированного гистона H2AX, маркера двухцепочечных разрывов ДНК, с использованием проточной цитометрии.

Аннотация

Низкая доза облучения радиации может производить различные биологические эффекты, которые отличаются по количеству и качеству от эффектов, вызываемых высокими дозами радиации. Обращаясь вопросы, связанные с безопасностью окружающей среды, охраны труда и здравоохранения в правильной и научно обоснованного образом в значительной степени зависит от способности точно измерять биологические эффекты малых доз загрязняющих веществ, таких как ионизирующее излучение и химические вещества. Повреждения и репарации ДНК являются наиболее важными первые признаки рисков для здоровья из-за их потенциальных последствий долгосрочных, таких как рак. Здесь мы опишем протокол для изучения влияния хронический естественных воздействия низких доз γ- и β-излучения на повреждения ДНК и ремонт в мышиных клеток селезенки. Использование общепринятого маркер ДНК двунитевых разрывов, фосфорилируется гистонов Н2АХ называется γH2AX мы покажем, как он может быть использован для оценки не только уровни повреждения ДНК, но также изменяетв ремонт мощностью ДНК потенциально производится низкой дозе облучения в естественных условиях. Проточная цитометрия позволяет быстро, точно и надежно измерить immunofluorescently меченого γH2AX в большом количестве образцов. ДНК двухцепочечной ремонта разрыв может быть оценена путем воздействия извлеченные спленоцитов к радикальной дозы 2 Гр для получения достаточного количества разрывов ДНК, чтобы вызвать восстановление, а путем измерения индуцированного (1 ч после облучения) и остаточный повреждение ДНК (24 часов после облучения). Остаточная повреждение ДНК будет свидетельствовать о неполном ремонта и риск долгосрочного геномной нестабильности и рака. В сочетании с другими анализами и конечных точек, которые могут быть легко измерены в например в естественных условиях исследования (например, хромосомные аберрации, микроядра частот в ретикулоцитов костного мозга, экспрессии генов и т.п.), этот подход позволяет точно и контекстную оценку биологических эффектов стрессоров низком уровне.

Введение

Значительное Споры о возможном вредном воздействии низкой или очень низких дозах ионизирующего излучения и страх общественности излучения, что обусловлено изображений атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки и редких аварий атомных станций (усугубляется массовой информации), привело к очень строгое регулирование радиационной защиты и стандарты, которые потенциально не научно обоснованным. В течение последних трех десятилетий, многочисленные доклады документально как отсутствие вредных и наличие потенциально полезных биологических эффектов, вызванных низкой дозой излучения 1-4. Основным фактором риска радиационного здоровье вероятность рака, по оценкам на основе эпидемиологических исследований переживших атомные бомбы, получающих высокие или средние дозы радиации. Линейной экстраполяции этих данных (так называемых не-линейное нет порога или LNT модель) используется для оценки рисков рака при низких дозах. Тем не менее, этот подход не получил мировую научную принятиеи сильно обсуждается 5.

Очевидно, что больше исследования необходимы, чтобы прояснить этот вопрос и, возможно, улучшить стандарты радиационной защиты. Такие исследования должны включать хронические процедуры (наилучшее приближение экологических и профессиональных рисков), в естественных условиях на животных моделях (лучше для экстраполяции эффектов к человеку) и такие конечные точки, как уровень повреждений ДНК, ремонт ДНК и мутагенеза. Известно, что ДНК основной мишенью для повреждения радиационных эффектов и неполным или неправильно ремонт может привести к мутагенеза и рака развития 6.

ДНК двухцепочечной разрывы (DSB) являются одним из самых вредных видов повреждений ДНК и может привести к гибели клеток и онкогенеза 7. Поэтому, важно, чтобы иметь возможность надежно и точно измерить уровень DSB после воздействия малых доз радиации и / или других факторов стресса, таких как химических загрязнителей. Одним из наиболее чувствительных и специфических маркеровДНК DSB фосфорилируется гистонов Н2АХ, называется γH2AX 8, пока другие маркеры и методы были предложены 9,10. Считается, что тысячи молекул H2AX, в непосредственной близости от индуцированного DSB, которые участвуют в формировании благоприятной γH2AX обнаружение индивидуального DSB по иммунофлуоресцентного маркировки с антителом и флуоресцентной микроскопии анти-γH2AX 11. Ответ очень быстро, достигая максимума между 30 и 60 мин. Существуют доказательства того, что γH2AX облегчает ремонт ДНК DSB путем привлечения других факторов ремонт на сайты разрывов и изменения структуры хроматина, чтобы закрепить концы сломанной ДНК и обеспечить доступ для других белков ремонт (рассмотренных в 12). После завершения ремонта ДНК DSB, γH2AX получает де-фосфорилируется и / или подвергается деградации, и вновь синтезированные молекулы H2AX заменить γH2AX в пострадавших районах хроматина 10. Формирование и потери γH2AX Мониторинг может,Поэтому, обеспечивают точную оценку ДНК DSB ремонт кинетики. Этот подход был использован для изучения ремонт DSB в различных линий опухолевых клеток человека, облученных высокими дозами радиации и ее скорости и остаточных уровней DSB, как было показано, коррелирует с радиочувствительности 13-15.

Мы изменили эту экспериментальный подход и применять его в естественных условиях в исследовании мыши, чтобы изучить влияние малых доз хронического γ- и β-облучения на уровнях и ремонта (рис 1) ДНК DSB. Во-первых, мы продемонстрировать способ для выполнения долгосрочного Хроническое воздействие мышей с β-излучение, испускаемое либо тритий (водород-3) в виде тритием воды (НТО), либо как органически связанный тритий (ОСТ), растворенного в питьевой воде , Эти две формы, как ожидается, накапливать и / или распространение по-разному в организме и, следовательно, производить различные биологические эффекты. Обе формы потенциальные опасности в ядерной промышленности. Это лечениеидет параллельно с хроническим воздействием γ-излучения при эквивалентной дозы, чтобы правильно сравнение двух типов излучения, которая имеет решающее значение для оценки их относительной биологической эффективности. Бета-излучение состоит из электронов, что делает его очень отличается от γ-излучения высокой энергии фотонов. Из-за этой разницы, Β-излучение представляет основном внутреннюю опасность для здоровья и может производить различные биологические эффекты по сравнению с γ-излучения. Это осложнение привело к значительным споры по поводу регулирования воздействия β-излучения, испускаемого НТО. Таким образом, нормативные уровни НТО в питьевой воде для населения варьируется от 100 Бк / л в Европе 75 000 Бк / л в Австралии. Поэтому, важно, чтобы сравнить биологические эффекты НТО в эквивалентных дозах γ-излучения. Во-вторых, скорость ДНК DSB измеряется в изолированных спленоцитов после завершения хронического облучения с помощью immunofluorescently помечены γH2AX обнаружитьред с помощью проточной цитометрии. Это позволяет оценить степень повреждения ДНК, нанесенные в естественных воздействий. Тем не менее, это разумно ожидать, что такие риски низкого уровня не может производить какие-либо обнаруживаемых ставки ДНК DSB; вместо этого, некоторые скрытые изменения / ответы можно ожидать, что будет влиять на способность клеток к репарации повреждений ДНК. Эти изменения, если он найден, может быть либо стимулирующий (производить благоприятное воздействие) или ингибирующее (производство вредное воздействие). Предложенный протокол позволяет выявить такие изменения, бросая вызов извлеченные спленоцитов с высокой дозой радиации, который производит значительное количество повреждений (например, 2 Гр производству примерно 50 ДНК DSB на ячейку или 3 -. Увеличение 5 раза в общей уровне γH2AX) , Впоследствии, формирование и потеря γH2AX, отражающие начала и завершения ремонта DSB, контролируется с помощью проточной цитометрии. Таким образом, не только базальную и вызванных лечением уровни ДНК DSB могут быть измерены, ноТакже его потенциальный эффект от способности клеток реагировать и ремонта повреждений ДНК, вызванных гораздо более высоких уровнях стрессорных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры обработки и переработки мыши должны придерживаться правил, установленных законодательной и / или ухода за животными программ и утвержденных местного комитета по уходу за животными. Все методы, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными с одобрения местного комитета по уходу за животными.

ВНИМАНИЕ: Все работы с радиоактивностью (в том числе, но не ограничиваясь обращения трития, внешнего γ-облучения, обращения с радиоактивными тканей животных, постельные принадлежности отходы) должны придерживаться правил, установленных законодательной и / или радиационной защиты властями и осуществляется уполномоченным персонал в сертифицированной лаборатории и / или объекте.

1. Животное работы

  1. Животное Группировка
    1. Если мышей, которые прибывают из внешней организации, акклиматизироваться животных, по крайней мере 10 дней на объекте животных. Если исследование включает в себя несколько групп лечения, убедитесь, что поставщиком животное может отправить Альл животные, как одной партии.
    2. Произвольно выделяют мышей лечения групп по 10 мышей в группе. При использовании самцов мышей штамма C57BL / 6, у поставщика животных предварительно договориться рандомизации очень молодых C57BL / 6 мужчин в их учреждении, чтобы смягчить проблемы агрессии.
  2. Хроническое воздействие на мышей внутреннего β-излучения
    1. Подготовка рабочих концентраций трития (10 кБк / л и 1 МБк / л) в питьевой воде мыши путем разбавления исходный запас НТО и ОСТ (смесь меченного тритием пролина, аланина и глицина аминокислоты) растворов.
    2. Подтвердить конечные концентрации трития в питьевой воде с помощью измерения радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Регулировка концентрации, если это необходимо.
    3. Лечить животных в течение одного месяца, предоставляя доступ вволю на трития воды. Если обработка воды понижается в течение двух недель, добавьте больше воды. В противном случае, изменить бутылки в две недели.
    4. Лечить ложно облученных управлениямышей одинаково. Храните их в отдельный "чистый" комнате или на отдельном "чистой" стойку под положительным давлением воздуха, чтобы избежать трития перекрестного загрязнения из воздуха.
  3. Хроническое воздействие мышей к внешним γ-излучения
    Примечание: γ-облучения объект / оборудование будет варьироваться в зависимости от местоположения.
  4. Использование доступные методы дозиметрии, определить расстояния от источника γ-излучения, которые имеют поля излучения, производящие необходимые мощности дозы. Убедитесь, однородность поля излучения в областях, охватывающих клетки животных.
    Примечание: 1,7 мкГр / ч эквивалентен мощности дозы, полученного на 1 МБк / л трития в организме.
  5. Expose мышей путем размещения клетки мыши на расстояниях, определяемых на стадии 1.3.1 в течение одного месяца. Минимизировать ежедневно прерывание γ-облучения 30 мин. Используйте Термолюминесценция дозиметры для измерения поглощенных доз всего.

2. Жертвы и отбора проб

  • Готовят стерильные хирургические инструменты, 60 мм чашки Петри с вставленными сита элемент 70 микрон, 15 мл и 1,5 мл пробирки, RPMI, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и места в пределах кабинете биологической безопасности. Обеспечение стерильности работы имеет решающее значение.
  • Разлить по 5 мл RPMI СМИ в каждой 60 мм чашке Петри.
  • Жертвоприношение мышей, используя метод одобренный местным комитетом по уходу за животными. Шейки дислокации хороший выбор для спленоцитов работы, описанной в этом протоколе. Тем не менее, если образцы крови для анализов других (например, для mFISH, в цитохалазин блока микроядер или других общих анализов genetoxicity) требуется, используйте внутри сердечной пункции после наркоза изофлураном.
  • Поместите животное в спинной лежачее положение, с головой, указывая от вас. Спрей мышь вниз с 70% этанола. Использование щипцов, возьмите кожу вперед, чтобы отверстие мочеиспускательного канала и сделать небольшой разрез с ножницами в области промежности.
  • С этого разреза, разрезать вдоль вентральной срединной линии в грудной полости, будьте осторожны, чтобы только сократить кожу, а не мышечную стенку внизу. Рассеките кожу от средней линии.
  • Возьмитесь брюшной стенки с пинцетом и разрезать вдоль срединной оси мышечной стенки, чтобы открыть брюшную полость.
  • Акцизный селезенки, слегка сжимая его стерильным пинцетом и аккуратно потянув за него и одновременно срезая соединительной ткани с помощью ножниц.
  • Вырезать небольшой кусок селезенки (приблизительно 1/10 селезенки) и место в 1,5 мл трубки. Привязка заморозить в жидком азоте для последующего хранения при -80 ° С в течение дополнительных анализов.
  • Поместите остаток селезенки в клеточный фильтр внутри 60 мм чашки Петри с 5 мл предварительно распределяют сред RPMI.
  • Переходите к следующему мыши.
    Примечание: Выдержки селезенки могут быть сохранены в 60 мм блюд со СМИ (до 2 часов), а остальные мышей sacrificредактор В зависимости от числа людей, участвующих, от 5 до 15 мышей могут быть обработаны в течение одного дня.

    • 3. Подготовка спленоцитов

    1. Перемешать селезенки путем измельчения внутри ячейки фильтра с стерильных щипцов с загнутым концом.
    2. Удалить клеточный фильтр и собирают отфильтрованный клеточной суспензии из 60 мм чашку в 15 мл пробирку.
    3. Промыть клеточный фильтр с 5 мл среды для сбора остаток клеток.
    4. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Слить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 10 мл RPMI.
    6. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Декантировать супернатант и повторно приостанавливать осадок в 5 мл среды RPMI.
    8. Передача 4 мл клеточной суспензии в культуральной колбы емкостью 25 мл ткани и удалить его в СО 2 инкубатор (37 ° C, 5% CO 2, 80% влажность)

    4. Оспаривание облучения и крепления

    1. ПеревестиОстальные 1 мл клеточной суспензии с шага 3.8 в 1,5 мл пробирку на льду и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Повреждение ДНК измеряли в этом образце будет представлять как лечение индуцированных повреждений и т = 0 точек данных для построения кривой репарации ДНК.
    2. Тщательно аспирата супернатант с помощью вакуумного насоса. Аккуратно повторно приостанавливать осадок в 1 мл TBS буфере (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl).
    3. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант с помощью вакуумного насоса. Аккуратно повторно приостанавливать осадок в 300 мкл TBS.
    4. При перемешивании на вихрь на низкой скорости, добавить 700 мкл -20 ° C 100% этанола. Закройте крышку и переверните несколько раз перемешать.
    5. Хранить образцы при -20 ° С. Спленоциты в этаноле фиксированные можно хранить при -20 ° С в течение не менее 12 месяцев без какой-либо заметной потери в сигнале γH2AX.
    6. Облучать спленоцитов с шага 3.8 со сложной γ-Rad тельная доза 2 Гр при мощности дозы ≥ 200 мГр / мин с использованием имеющихся облучения устройство.
      Примечание: Целью данного облучения, чтобы вызвать ДНК DSB оспорить ремонта машины. Рентгеновские лучи могут также быть использованы для этой цели.
    7. Сразу вернуть культур в СО 2 инкубаторе.
    8. 1 час после сложной 2 Гр облучения, удалить культур от инкубатора кабинете биологической безопасности. Чтобы собрать представительную пробу аликвоты, осторожно повторно приостанавливать клеток с использованием пипетки и перенос 1 мл клеточной суспензии в 1,5 мл пробирку на льду. Вернуться клеточные культуры в СО 2 инкубаторе.
    9. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант с помощью вакуумного насоса. Аккуратно повторно приостанавливать осадок в 1 мл TBS.
    10. Повторите шаги 4.3 - 4.5.
    11. 24 часов после сложной 2 Гр γ-облучения, урожая и исправить в = образца 24 часов, как описано в шаге 4.8 - 4.10.
    TLE "> 5. Иммунофлуоресцентное маркировка с анти-антитела γH2AX

    Примечание: Как правило, 15 - 30 проб в день, могут быть помечены immunofluorescently и анализировали с помощью проточной цитометрии в один проход. Для обеспечения точного сравнения между группами лечения, включают в себя образца (ов) из каждой группы. Смотрите также Справочное 16 для более подробной информации.

    1. Подготовка меченого набор труб для ряда образцов должны быть обработаны и место на льду. Используйте 12 х 75 мм колпачков стеклянных трубок. Стерильность не требуется для этой работы. Включите одну дополнительную историческую контрольный образец для маркировки с вторичным антителом только ("только 2 Аб"). Используйте этот исторический образец управления в каждом проточной цитометрии работать в исследовании.
    2. Добавить 0,5 мл ледяной TBS в каждую пробирку.
    3. Удалить фиксированные спленоцитов от -20 ° С, вихревой в течение 5 секунд и передачи Аликвоту 0,5 мл на подготовленные пробирки с TBS. Поместите оставшуюся часть образцов обратно в -20 ° C хранения идержать в качестве образца копирования.
    4. Центрифуга спленоцитов в 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл охлажденного льдом TBS, содержащим 1% FBS
    5. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл буфера TST (0,05% Тритон Х-100, 2% FBS в TBS). Инкубируют в течение 20 мин на льду.
    6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 200 мкл первичного анти-γH2AX антителом, разведенным 1: 150 в буфере TST. Используйте 200 мкл TST для "2-й Ab только" контрольного образца.
    7. Позиция трубки на вращающемся шейкере при угле 45 - 60 ° и встряхивают в течение 1,5 ч при 300 мкг при комнатной температуре.
    8. В то время как трубы инкубации, подготовить достаточный объем (200 мкл / образец) из козьего анти-мышиного вторичного антитела, конъюгированного с Alexa-488 в разведении 1: 200 в буфере TST.
      Примечание: Все работы, связанные Alexa-488сопряженный антитела (шаги 5.10 до 5.16 ниже) должно быть сделано в условиях тусклом свете и меченые образцы должны быть защищены от света, обернув пробирки алюминиевой фольгой.
    9. После инкубации 1,5 часа закончено, добавляют 1 мл охлажденного льдом TBS, содержащем 2% FBS в каждую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл TBS, содержащим 2% FBS.
    10. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 200 мкл раствора вторичного антитела с шагом 5,8.
    11. Инкубируйте образцы на дрожащей платформы в течение 1 часа, как в шаге 5.7.
    12. Добавить 1 мл ледяной TBS, содержащем 1% FBS.
    13. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл охлажденного льдом TBS.
    14. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 0,5 мл TBS, содержащим 50 мкг / млпропидиума йодида.
    15. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре в защищенном от света.
    16. Анализ образцов на цитометра с использованием инструментов конкретных протоколов 16. Прочитаны по меньшей мере 10000 клеток на образец.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Рисунок 2 показывает примеры графики проточной цитометрии ожидаемые для спленоцитов получают, используя способ, описанный здесь. Клетки сначала воротами на основе <электронный Объем стороне разброса> диаграммы рассеяния (рис 2А и 2D; электронный объем эквивалентен рассеяния вперед). FL3 / пропидия йода гистограммы (рис 2B и 2E) подтверждают нормальное распределение клеточного цикла. Среднее сигнал γH2AX, рассчитанный с использован...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Протокол, представленные в этой статье, является полезным для проведения масштабного мышь в естественных условиях исследований, посвященных Генотоксического эффекты низких уровней различных химических и физических агентов, в том числе ионизирующего излучения. Наш уникальный конкретного патогена животного объект оснащен GammaBeam 150 облучателя и 30-метровый зал облучения позволяет проводить пожизненные исследования с участием низкой или очень низкой мощности дозы облучений на сотни или даже тысячи мышей. Меньши...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы заявляют, что конкурирующих финансовых интересов не существует.

    Благодарности

    Авторы хотели бы выразить признательность нашим коллегам Сандрин Рош-Лефевр и Эрику Грегуару из Института радиозащиты и ядерной безопасности (Париж, Франция). Эта работа была поддержана Программой правительства Канады по науке и технике в Канадских ядерных лабораториях (Чалк-Ривер, Онтарио, Канада), Группой владельцев CANDU (Торонто, Онтарио, Канада), Канадской комиссией по ядерной безопасности и Институтом радиозащиты и ядерной безопасности (Париж, Франция).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    HTO: тритиевая вода, [3H]местно полученная из ядерного реактора;активность исходного материала 3,7 GBq/mL;  может быть заменена на HTO из Perkin Elmer
    OBT: Alanine, L-[3-3H]: органически связанный тритий (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 мКи/мл (185 МБк)
    OBT: глицин, [2-3H]: органически связанный тритийPerkin ElmerNET004005MC1 мКи/мл (185 МБк)
    ОБТ: пролин, L-[2,3-3H]: органически связанный тритий (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 мКи/мл (185 МБк)
    тритированная вода, [3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCзаменитель HTO местного происхождения   
    Облучатель GammaBeam 150Atomic Energy of Canada Limitedместного производстваможет быть заменен другим источником g-излучения достаточно низкой активности;
    Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
    RPMIFisher ScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 с L-глютамином и HEPES 500 мл
    фетальной бычьей сывороткиSigma AldrichF1051-100ML
    антитела против gH2AX, клон JBW301Millipore05-636
    Alexa fluor-488 козье антитело против мышиLife Technologies (ранее Invitrogen)A21121
    пропидий йодSigma AldrichP4864-10ML1 мг/мл
    этанолКоммерческие спиртыP006-EAAN500 мл флаконы Абсолютный этанол
    1,5 мл пробиркиFisher Scientific2682550микроцентрифуги
    15 мл пробиркиFisher Scientific05-539-5стерильные полипропиленовые центрифуги
    жидкий азотLindeP110403
    12 x 75 мм незакрытые стеклянные пробиркиFisher ScientificK60B1496126одноразовые боросиликатные стеклянные пробирки с гладким концом
    T25 колбыVWRCA15708-120nunc tisue culture 25 мл колба (артикул No 156340)
    ножницыFine Science Tools14068-12Вагнер ножницы 12 см острые/острые
    щипцы, прямыеFine Science Tools11008-13Щипцы Semken 13 см, прямые
    щипцы, изогнутыеFine Science Tools11003-12Узкие щипцы 12 см, изогнутые
    чашки Петри 60 ммVWRCA25382-100BD Чашка для культуры тканей Falcon 60 x 15 мм
    клеточные фильтры, 70 ммFisher Scientific08-771-2Клеточные фильтры Falcon 50/кейс
    Рецепт PBS: 1 таблетку растворить в 200 мл деионизированной воды, при необходимости отрегулировать pH до 7,4.Sigma AldrichP4417-100TABФосфатные буферные солевые таблетки
    TBS рецепт: для приготовления 10x бульон
    30 г TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGТризма гидрохлорид
    88 г NaClFisher ScientificS271-500Хлорид натрия
    2 г KClFisher ScientificP217-500Хлорид
    калияРастворите в 1 л деионизированной воды, отрегулируйте pH до 7,4

    Ссылки

    1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
    2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
    3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
    4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
    5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
    6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
    7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
    8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
    9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
    10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
    11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
    12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
    13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
    14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
    15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
    16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
    17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
    18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
    19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
    20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
    21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
    22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    Восстановление повреждений ДНКпроточная цитометриягамма-H2AXнизкие дозы радиациидвухцепочечные разрывырадиационное воздействиеиммунофлуоресцентное мечениеизоляция клеток
    Измерение повреждения и восстановления ДНК в мышиных спленоцитах После Хронический
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.