Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение повреждения и восстановления ДНК в мышиных спленоцитах После Хронический Published: July 3, 2015 doi: 10.3791/52912
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

Abstract

Низкая доза облучения радиации может производить различные биологические эффекты, которые отличаются по количеству и качеству от эффектов, вызываемых высокими дозами радиации. Обращаясь вопросы, связанные с безопасностью окружающей среды, охраны труда и здравоохранения в правильной и научно обоснованного образом в значительной степени зависит от способности точно измерять биологические эффекты малых доз загрязняющих веществ, таких как ионизирующее излучение и химические вещества. Повреждения и репарации ДНК являются наиболее важными первые признаки рисков для здоровья из-за их потенциальных последствий долгосрочных, таких как рак. Здесь мы опишем протокол для изучения влияния хронический естественных воздействия низких доз γ- и β-излучения на повреждения ДНК и ремонт в мышиных клеток селезенки. Использование общепринятого маркер ДНК двунитевых разрывов, фосфорилируется гистонов Н2АХ называется γH2AX мы покажем, как он может быть использован для оценки не только уровни повреждения ДНК, но также изменяетв ремонт мощностью ДНК потенциально производится низкой дозе облучения в естественных условиях. Проточная цитометрия позволяет быстро, точно и надежно измерить immunofluorescently меченого γH2AX в большом количестве образцов. ДНК двухцепочечной ремонта разрыв может быть оценена путем воздействия извлеченные спленоцитов к радикальной дозы 2 Гр для получения достаточного количества разрывов ДНК, чтобы вызвать восстановление, а путем измерения индуцированного (1 ч после облучения) и остаточный повреждение ДНК (24 часов после облучения). Остаточная повреждение ДНК будет свидетельствовать о неполном ремонта и риск долгосрочного геномной нестабильности и рака. В сочетании с другими анализами и конечных точек, которые могут быть легко измерены в например в естественных условиях исследования (например, хромосомные аберрации, микроядра частот в ретикулоцитов костного мозга, экспрессии генов и т.п.), этот подход позволяет точно и контекстную оценку биологических эффектов стрессоров низком уровне.

Introduction

Значительное Споры о возможном вредном воздействии низкой или очень низких дозах ионизирующего излучения и страх общественности излучения, что обусловлено изображений атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки и редких аварий атомных станций (усугубляется массовой информации), привело к очень строгое регулирование радиационной защиты и стандарты, которые потенциально не научно обоснованным. В течение последних трех десятилетий, многочисленные доклады документально как отсутствие вредных и наличие потенциально полезных биологических эффектов, вызванных низкой дозой излучения 1-4. Основным фактором риска радиационного здоровье вероятность рака, по оценкам на основе эпидемиологических исследований переживших атомные бомбы, получающих высокие или средние дозы радиации. Линейной экстраполяции этих данных (так называемых не-линейное нет порога или LNT модель) используется для оценки рисков рака при низких дозах. Тем не менее, этот подход не получил мировую научную принятиеи сильно обсуждается 5.

Очевидно, что больше исследования необходимы, чтобы прояснить этот вопрос и, возможно, улучшить стандарты радиационной защиты. Такие исследования должны включать хронические процедуры (наилучшее приближение экологических и профессиональных рисков), в естественных условиях на животных моделях (лучше для экстраполяции эффектов к человеку) и такие конечные точки, как уровень повреждений ДНК, ремонт ДНК и мутагенеза. Известно, что ДНК основной мишенью для повреждения радиационных эффектов и неполным или неправильно ремонт может привести к мутагенеза и рака развития 6.

ДНК двухцепочечной разрывы (DSB) являются одним из самых вредных видов повреждений ДНК и может привести к гибели клеток и онкогенеза 7. Поэтому, важно, чтобы иметь возможность надежно и точно измерить уровень DSB после воздействия малых доз радиации и / или других факторов стресса, таких как химических загрязнителей. Одним из наиболее чувствительных и специфических маркеровДНК DSB фосфорилируется гистонов Н2АХ, называется γH2AX 8, пока другие маркеры и методы были предложены 9,10. Считается, что тысячи молекул H2AX, в непосредственной близости от индуцированного DSB, которые участвуют в формировании благоприятной γH2AX обнаружение индивидуального DSB по иммунофлуоресцентного маркировки с антителом и флуоресцентной микроскопии анти-γH2AX 11. Ответ очень быстро, достигая максимума между 30 и 60 мин. Существуют доказательства того, что γH2AX облегчает ремонт ДНК DSB путем привлечения других факторов ремонт на сайты разрывов и изменения структуры хроматина, чтобы закрепить концы сломанной ДНК и обеспечить доступ для других белков ремонт (рассмотренных в 12). После завершения ремонта ДНК DSB, γH2AX получает де-фосфорилируется и / или подвергается деградации, и вновь синтезированные молекулы H2AX заменить γH2AX в пострадавших районах хроматина 10. Формирование и потери γH2AX Мониторинг может,Поэтому, обеспечивают точную оценку ДНК DSB ремонт кинетики. Этот подход был использован для изучения ремонт DSB в различных линий опухолевых клеток человека, облученных высокими дозами радиации и ее скорости и остаточных уровней DSB, как было показано, коррелирует с радиочувствительности 13-15.

Мы изменили эту экспериментальный подход и применять его в естественных условиях в исследовании мыши, чтобы изучить влияние малых доз хронического γ- и β-облучения на уровнях и ремонта (рис 1) ДНК DSB. Во-первых, мы продемонстрировать способ для выполнения долгосрочного Хроническое воздействие мышей с β-излучение, испускаемое либо тритий (водород-3) в виде тритием воды (НТО), либо как органически связанный тритий (ОСТ), растворенного в питьевой воде , Эти две формы, как ожидается, накапливать и / или распространение по-разному в организме и, следовательно, производить различные биологические эффекты. Обе формы потенциальные опасности в ядерной промышленности. Это лечениеидет параллельно с хроническим воздействием γ-излучения при эквивалентной дозы, чтобы правильно сравнение двух типов излучения, которая имеет решающее значение для оценки их относительной биологической эффективности. Бета-излучение состоит из электронов, что делает его очень отличается от γ-излучения высокой энергии фотонов. Из-за этой разницы, Β-излучение представляет основном внутреннюю опасность для здоровья и может производить различные биологические эффекты по сравнению с γ-излучения. Это осложнение привело к значительным споры по поводу регулирования воздействия β-излучения, испускаемого НТО. Таким образом, нормативные уровни НТО в питьевой воде для населения варьируется от 100 Бк / л в Европе 75 000 Бк / л в Австралии. Поэтому, важно, чтобы сравнить биологические эффекты НТО в эквивалентных дозах γ-излучения. Во-вторых, скорость ДНК DSB измеряется в изолированных спленоцитов после завершения хронического облучения с помощью immunofluorescently помечены γH2AX обнаружитьред с помощью проточной цитометрии. Это позволяет оценить степень повреждения ДНК, нанесенные в естественных воздействий. Тем не менее, это разумно ожидать, что такие риски низкого уровня не может производить какие-либо обнаруживаемых ставки ДНК DSB; вместо этого, некоторые скрытые изменения / ответы можно ожидать, что будет влиять на способность клеток к репарации повреждений ДНК. Эти изменения, если он найден, может быть либо стимулирующий (производить благоприятное воздействие) или ингибирующее (производство вредное воздействие). Предложенный протокол позволяет выявить такие изменения, бросая вызов извлеченные спленоцитов с высокой дозой радиации, который производит значительное количество повреждений (например, 2 Гр производству примерно 50 ДНК DSB на ячейку или 3 -. Увеличение 5 раза в общей уровне γH2AX) , Впоследствии, формирование и потеря γH2AX, отражающие начала и завершения ремонта DSB, контролируется с помощью проточной цитометрии. Таким образом, не только базальную и вызванных лечением уровни ДНК DSB могут быть измерены, ноТакже его потенциальный эффект от способности клеток реагировать и ремонта повреждений ДНК, вызванных гораздо более высоких уровнях стрессорных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры обработки и переработки мыши должны придерживаться правил, установленных законодательной и / или ухода за животными программ и утвержденных местного комитета по уходу за животными. Все методы, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными с одобрения местного комитета по уходу за животными.

ВНИМАНИЕ: Все работы с радиоактивностью (в том числе, но не ограничиваясь обращения трития, внешнего γ-облучения, обращения с радиоактивными тканей животных, постельные принадлежности отходы) должны придерживаться правил, установленных законодательной и / или радиационной защиты властями и осуществляется уполномоченным персонал в сертифицированной лаборатории и / или объекте.

1. Животное работы

  1. Животное Группировка
    1. Если мышей, которые прибывают из внешней организации, акклиматизироваться животных, по крайней мере 10 дней на объекте животных. Если исследование включает в себя несколько групп лечения, убедитесь, что поставщиком животное может отправить Альл животные, как одной партии.
    2. Произвольно выделяют мышей лечения групп по 10 мышей в группе. При использовании самцов мышей штамма C57BL / 6, у поставщика животных предварительно договориться рандомизации очень молодых C57BL / 6 мужчин в их учреждении, чтобы смягчить проблемы агрессии.
  2. Хроническое воздействие на мышей внутреннего β-излучения
    1. Подготовка рабочих концентраций трития (10 кБк / л и 1 МБк / л) в питьевой воде мыши путем разбавления исходный запас НТО и ОСТ (смесь меченного тритием пролина, аланина и глицина аминокислоты) растворов.
    2. Подтвердить конечные концентрации трития в питьевой воде с помощью измерения радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Регулировка концентрации, если это необходимо.
    3. Лечить животных в течение одного месяца, предоставляя доступ вволю на трития воды. Если обработка воды понижается в течение двух недель, добавьте больше воды. В противном случае, изменить бутылки в две недели.
    4. Лечить ложно облученных управлениямышей одинаково. Храните их в отдельный "чистый" комнате или на отдельном "чистой" стойку под положительным давлением воздуха, чтобы избежать трития перекрестного загрязнения из воздуха.
  3. Хроническое воздействие мышей к внешним γ-излучения
    Примечание: γ-облучения объект / оборудование будет варьироваться в зависимости от местоположения.
  4. Использование доступные методы дозиметрии, определить расстояния от источника γ-излучения, которые имеют поля излучения, производящие необходимые мощности дозы. Убедитесь, однородность поля излучения в областях, охватывающих клетки животных.
    Примечание: 1,7 мкГр / ч эквивалентен мощности дозы, полученного на 1 МБк / л трития в организме.
  5. Expose мышей путем размещения клетки мыши на расстояниях, определяемых на стадии 1.3.1 в течение одного месяца. Минимизировать ежедневно прерывание γ-облучения 30 мин. Используйте Термолюминесценция дозиметры для измерения поглощенных доз всего.

2. Жертвы и отбора проб

Готовят стерильные хирургические инструменты, 60 мм чашки Петри с вставленными сита элемент 70 микрон, 15 мл и 1,5 мл пробирки, RPMI, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и места в пределах кабинете биологической безопасности. Обеспечение стерильности работы имеет решающее значение.
  • Разлить по 5 мл RPMI СМИ в каждой 60 мм чашке Петри.
  • Жертвоприношение мышей, используя метод одобренный местным комитетом по уходу за животными. Шейки дислокации хороший выбор для спленоцитов работы, описанной в этом протоколе. Тем не менее, если образцы крови для анализов других (например, для mFISH, в цитохалазин блока микроядер или других общих анализов genetoxicity) требуется, используйте внутри сердечной пункции после наркоза изофлураном.
  • Поместите животное в спинной лежачее положение, с головой, указывая от вас. Спрей мышь вниз с 70% этанола. Использование щипцов, возьмите кожу вперед, чтобы отверстие мочеиспускательного канала и сделать небольшой разрез с ножницами в области промежности. С этого разреза, разрезать вдоль вентральной срединной линии в грудной полости, будьте осторожны, чтобы только сократить кожу, а не мышечную стенку внизу. Рассеките кожу от средней линии.
  • Возьмитесь брюшной стенки с пинцетом и разрезать вдоль срединной оси мышечной стенки, чтобы открыть брюшную полость.
  • Акцизный селезенки, слегка сжимая его стерильным пинцетом и аккуратно потянув за него и одновременно срезая соединительной ткани с помощью ножниц.
  • Вырезать небольшой кусок селезенки (приблизительно 1/10 селезенки) и место в 1,5 мл трубки. Привязка заморозить в жидком азоте для последующего хранения при -80 ° С в течение дополнительных анализов.
  • Поместите остаток селезенки в клеточный фильтр внутри 60 мм чашки Петри с 5 мл предварительно распределяют сред RPMI.
  • Переходите к следующему мыши.
    Примечание: Выдержки селезенки могут быть сохранены в 60 мм блюд со СМИ (до 2 часов), а остальные мышей sacrificредактор В зависимости от числа людей, участвующих, от 5 до 15 мышей могут быть обработаны в течение одного дня.

    • 3. Подготовка спленоцитов

    1. Перемешать селезенки путем измельчения внутри ячейки фильтра с стерильных щипцов с загнутым концом.
    2. Удалить клеточный фильтр и собирают отфильтрованный клеточной суспензии из 60 мм чашку в 15 мл пробирку.
    3. Промыть клеточный фильтр с 5 мл среды для сбора остаток клеток.
    4. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Слить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 10 мл RPMI.
    6. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Декантировать супернатант и повторно приостанавливать осадок в 5 мл среды RPMI.
    8. Передача 4 мл клеточной суспензии в культуральной колбы емкостью 25 мл ткани и удалить его в СО 2 инкубатор (37 ° C, 5% CO 2, 80% влажность)

    4. Оспаривание облучения и крепления

    1. ПеревестиОстальные 1 мл клеточной суспензии с шага 3.8 в 1,5 мл пробирку на льду и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Повреждение ДНК измеряли в этом образце будет представлять как лечение индуцированных повреждений и т = 0 точек данных для построения кривой репарации ДНК.
    2. Тщательно аспирата супернатант с помощью вакуумного насоса. Аккуратно повторно приостанавливать осадок в 1 мл TBS буфере (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl).
    3. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант с помощью вакуумного насоса. Аккуратно повторно приостанавливать осадок в 300 мкл TBS.
    4. При перемешивании на вихрь на низкой скорости, добавить 700 мкл -20 ° C 100% этанола. Закройте крышку и переверните несколько раз перемешать.
    5. Хранить образцы при -20 ° С. Спленоциты в этаноле фиксированные можно хранить при -20 ° С в течение не менее 12 месяцев без какой-либо заметной потери в сигнале γH2AX.
    6. Облучать спленоцитов с шага 3.8 со сложной γ-Rad тельная доза 2 Гр при мощности дозы ≥ 200 мГр / мин с использованием имеющихся облучения устройство.
      Примечание: Целью данного облучения, чтобы вызвать ДНК DSB оспорить ремонта машины. Рентгеновские лучи могут также быть использованы для этой цели.
    7. Сразу вернуть культур в СО 2 инкубаторе.
    8. 1 час после сложной 2 Гр облучения, удалить культур от инкубатора кабинете биологической безопасности. Чтобы собрать представительную пробу аликвоты, осторожно повторно приостанавливать клеток с использованием пипетки и перенос 1 мл клеточной суспензии в 1,5 мл пробирку на льду. Вернуться клеточные культуры в СО 2 инкубаторе.
    9. Центрифуга трубки на 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант с помощью вакуумного насоса. Аккуратно повторно приостанавливать осадок в 1 мл TBS.
    10. Повторите шаги 4.3 - 4.5.
    11. 24 часов после сложной 2 Гр γ-облучения, урожая и исправить в = образца 24 часов, как описано в шаге 4.8 - 4.10.
    TLE "> 5. Иммунофлуоресцентное маркировка с анти-антитела γH2AX

    Примечание: Как правило, 15 - 30 проб в день, могут быть помечены immunofluorescently и анализировали с помощью проточной цитометрии в один проход. Для обеспечения точного сравнения между группами лечения, включают в себя образца (ов) из каждой группы. Смотрите также Справочное 16 для более подробной информации.

    1. Подготовка меченого набор труб для ряда образцов должны быть обработаны и место на льду. Используйте 12 х 75 мм колпачков стеклянных трубок. Стерильность не требуется для этой работы. Включите одну дополнительную историческую контрольный образец для маркировки с вторичным антителом только ("только 2 Аб"). Используйте этот исторический образец управления в каждом проточной цитометрии работать в исследовании.
    2. Добавить 0,5 мл ледяной TBS в каждую пробирку.
    3. Удалить фиксированные спленоцитов от -20 ° С, вихревой в течение 5 секунд и передачи Аликвоту 0,5 мл на подготовленные пробирки с TBS. Поместите оставшуюся часть образцов обратно в -20 ° C хранения идержать в качестве образца копирования.
    4. Центрифуга спленоцитов в 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл охлажденного льдом TBS, содержащим 1% FBS
    5. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл буфера TST (0,05% Тритон Х-100, 2% FBS в TBS). Инкубируют в течение 20 мин на льду.
    6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 200 мкл первичного анти-γH2AX антителом, разведенным 1: 150 в буфере TST. Используйте 200 мкл TST для "2-й Ab только" контрольного образца.
    7. Позиция трубки на вращающемся шейкере при угле 45 - 60 ° и встряхивают в течение 1,5 ч при 300 мкг при комнатной температуре.
    8. В то время как трубы инкубации, подготовить достаточный объем (200 мкл / образец) из козьего анти-мышиного вторичного антитела, конъюгированного с Alexa-488 в разведении 1: 200 в буфере TST.
      Примечание: Все работы, связанные Alexa-488сопряженный антитела (шаги 5.10 до 5.16 ниже) должно быть сделано в условиях тусклом свете и меченые образцы должны быть защищены от света, обернув пробирки алюминиевой фольгой.
    9. После инкубации 1,5 часа закончено, добавляют 1 мл охлажденного льдом TBS, содержащем 2% FBS в каждую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл TBS, содержащим 2% FBS.
    10. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 200 мкл раствора вторичного антитела с шагом 5,8.
    11. Инкубируйте образцы на дрожащей платформы в течение 1 часа, как в шаге 5.7.
    12. Добавить 1 мл ледяной TBS, содержащем 1% FBS.
    13. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 1 мл охлажденного льдом TBS.
    14. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Декантировать супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок в 0,5 мл TBS, содержащим 50 мкг / млпропидиума йодида.
    15. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре в защищенном от света.
    16. Анализ образцов на цитометра с использованием инструментов конкретных протоколов 16. Прочитаны по меньшей мере 10000 клеток на образец.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Рисунок 2 показывает примеры графики проточной цитометрии ожидаемые для спленоцитов получают, используя способ, описанный здесь. Клетки сначала воротами на основе <электронный Объем стороне разброса> диаграммы рассеяния (рис 2А и 2D; электронный объем эквивалентен рассеяния вперед). FL3 / пропидия йода гистограммы (рис 2B и 2E) подтверждают нормальное распределение клеточного цикла. Среднее сигнал γH2AX, рассчитанный с использованием канала FL1 подтверждает увеличение> 2-кратное ДНК DSB в 2-Гр облученных клеток (рис 2F) по сравнению с необработанным контролем (фиг.2с). Далее, мы исследовали чувствительность описываемого метода измерения immunofluorescently помечены γH2AX цитометрическим в спленоцитов мыши. 3А показывает уровни γH2AX, свидетельствует о ДНК DSB, в спленоцитов мыши 1 ч после воздействия экс естественных условиях к низкой либо (0.1Гр) или высокие (2 Гр) доз γ-излучения по отношению к необработанным контролем. Видно, что 0,1 Гр вызывало небольшое увеличение уровня DSB и увеличение было статистически значимым. Сильный индукции 3 раза, как ожидается, и обнаруживается после воздействия Гр 2. Для проверки специфичности γH2AX иммунофлуоресцентного маркировки, как описано в протоколе, меченые клетки исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа. Заметное очаги, как образец наблюдали указывает, что сигнал флуоресценции происходит от индивидуальной ДНК DSB в хроматина (фиг.3В).

    Представитель результаты оценки ДНК DSB скорости и их ремонта в спленоцитов мышей, подвергнутых в течение одного месяца с очень низкие концентрации тритием воды (10 кБк / л) представлены на рисунке 4. Видно (рис 4А), что, хотя Лечение привело к 10% увеличению базального уровня γH2AX, изменение не былот статистически значимым (N = 5, один образец Т-критерий Стьюдента). Кроме того, измеренное формирование и потери γH2AX после сложной 2 Гр облучения, представляющий кинетики репарации ДНК DSB, не отличалась между клетками с контролем и ХТО-обработанных мышей (фиг.4В).

    Фигура 1
    Рисунок 1. Экспериментальный схема для оценки эффекта хронического облучения в естественных условиях на повреждение ДНК и репарацию ДНК. После в естественных лечения мышей с хроническим облучением в течение желаемого периода времени, мышей забивали и спленоцитов установлены и подвергается сложной облучение. Спленоцитов аликвоты собирали и фиксировали в различные моменты времени после радикальной дозы. Уровни γH2AX затем измеряется с помощью иммунофлуоресценции LAbeling и обнаружение с помощью проточной цитометрии. Участок на нижней части фигуры схематично ожидаемых данных. Гамма-Н2АХ уровень резко возрастает в ранние сроки после облучения сложной последующим снижением обратно в контрольной величины, если репарации ДНК является полным. Повреждение ДНК Δ представляет повреждения, возникающие в результате экспериментального лечения мышей и репарации ДНК Δ представляет собой эффект лечения мышей на ДР ДНК ремонта мощности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. Представитель проточной цитометрии исходных данных. (А, D) Scatter участки и стробирования регионы для спленоцитов и клеток мусора и эритроцитов. (В, Е) гистограммы распределения ДНК, представляющие клеточного цикла. (AC) были получены от представителя необработанных контрольных клеток селезенки, в то время как данные в наборах (D-F) были получены из клеток, облученных 2 Гр γ-излучения и собирали 1 час после облучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть крупная версия этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Обнаружение γ H2AX методом проточной цитометрии является чувствительным и специфичным. (А) спленоциты свежевыделенных из самцов мышей линии СВА облучали либо 0,1 или 2 Гр γ-излучения, или ложно обработанных и позволило разработать γH2AX реакцию в течение 1 ч. Клетки затем фиксировали, immunofluorescentlyпомечены анти-γH2AX антитела и проанализированы с помощью проточной цитометрии. Нормированные средние значения ± SD показаны (N = 12). * И *** означают статистическую разницу р <0,05 и р <0,001, с уважением (один образец Студенческая т -теста). (Б) Типичные микрофотографии необработанного контроля (UT) или 2 Гр облучают спленоцитов immunofluorescently меченные анти-γH2AX антитела. Очаги, как картина зеленой флуоресценции подтверждает специфичность иммунофлуоресцентного маркировке γH2AX. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Представитель результаты, показывающие отсутствие эффект от 1-месячного воздействия мышей к тритием водоснаг (ХТО) на уровне и ремонта ДР ДНК. (A) спленоциты выделяли из мышей, обработанных 10 кБк / л НТО в питьевой воде и контрольных животных. Уровень γH2AX была измерена с помощью иммунофлуоресценции маркировку и проточной цитометрии, как описано в протоколе. Среднее γH2AX уровни флуоресценции по отношению к тем из-под контроля ± SD показаны (N = 5). Эти данные были получены из т = 0 временной точке, которая была использована в 3В для оценки ремонта ДР ДНК. (B), изолированных спленоцитов подвергается сложной 2 Гр дозы γ-излучения и аликвоты клеток были зафиксированы на раз т = 0, 1 и 24 ч после облучения сложной. Средняя флуоресценции γH2AX по отношению к собственной т = 0 контроль показан ± SD (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Протокол, представленные в этой статье, является полезным для проведения масштабного мышь в естественных условиях исследований, посвященных Генотоксического эффекты низких уровней различных химических и физических агентов, в том числе ионизирующего излучения. Наш уникальный конкретного патогена животного объект оснащен GammaBeam 150 облучателя и 30-метровый зал облучения позволяет проводить пожизненные исследования с участием низкой или очень низкой мощности дозы облучений на сотни или даже тысячи мышей. Меньшие облучения средства для хронического малых доз облучения может быть создана в университете или в больничной среде, где радиобиологии исследования, проведенного в плановом порядке и принципы радиационной защиты / Правилах. Тем не менее, строгие правила обычно применяются для объектов, предназначенных для внутреннего облучения животных, где обращение радионуклидов, таких как тритий, осуществляется. Хотя и редко, лаборатории, сертифицированные для таких внутренних исследований радиационного воздействия существуют в различных реПоиск учреждения во всем мире и их уникальные возможности можно использовать для исследований, описанных в этом протоколе.

    В протоколе, мы используем Иммунофлуоресцентной маркировку γH2AX точно оценить ДНК DSB цены произведенные экспериментальных воздействий. Уровень более важно, введение сложных облучения доставлен экс естественных извлеченным спленоцитов позволяет оценить интактность ответ ДР ДНК (уровень γH2AX на 1 час после вызова) и ДНК DSB ремонта (γH2AX на 24 часов по сравнению с 0 ч). Следует отметить, что количественное определение γH2AX очагов на клетку с помощью флуоресцентной микроскопии может обеспечить более высокую чувствительность по сравнению с проточной цитометрии. Например, дозы цене 0,001 Гр сообщалось производить значительное увеличение числа очагов γH2AX на клетку. Тем не менее, использование проточной цитометрии на основе обнаружения γH2AX обеспечивает преимущества по сравнению с флуоресцентной микроскопии анализа BECAиспользовать его требуется меньше времени для измерений, не требует узкоспециализированных / обученный персонал и это позволяет избежать субъективного принятия решений, связанных с γH2AX очаги признание и растёт. Эти преимущества являются критически важными для крупномасштабных исследований на животных. Типичный животных эксперимент с 10 группами лечения и 10 мышей в группе приведет к 100 образцов х 3 = 300 селезенки, если предложенный метод (рисунок 1) следует. Чтобы получить данные из этого числа образцов, приблизительно 100 ч будет необходимо с помощью проточной цитометрии. Кроме того, если сделано вручную микроскопических анализов, та же задача займет не менее 300 часов, при консервативной оценке 40 мин высоко требовательных время микроскопа на образец. Хотя попытки автоматизировать анализ и озвучивание γH2AX очагов были сделаны 17-19, все они имеют ряд ограничений. В частности, круглая форма и малый размер спленоцитов мыши и лимфоцитов делает нецелесообразным разрешить все экзidual γH2AX очаги под микроскопом. В то время как прилипшие клетки были успешно забил автоматизированных систем микроскопии для γH2AX очагов, успеха не было продемонстрировано ни для спленоцитов мыши или лимфоцитов.

    Лучший способ, чтобы устранить дня в день изменчивость измеренных значений сигнала γH2AX методом проточной цитометрии, чтобы включить группу и контроля экспериментальных образцов в то же перспективе и для расчета относительных изменений γH2AX в каждом периоде. Дополнительные рекомендации включают в себя: а) историческая управления, состоящий из необработанной и 2 Гр облучают образец используется в каждом счете; б) один человек выполняет все процедуры маркировки антител; в) один запас буферов и одной партии антитела, как первичных, так и вторичных, используется для всей совокупности образцов в одном эксперименте. Это также очень важно, чтобы выполнить поток цитометра теста контроля качества изготовителя прибора рекомендуется рутинное и до каждого запуска образцов. Это REQuired проверить оптическое выравнивание и струйной системы прибора, а также помогает минимизировать дня в день изменения в измеряемой γH2AX флуоресценции между образцами для сравнения или объединены в одну группу.

    Следует отметить, что использование большего количества временных точках (например, 1, 2, 4, 6 часов) Сообщение сложной облучение может помочь проанализировать и измерить краткосрочных репарации ДНК DSB кинетику более подробно 16. Тем не менее, общий потенциал ремонт и вероятность отдаленных последствий для здоровья будет представлен остаточной повреждения измеряется только в 24 часов, а по сравнению с той, которая наблюдается в начальной точке времени (т = 0) 13-15 (рисунок 4).

    Так базальные уровни γH2AX, как известно, увеличение старых животных или стареющих клеток 20, для более точной интерпретации результатов, полученных в долгосрочных исследованиях на мышах воздействие (> 6 месяцев), используя, тыс описанного способаИспользование электронной молодой необработанной группе, в дополнение к контролю, сходных по возрасту, было бы желательно. Хотя некоторые сообщения показывают, что γH2AX может увеличиться в пролиферирующих клетках, которые не будут связаны с ДНК DSB, это может быть легко контролируется путем измерения S-фазы и G2 / M-фазе клеточного фракции с использованием гистограммы ДНК (Фигура 2А, D). Если некоторые экспериментальные условия все еще ​​мешают исследователю использовать γH2AX в качестве маркера повреждения ДНК (по причинам, изложенным выше, или их комбинации), другим белком формирования ДНК повреждения очагов, таких как 53BP1, могут быть использованы 21.

    Хотя мы и не пытались с помощью этого метода для не-лимфоидных тканях, таких как мышцы, сердце, мозг и другие, казалось бы, трудно обрабатывать их для проточной цитометрии. Тканевые разделы и микроскопии для подсчета очагов γH2AX будет методом выбора, если анализ таких тканей не требуется. Тем не менее, другие лимфоидные клетки, такие как периферической крови лymphocytes, лимфоциты костного мозга или тимоцитов, может быть использован для измерения уровня γH2AX описанным способом. Преимущество использования лимфоциты селезенки является относительная простота подготовки суспензии клеток и большого количества клеток, которые могут быть выделены из селезенки. Это становится еще более предпочтительно, если дополнительные конечные точки включали в исследование. По нашему опыту, типичный выход спленоцитов мыши на позволяет собирать не менее 10 аликвотных частей, каждая подходит для любой из следующих анализов: проточная цитометрия, РТ-КПЦР для гена или экспрессии микроРНК, вестерн-блот, геномную ДНК CpG метилирование Анализ. Таким образом, дополнительные аликвоты спленоцитов, собранных в параллель к таковым для конечной точки γH2AX может быть использован для измерения экспрессии генов, участвующих в повреждения ДНК сигнализации и ремонт ответов. Такие гены, как GADD45A и CDKN1A, которые обычно транскрипционно вверх регулируется в ответ цитотоксических лечения 22, может дать ключ, чтобы подогретьее клетки должным образом реагировать на сложные влияния стресса. Аналогичным образом, уровень белка и пост-трансляционной модификации, участвующие в реакции на стресс может быть оценена. Наконец, не ожидается, что любой из стадий процедуры экстракции, если проводили, как описано здесь, может вызвать γH2AX спленоцитов.

    Было бы полезно и очень рекомендуется попробовать дополнительные органы и ткани во время жертвоприношений в дополнение к повреждению и ремонт данных ДНК, полученные для селезенки, как в представленном протоколе с другими конечными точками. Например, мы регулярно собираем клетки костного мозга для в естественных условиях костного мозга микроядра анализа, различные ткани для стареющих связаны β-галактозидазы и измерений экспрессии генов репарации ДНК. Способность собирать другие ткани будет зависеть от имеющейся технической поддержки в течение жертвоприношений; Однако, это может значительно помочь в правильной интерпретации результатов и строительства муч биологически более актуальны системные картина ответ на лечение низкого уровня расследуется.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    HTO: tritiated water, [3H] locally obtained from a nuclear reactor  stock activity 3.7 GBq/mL;  can be substituted with HTO from Perkin Elmer
    OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) Perkin Elmer NET348005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium Perkin Elmer NET004005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) Perkin Elmer NET323005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    tritiated water, [3H] (HTO) Perkin Elmer NET001B005MC substitute for HTO of local origin  
    GammaBeam 150 irradiator Atomic Energy of Canada Limited locally manufactured can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity 
    Tween-20 Sigma Aldrich P1379-500ML
    RPMI Fisher Scientific SH3025501 Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL
    fetal bovine serum Sigma Aldrich F1051-100ML
    anti-gH2AX antibody, clone JBW301 Millipore 05-636
    Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody Life Technologies (formerly Invitrogen) A21121
    propidium iodine Sigma Aldrich P4864-10ML 1 mg/ml
    ethanol Commercial Alcohols P006-EAAN 500 ml bottles Absolute Ethanol
    1.5 ml tubes Fisher Scientific 2682550 microcentrifuge tubes
    15 ml tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile polypropylene centrifuge tubes
    liquid nitrogen Linde P110403
    12 x 75 mm uncapped glass tubes Fisher Scientific K60B1496126 disposable borosilicate glass tubes with plain end
    T25 flasks VWR CA15708-120 nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)
    scissors Fine Science Tools 14068-12 Wagner scissors 12 cm sharp/sharp
    forceps, straight Fine Science Tools 11008-13 Semken forceps 13 cm, straight
    forceps, curved Fine Science Tools 11003-12 Narrow Pattern forceps 12 cm, curved
    60 mm petri dishes VWR CA25382-100 BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm
    cell strainers, 70 mm Fisher Scientific 08-771-2 Falcon cell strainers 50/case
    PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. Sigma Aldrich P4417-100TAB Phosphate Buffered Saline Tablets
    TBS recipe: to make 10x stock
    30 g TRIS HCl Sigma Aldrich T3253-1KG Trizma hydrochloride
    88 g NaCl Fisher Scientific S271-500 Sodium Chloride
    2 g KCl Fisher Scientific P217-500 Potassium Chloride
    Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
    2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
    3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
    4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
    5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
    6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
    7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
    8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
    9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
    10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
    11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
    12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
    13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
    14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
    15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
    16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
    17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
    18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
    19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
    20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
    21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
    22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

    Tags

    Молекулярная биология выпуск 101 повреждение ДНК ДНК двухцепочечную перерывы ремонт ДНК γ-Н2АХ низкая доза радиации тритий β - излучения γ-излучения хроническое воздействие проточной цитометрии, Модель мыши
    Измерение повреждения и восстановления ДНК в мышиных спленоцитах После Хронический<em&gt; В Vivo</em&gt; Воздействие Очень низкие дозы бета- и гамма-излучения
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Flegal, M., Blimkie, M. S., Wyatt,… More

    Flegal, M., Blimkie, M. S., Wyatt, H., Bugden, M., Surette, J., Klokov, D. Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation. J. Vis. Exp. (101), e52912, doi:10.3791/52912 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter