Summary
Shuttle-box vermijdingsleren is goed opgericht in behavioral neurowetenschappen. Dit protocol beschrijft hoe shuttle-learning in knaagdieren kan worden gecombineerd met locatie-specifieke elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) en gelijktijdige chronische in vivo opnames als een instrument om meerdere aspecten van leren en perceptie bestuderen.
Abstract
Shuttle-box vermijden leren is een gevestigde methode in gedrags-neurowetenschappen en experimentele opstellingen waren van oudsher op maat; de nodige apparatuur is nu beschikbaar door diverse commerciële bedrijven. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van een twee-weg shuttle-box vermijden leren in knaagdieren (hier Mongoolse gerbils; Meriones unguiculatus) in combinatie met locatie-specifieke elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) en gelijktijdig chronisch elektrofysiologische in vivo opnames. De gedetailleerde protocol is van toepassing op verschillende aspecten van het leergedrag en perceptie in verschillende soorten knaagdieren bestuderen.
Plaatsspecifieke ICMS auditieve corticale circuits geconditioneerde stimuli hier wordt gebruikt als een instrument om het perceptuele belang van specifieke afferente, efferente en intracorticale verbindingen te testen. Distinct activeringspatronen kan worden opgewekt door verschillende stimulatie-elektrode arrays voor lokale, laag-afhankelijke ICMS of verre ICMS sites. Gebruik makend behavioral signaaldetectie analyse kan worden bepaald welke stimulatiestrategie het meest effectief voor het opwekken van een gedragsmatig detecteerbaar en opvallende signaal. Verder parallel multichannel-opnamen met verschillende elektrode-ontwerpen (oppervlakte-elektroden, diepte-elektroden, enz.) Zorgen voor het onderzoeken van neuronale van de zichtbaarheid in het tijdsverloop van dergelijke leerprocessen. Het zal worden besproken hoe veranderingen van het ontwerp van de cognitieve gedragstherapie complexiteit kunnen verhogen (bv detectie, discriminatie, reversal learning).
Introduction
Een fundamentele doelstelling van behavioral neurowetenschappen is om specifieke verbindingen tussen neuronale structurele en functionele eigenschappen, leren en waarneming vast te stellen. Neurale activiteit in verband met de perceptie en leren kan worden bestudeerd door elektrofysiologische opname van actiepotentialen en lokale veld potentieel in verschillende hersenstructuren op meerdere plaatsen. 3 - terwijl elektrofysiologische opnames bieden correlatieve associaties tussen neurale activiteit en gedrag, heeft directe elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) voor meer dan een eeuw de meest directe methode voor het testen van causale relaties van opgewonden populaties van neuronen en hun gedrag en perceptuele effecten 1 geweest. Vele studies hebben aangetoond dat dieren kunnen maken van verschillende ruimtelijke en temporele eigenschappen van elektrische stimuli perceptuele taken naargelang de stimulatie plaats binnen bijvoorbeeld retinotopische 4, vooreerstonotopic 5 of somatotopic 6 regio's in de cortex. Voortplanting van elektrisch opgewekte activiteit in de cortex wordt voornamelijk bepaald door de indeling van axonale vezels en hun gedistribueerd synaptische connectiviteit 2 dat in cortex, duidelijk layer-afhankelijke 7. De resulterende polysynaptic activering opgeroepen door ICMS is voortaan veel meer wijdverspreid dan de directe effecten van het elektrisch veld 2,8,9. Dit verklaart waarom de drempels van perceptuele effecten opgewekt door intracorticale microstimulatie sterk layer-afhankelijke 8,10,11 en locatie-afhankelijke 9 kan zijn. Een recente studie toonde in detail dat de stimulatie van de bovenste lagen leverde meer wijdverbreide activering van corticocortical circuits in voornamelijk supragranular lagen, terwijl het stimuleren van de diepere lagen van de cortex resulteren in een brandpunt, terugkerende corticoefferent intracolumnar activering. Parallelle gedragsexperimenten bleek dat de laatste heeft veel lagere perceptuele detectie THResholds 8. Daarom is het gebruik van plaatsspecifieke ICMS als geconditioneerde stimuli werd in combinatie met elektrofysiologische opnames benut causaal verband specifieke corticale circuit activeringen 8 tot gedragsmaten leren en waarneming in de shuttle-box.
De twee-weg shuttle-box paradigma is een gevestigde laboratoriumapparatuur te vermijden leren 12 te bestuderen. Een shuttle-box bestaat uit 2 compartimenten gescheiden door een hindernis of deuropening. Een geconditioneerde stimulus (CS), die wordt vertegenwoordigd door een geschikte signaal als een licht of geluid, is voorwaardelijk gevolgd door een aversieve ongeconditioneerde stimulus (US), zoals bijvoorbeeld een voet schok over een metalen roostervloer. Onderwerpen kunnen leren de Amerikaanse vermijden door shuttling van een shuttle-box compartiment naar het andere in reactie op het CS. Shuttle-box learning omvat een reeks van onderscheiden leerfasen 13,14: Ten eerste,onderwerpen leren om de VS uit het CS te voorspellen door klassieke conditionering en om te ontsnappen aan de VS door instrumentale conditionering, de VS wordt beëindigd op pendelen. In een volgende fase, onderwerpen leren de Amerikaanse helemaal te vermijden door shuttling reactie op de CS bij Amerikaanse aanzet (vermijding reactie). In het algemeen, shuttle-box leren impliceert klassieke conditionering, instrumentale conditionering, evenals doelgericht gedrag afhankelijk leerfase 14.
De shuttle-box procedure kan worden ingesteld eenvoudig en over het algemeen produceert robuust gedrag na een paar dagelijkse trainingen 15-17. Naast eenvoudige vermijding conditionering (detectie), kan de shuttle-box verder worden gebruikt voor discriminatie stimulus bestuderen door gebruik go / nogo paradigma. Hier worden dieren getraind om de VS door een geconditioneerde respons (CR) (ga gedrag; shuttle in tegenovergestelde compartiment) voorkomen in reactie op een <strong> go-stimulus (CS +) en Nogo gedrag (verblijf in de huidige compartiment, geen CR) in reactie op een Nogo-stimulus (CS) Parallelle microstimulatie en registratie van neurale activiteit high-density Multielectrode laten bestuderen. de fysiologische mechanismen die ten grondslag liggen succesvol leren. Diverse technische details die van fundamenteel belang voor de succesvolle combinaties van shuttle-box training ICMS en parallelle elektrofysiologie zijn, zullen worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten die in dit werk werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die door de Duitse wet voor de bescherming van proefdieren. Experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de deelstaat Saksen-Anhalt.
1. Maatwerk Multichannel elektrode arrays voor microstimulatie en opnemen
- Custom-made microstimulatie scala
- Voor het leveren van ICMS, bereiden stimulatie elektroden in de gewenste ruimtelijke inrichting (hier laterale serie van 2 kanalen) met 3 cm lange Teflon geïsoleerde roestvrij staaldraad (Ø met isolatie = 50 pm). Zie figuur 2.
- Krimp ene uiteinde van de draden met een mannelijke pen systeem (1,25 mm spoed).
- Voor een 2-kanaals array met ~ 0,5 mm of ~ 0,7 mm elektrode afstand pas draden loodrecht via twee verticaal uitgelijnde elektronenmicroscopie object-houder grids (afstand van roosters ~ 5 mm) leiden van de draden (0,1654 mm pitch).
- Gebracht mannelijke pennen in de stekerbehuizing.
- Doe de elektrode in een schotel met elektrolytische oplossing (bijvoorbeeld 0,9% natriumchloride) en meet de impedantie van elk kanaal met een respectievelijk impedantiemeetelektrode (bijv., FHC impedantie Conditioning Module). Richt op impedanties in de 100 tot 500 kOhm bereik.
- Als de impedantie te hoog is, leveren korte elektrische stroom (1 sec, 1 mA) door de kanalen om deze te verlagen. Controleer impedantie weer.
- Custom-made multichannel opname arrays hoge resolutie
Let op: Dit protocol beschrijft de productie van oppervlakte-arrays voor het opnemen electrocorticogram (ECoG) gegevens. Toch kunnen ontwerpen worden afgestemd op de eisen van de desbetreffende vraagstelling (diepte opnames, etc.) voldoen. Multichannel arrays hoge resolutie zijn built by-Teflon geïsoleerde roestvrij staaldraad (Ø met isolatie = 50 pm) gekrompen met een mannelijke pin-systeem (1,25 mm pitch).- Voor oppervlakte-elektrode arrays, begeleiden 18 draden door een matrix van twee voorbereide elektronenmicroscopie object-houder grids 3 x 6.
- Insluiten de 6 x 3 rangschikking van de draden tussen de roosters met tandheelkundige acryl en zet pinnen in de stekker behuizing.
- Maal de tandheelkundige acryl in een rechthoekig blok met behulp van molen gehecht aan een hand gehouden boor.
- Controleer dat de impedantie van alle kanalen (zie 1.1.6) is in het gebied tussen 100-500 kOhm.
- Vóór implantatie (zie stap 2) grind oppervlak van de arrays aan de convexiteit van de corticale oppervlak passen.
2. Chirurgische Implantatie van Arrays in de auditieve cortex in verdoofde Mongoolse Herbils voor chronische Usage
- Houd de officiële goedkeuring van alle nodige experimentele stappen die zijn gepland uit te voeren. Slijtage voorkomendgeval beschermende kleding (jas, steriele handschoenen, chirurgisch masker, kap).
- Gebruik volwassen mannelijke Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus) of enige andere knaagdieren. Draag beschermende handschoenen en een jas en altijd gebruik gesteriliseerd en goed geïdentificeerde chirurgische instrumenten.
- Bij woestijnratten, verdoven dieren met ip injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) verdund in 0,9% steriele natriumchlorideoplossing. Handhaaf door infusie van 0,6 ml / uur / kg van een mengsel van ketamine componeren: xylazine: natriumchloride (0,9%) in een verhouding van 9: 1: 10.
- Plaats dier op een verwarmingsplaat voor het handhaven lichaamstemperatuur bij 37 ° C met een rectale sonde feedbacksysteem (bijv World Precision Instruments).
- Scheren bont die interoccipital, pariëtale en temporale botten. Aseptisch bereiden de incisie site met een effectieve desinfectiemiddel (bijv., Afwisselende Betadine of Nolvasan en 70% alcohol scrubs 3 keer). Protect ogen tegen uitdroging door oogzalf.
- Snijd de craniale huid die de interoccipital, pariëtale en frontale botten met behulp van een scalpel en verwijder beenvlies door voorzichtig het verplaatsen van een boor over het bot oppervlak.
- Boor kleine gaatjes in de contralaterale pariëtale en frontale bot lateraal mogelijk niet belemmeren later hoofd te monteren. Schroef twee botschroeven met een diameter van ongeveer 1 mm stevig in de openingen. Controleer of de pariëtale schroef goed contact met de dura, als het wordt gebruikt als een gemeenschappelijke referentie en de grond, alsmede retourelektrode voor elektrostimulatie later.
- Lijm een kleine aluminium bar mediaal over de voorhoofdsbeenderen en gebruik het als hoofd fixatie tijdens de implantatie van een headholder.
- Verwijder het vel over de Musculus temporalis aan de ene kant met een schaar.
- Snijd het dorsale gedeelte van de temporale spier om toelating tot de temporale bot te verkrijgen.
- Expose auditieve cortex door craniotomy (~ 3 mm x 4 mm) vanhet temporale bot met behulp van een tandartsboor. Bepaal de locatie van auditieve cortex basis van de typische signatuur bloed-hersen-vat 18,19.
- Zorgvuldig maakt een incisie van de dura met een micro scalpel op de plaats waar de stimulatie-elektrode wordt geïmplanteerd in de hersenen. Beweeg langs het oppervlak tot aan de dura scheuren om schade aan de onderliggende neuropil verbieden.
- Plaats stimulatie scala micromanipulator onder controle. Kies een tangentiële inbrenghoek om de epidurale matrix in het gebied van belang worden geplaatst. Afhankelijk van de invoeging hoek en de positie en de beoogde plaats van stimulatie, zorgvuldig de insteekdiepte.
- Plaats de epidurale oppervlak opname array met goed contact aan de hersenen oppervlaktebedekking het gebied van belang (hier auditieve cortex) van een tweede micromanipulator. Zorg ervoor dat de matrix overeenkomt met de kromming van de cortex naar de dura niet inspringen.
- Fixeren zowel elektrode arrays en hun plugbehuizingen met tandheelkundige acryl aan de schedel.
- Cover blootgesteld corticale oppervlak met een antiseptische smeermiddel (bijv, KY-Jelly) en dicht craniotomie met tandheelkundige acryl (bijv Paladur Heraeus Ulzer). Houd in gedachten dat de polymerisatie warmte kan produceren. Gebruik voldoende glijmiddel tussen neuropil en tandheelkundige acryl om elk contact van de tandheelkundige acryl en de corticale oppervlak te voorkomen, want dit kan weefselschade veroorzaken.
- Nu laat de dieren herstellen voordat het begin van elke verdere procedure. Hersteltijden kunnen verschillen tussen soorten (bijvoorbeeld, gerbils: ≥3 dagen, muizen: ≥7 dagen). Bewaak zorgvuldig de toestand van het dier en geeft pijnstillende behandeling in de volgende dagen indien van toepassing (bijv Meloxicam; 1 mg / kg postsurgical en 24 uur na de operatie).
3. Twee richtingen Shuttle-box ontwerpen met behulp van ICMS als geconditioneerde stimulus
- Shuttle-box training
- Plaats een shuttle-box (cangepaste-build of een commercieel product, bijvoorbeeld, E10-E15, Coulbourn Instruments) in een akoestisch en elektrisch afgeschermde ruimte. De doos bevat twee compartimenten gescheiden door een hindernis. Denk aan de hoogte van de hindernis als het van invloed op de gedragsmatige vooringenomenheid van go-responsen. Gebruik de juiste hoogte voor specifieke soorten (bijvoorbeeld ~ 2 cm voor muizen, ~ 3 cm voor gerbils).
- Aan de voet-shock (VS) van toepassing, gebruik dan een roostervloer met een afstand tussen de tralies voor de soort geschikte in onderzoek 12,15. Neem altijd de zorg dat er niets elektrisch snelkoppelingen van de afzonderlijke staven (ontlasting, haren, elektrode room).
- Na een aanzienlijke hersteltijd van het dier (zie 2.17), sluit het onderwerp aan de opname en stimulatie kabel bij voorkeur zonder gebruik van een korte termijn anesthesie. Proberen om het dier met een handdoek bedekken en voorzichtig neemt het dier in handen. Onthullen het hoofd en de aansluitingen van het dier met de andere hand en sluit de kabels. Sta dieren wennen aan de training kamer voor 3 min voor aanvang van elke sessie.
- Per training (1-2 per dag) van toepassing tussen 30-90 trials. Gebruik proef duur van maximaal 15 sec, en inter-proces intervallen die willekeurig variëren tussen 25 - 30 sec.
- Voor het leveren ICMS voor geconditioneerde stimulatie van de stimulatie-elektroden gebruiken een meerkanaals stimulator (bijvoorbeeld MCS STG2000). Om gedragseffecten verkrijgen zonder schade aan het hersenweefsel, pulsreeksen (bijvoorbeeld 300 ms lengte, 100 pps) van tweefasige, lading evenwichtig pulsen (kathodische eerst) toe te passen met een 200 microseconden faseduur. Herhaal treinen met een pauze van 700 ms voor een duur van 4 seconden (kijkvenster).
- Voor de presentatie van auditieve CS gebruik van een analoge uitgang PCI-kaart (bv NI PCI-6733). Programmeren van deze apparaten met Matlab flexibel beheersen en hardware-leiden van de shuttle-box systeem via de digitale uitgang lijnen.
- Route de analoge uitgang signaal naar the shuttle-box luidsprekers via een audio versterker.
- Voorwaardelijk leveren de voet-shock VS door een roostervloer. Voor optimale elektrofysiologische opnamekwaliteit, het genereren van de schok door een tweede high-end multichannel stimulator (MCS STG2000).
- Om de opleiding detectie alleen aanwezig CS + stimuli toe te passen. Hier presenteren blanco proeven zonder CS en de US afgewisseld tussen de test trials (~ 10%) te corrigeren voor partijdige shuttle gedrag (zie 3.2). Voor een meer veeleisende taak, train dieren om onderscheid te maken tussen CS + en CS-stimuli gepresenteerd in dezelfde sessie in willekeurige volgorde.
- Classificeren een compartiment verandering na de CS + ontstaan binnen een kritiek moment raam van 4 sec (CR) als een hit reactie. In CS + proeven zonder CR in de kritische tijdvenster (miss), direct leveren een milde voet schok voor 6 tot 10 seconden als ongeconditioneerde stimulus (US).
Opmerking: herhaalde CS + stimulatie die overlapt met de VS zal het leren inspanning voor de dieren een vermindering vannd verbeteren leren snelheid en prestaties ('delay' versus 'trace' conditioning, zie bespreking). - Voor CS-trials, classificeren een compartiment verandering binnen de kritische tijdvenster als vals alarm reactie, en toepassing van de VS voor maximaal 10 seconden direct na dit ongepast CR. Ons niet toe te passen na CS wanneer het dier blijft in de ruimte (geen CR) tijdens de kritieke tijdvenster, en classificeren van deze studie als juist afwijzing.
Let op: Belangrijk is dat de voet shock VS wordt altijd uitgeschakeld, wanneer de dieren verandert compartiment in reactie daarop (escape). Met meer kritische tijdvensters voor CS proeven, bijvoorbeeld wanneer geconditioneerde herhaalde stimulatie gebruikt, hoewel een meer conservatieve learning criterium wordt opgelegd zoals verschaft hogere inspanning van het dier naar CR remmen. - Voor een effectieve organisatie van CS en de VS aan te passen shock kracht in een matige reeks om aversieve maar niet pijnlijk. Optimale Initial huidige sterkte verschilt tussen soorten (bijvoorbeeld 50 uA voor muizen, 200 uA voor gerbils). Daarom, zie de volgende twee kogels voor verdere technische gegevens:
- Individueel de schok kracht aan te passen in de eerste training te beginnen met een milde amplitudes (~ 200 uA voor gerbils). Als voet shock kracht het te laag is, ontsnappen latency jitter en associatie tussen CS en de VS is niet optimaal.
- Altijd aandacht besteden als de dieren beginnen te vocalize en te bevriezen in reactie op de CS. In dit geval footshock kracht te hoog. Deze geconditioneerde angstreactie interfereert met vermijding leren.
- Bepalen zorgvuldig de ontsnapping latencies. Verhoog voetschok sterkte stap voor stap als escape latencies langer dan 2 seconden na de eerste 20 trials. Controleer na elke training als het dier onder shock controle, dat wil zeggen, het toont ontsnappen latencies aanzienlijk lager dan 2 sec.
Let op: Vermijd echter te voet te verhogenshock kracht te snel, als de gedrags-strategie van een zeer gestresst dier terug te kunnen vallen op pure ontsnappen reacties. Daarom nauw observeren van het gedrag, met name de reactietijden tijdens het instellen van de amplitude van de Verenigde Staten. Voor een voorbeeld zie figuur 3E. - Als het dier toont de CR, stoppen met de presentatie van de CS onmiddellijk. Dit is essentieel voor de versterking van het vermijden respons.
- Als dieren een vermijden strategie, dat wil zeggen hebben verworven, tonen de juiste CR alle CS, variëren parameters (ICMS amplitude, fase duur, de herhaling tarief etc.) om psychometrische analyses uit te voeren. Solliciteer parametrische CS variatie in een bloksgewijs mode met de Amerikaanse paren, die zal echter leren en aanpassing induceren.
- Om dit te voorkomen, te beginnen met 15 tot 30 proeven van de oorspronkelijke opleiding, en vervolgens willekeurig tussenwerpen CS variaties zonder VS als proef proeven tussen de reguliere training proeven met de originele CS's. Maximaal use 25% van testproeven.
- Na de training verwijder het dier uit de training kamer en zorgvuldig reinigen van de volledige doos voor de training van het volgende dier. Probeer te voorkomen dat het trainen van verschillende soorten tegelijk in hetzelfde vak, als hun natuurlijke geur kunnen interfereren met de opleiding prestaties.
- Analyse van de trainingsgegevens
- Nemen alle compartiment veranderingen in de gewenning fase.
- Registreert alle compartiment veranderingen tijdens de training en verdeel het in hits en valse alarmen, ontsnappen reacties (mist en terug shuttles na een vals alarm) en spontane intertrial shuttles (ITS).
- Bereken CR tarieven voor CS + en CS als volgt: hit tarieven = raakt / aantal CS + proeven; vals alarm tarieven = vals alarm / aantal CS-trials.
- Verkrijgen CR tarieven sessie-wise. Echter, het leren dynamiek beoordeelt een hogere temporele resolutie, bereken CR tarieven van korte blokken evenveel CS + en CS- trials (
- Perceel CR tarieven in functie van de sessie of proces blok voor de training vooruitgang en leren dynamiek evalueren.
- Voor kwantificering van de gedragsmatige gevoeligheid onafhankelijke experimentele omstandigheden voorspannen van de respons van het dier, afleiden d 'waarden gebaseerd op signaaldetectietheorie 8,9,17.
- Voor d 'analyse gebruik Z-scores van overeenkomstige hit en vals alarm tarieven (leren discriminatie) of hit tarieven en ITS (detectie-learning) is afgeleid van de inverse van een gestandaardiseerde normale verdeling functie en aftrekken van deze z-scores. Een drempelwaarde criterium stimulusdetectie van d '= 1,0, wat overeenkomt met een signaalsterkte van één standaarddeviatie boven de ruis. Zie figuur 3 als voorbeeld.
- Bovendien bepaalt CR-, allemaal reactietijden in reactie op verschillende CS door meting van de tijdsduur tussen CS onset en gedragsmatige respons (complete compartimentveranderen).
- Het verkrijgen van een meer gedetailleerde gedragsanalyse van video-opnamen van de shuttle-box gedrag. Bereiken temporale synchronisatie tussen video en opnamesystemen door het opnemen triggerpulsen van de shuttle-box of stimulatiesysteem van de audio spoor van de video. Video-analyse maakt het mogelijk om ezels aandacht en oriëntatie reacties van de dieren voorafgaand aan de CR.
4. In Vivo Elektrofysiologische technieken in Learning Dieren
- Elektrofysiologische opname tijdens de training
- Tijdens de training, nemen elektrofysiologische signalen (bijvoorbeeld met de beschreven ECoG-arrays) van meerdere elektroden monopolarly tegen de gemeenschappelijke referentie / massa-elektrode.
- Feed signalen van alle elektroden in een headstage versterker aangesloten hetzij direct of via een korte adapter in de kop connectors.
- Sluit de headstage de belangrijkste versterker via een harnas van dunne, flexibele kabels gewikkelddoor een metalen gaas te beschermen tegen beschadiging door dieren bijten.
Opmerking: Mechanische stress in de kabelboom kan worden verlicht door een veer verdere waardoor het vrije verkeer en de rotatie van het dier in de doos. Ideaal is het gebruik van een draaibare en gemotoriseerde draaibare. Echter, voor auditieve experimenten plaats de draaibare buiten de geluidsdichte kamer of het geluid af te schermen met schuim om de hoge frequentie auditieve geluid geproduceerd door de motor te verminderen. - Gebruik een voorversterker in de afgeschermde box stijgen signaal-ruisverhouding en banddoorlaatfilter van het signaal in het gewenste frequentiebereik.
- Sample data op meer dan 1 kHz bemonsteringsfrequentie (plaatselijke veldpotentiaal opnames) en ten minste 40 kHz (voor actiepotentiaal opnames) en opslaan in de PC voor offline analyse. Gebruik geschikte filter instellingen voor beide soorten (bv 2 - 300 Hz voor de lokale veld potentieel, 300 - 4000 Hz voor actiepotentialen).
- Controleer de kwaliteit van de opname zorgvuldig voor de start van tregent (geen geluid of beweging artefacten). Breng een online FFT-filter om het signaal met de amplitude van 50 Hz ruis te bepalen. Indien nodig double-check alle aansluitingen tussen de kop-connector, de adapters, de headstages, de kabelboom, en de versterkers.
- Voor reductie van artefacten in de geregistreerde data opgewekt door elektrische stimulatie gebruik een interpolatieprocedure alle gegevenspunten die door het artefact 1 ms voor tot ~ 5 ms na het begin van elke puls te reconstrueren. Hiervoor plaatst u nullen tussen de onaangetast datapunten, en een symmetrische FIR-filter dat de gemiddelde-kwadraat fouten tussen de geïnterpoleerde punten en hun ideale waarden (Matlab's interp.m functie) minimaliseert toepassing. Gelden deze procedure om het ruwe signaal, afzonderlijk op elk kanaal voor verdere analyse 9.
- Technische details van de parallelle shuttle-box training, ICMS, en de opname
- In het algemeen, ervoor te zorgen dat de dieren comfortabel in de doos omg voelenng. Laat het dier om vrij te bewegen en bereiken alle hoeken van de doos. Voldoende tijd om een dag gewennen vóór de eerste training (20 min) en vóór iedere zitting (3 min) gunstig.
- Na elke chirurgische behandeling, waarop het dier voldoende tijd om inclusief medicijnen herstellen indien nodig (zie boven 2,17) en begint om alleen de dieren leiden, indien dieren geen typische symptomen van lijdt of pijn (gesloten ogen, lethargisch fenotype, smerig fur tonen 20).
- Zorg voor een goede elektrische aarding van de roostervloer. Aardlussen tussen opnamesysteem, shuttle-box en het dier worden vermeden. Gemalen het dier alleen via de gemeenschappelijke grond elektrode, het verlaten van de roostervloer op een drijvend spanning.
- Sluit de multichannel stimulator (MCS STG2000) aan het hoofd connector van het geïmplanteerde stimulatie-elektrode-array via afzonderlijke lijnen van de gemotoriseerde draaibare.
- Gebruik de gemeenschappelijke massa-elektrode van de opname als de grond of terug elektrode voor de ICMS, als goed.
5. histologische analyse van de elektrode posities
- Na de volledige training set, de controle voor de stabiele positie van de stimulatie-elektrode-array door histologische analyse.
- Verdoven dieren met ip injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) verdund in 0,9% steriel natriumchloride. Breng vervolgens monopolaire kathodestroom (30 uA 60 sec) geleverd door alle stimulatiekanalen ijzer afzetting in het weefsel te verkrijgen op de plaats van implantatie 8.
- Naar aanleiding van deze procedure, offeren het dier door een geschikte en goedgekeurde methode van euthanasie (bv intraperitoneale injectie van een overdosis van pentobarbital, 100 mg / kg).
- Verwijder de hersenen van het dier onmiddellijk bevriezen in 2-methylbutaan afgekoeld tot -70 ° C in vloeibare stikstof.
- Knip nu het gebied van de rente op een cryostaat microtoom in 50 micrometer horizontal secties.
- Histologie: Nissl en "Pruisisch blauw" -staining
- Voor de identificatie van corticale lagen behandelen elke seconde slice met Nissl-kleuring. Ten eerste, baden schijfjes 5 min in 0,05 M natriumacetaat buffer (pH 4,0 -4,2).
- Baden plakken voor 5-10 min in 5% cresylviolet acetaat. Spoel plakjes met gedestilleerd water.
- Baden plakken voor 2 min achtereenvolgens in 0,05 M natriumacetaat buffer (pH 4,0 - 4,2) en in oplossingen van 50%, 70% en 90% ethanol, respectievelijk.
- Baden segmenten tweemaal in isopropanol: 96% ethanol (2: 1) gedurende 5 minuten elk.
- Tenslotte baden plakjes in Roticlear drie keer gedurende 5 min.
- Het verkrijgen van de locatie van de stimulatie kanalen door "Prussian Blue" -staining van elk ander stukje dat de ijzeren afzetting opgeroepen door lange monofasisch stromen na de experimenten zichtbaar maakt.
- Bereid een verse oplossing van 1% kalium hexacyanoferrat (II) trihydraat K 4[Fe (CN) 6] door het mengen van 2 g K 4 [Fe (CN) 6] in 200 ml van 1% HCl.
- Voeg 800 ml van 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4).
- Baden hersencoupes gedurende 10 minuten met gedistilleerd water en vervolgens gedurende 10 min in hexacyanoferrat oplossing.
- Baden segmenten tweemaal gedurende 10 min in 0,1 M fosfaatbuffer en uiteindelijk gedurende 5 min in gedestilleerd water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie geeft een representatief voorbeeld van de shuttle-box leren in een Mongoolse gerbil. De proefpersoon werd opgeleid discrimineren de ICMS plaats tussen twee stimulatie-elektroden geïmplanteerd 700 urn uit elkaar in auditieve cortex (figuren 1 en 2). Stimulatie arrays kunnen worden aangepast in verschillende ruimtelijke ontwerpen (figuur 1). Hier, discriminatie van de twee locaties ICMS werd geleerd binnen 3 trainingen met de presentatie van 30 CS + en CS elk (figuur 3A-C). Dit wordt aangegeven door een stabiele significant verschil van de CR tarieven van hit en vals alarm reacties gedurende 7 opeenvolgende trainingssessies (Figuur 3B). Dienovereenkomstig, d 'is> 1 in deze sessies (Figuur 3C). Snelle ontsnapping latencies naar de VS van fundamenteel belang zijn, omdat ze een effectieve aversieve ongeconditioneerde respons te geven. Dit kan door een aanpassing te voet shock kracht van 200 & worden gegarandeerd# 181; A in 50 uA stappen tot ontsnapping latencies zijn kort (zie figuur 3 E). Daarnaast elektrofysiologische opnames van een ECOG-matrix mogelijk maken de plaatsspecifieke spatiotemporele activeringspatronen oproept intracorticale elektrische CS + en CS- op stimulering plaatsen gescheiden door ~ 700 um (figuur 4) te evalueren.
Figuur 1. elektrodebundel ontwerpen. (A) Diepte array (2 x 1) voor intracorticale microstimulatie op twee verschillende locaties in cortex. Elektroden zijn aangebracht bij een interelektrode afstand van ~ 700 micrometer. Andere ruimtelijke ontwerpen kunnen zorgen voor een laag-afhankelijke lokale ICMS in verschillende corticale diepten of laterale arrays met stimulatie plaatsen langs een bepaalde as van corticale weefsel, zoals bijvoorbeeld de tonotopische verloop van de auditieve cortex 8. (B) epidurale Surface array (3 x 6) voor het opnemen van de electrocorticogram in hoge ruimtelijke resolutie. Elektroden zijn gemaakt van roestvrij staaldraad (Ø 256 pm) gerangschikt in een 3x6 matrix met een interelektrode afstand van ~ 600 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Positionering van geïmplanteerde stimulatie en registrerende elektroden. (A) Een paar van twee stimulatie elektroden (zie figuur 1A) S1 (donkergroen) en S2 (lichtgroen) worden geïmplanteerd in de diepte van de rechter primaire auditieve veld AI dicht bij de ingang lagen IV. Elektrode tips kunnen worden geplaatst langs de rostrocaudale as (caudale elektrode S1, rostral elektrode S2) met een interelektrode afstand van ~ 700 micrometer. De 3 x 6 ECoG opnamearray (600 urn interelektrode afstand) wordt epiduraal gecentreerd over de juiste AI. (B) Nissl-gekleurde horizontale doorsnede van de respectieve regio hersenen na experimentele procedure toont twee kleine laesies (pijlen), die werden veroorzaakt door de uiteinden van de twee geïmplanteerde stimulatie-elektroden met vermelding van hun locatie binnen temporale cortex. De positie kan verder worden beoordeeld door "Prussian Blue" kleuring. Dit cijfer is aangepast van Deliano et al., 2009. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Shuttle-box training data en analyse van een individueel dier. (A) Schema's op de rechter te beschrijven taak ontwerp voor CS + en CS-proeven in een twee-weg shuttle-box discriminatiop de taak en gedragsmatige uitkomsten. (B) Learning curves uitgezet als hit en vals alarm tarieven van individuele trainingen. Significante verschillen tussen hit en ongewenste alarmen worden gemarkeerd met een asterisk (Games Howell-test, p <0,05). (C) Gevoeligheid index d '> 1 (zie 3.2.7) kan worden gebruikt als drempelcriterium voor een succesvolle discriminatie. (D ) Monitoring van de spontane kruisingen in de gewenning fase vertonen over het algemeen een daling in sessies. (E) Response latencies tijdens CS + proeven worden uitgezet voor individuele proeven over alle trainingen. Alle responsen met latencies dan 6 sec overeen met succes hit reacties. Let op de langere ontsnapping latencies in de eerste helft van de eerste sessie. Na het verhogen gedaald tot minder dan 2 sec de voet schok kracht ontsnappen latencies na US begin aangeeft voldoende schok controle. Histogrammen (rechts inzet) van de reactietijden worden bimodal die overeenkomt met reacties (<6 sec) geraakt en ontsnappen reacties. (6-8 sec) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Parallel elektrofysiologische opname in een leren dier. (A) Typisch voorbeeld van een elektrisch evoked potential (EEP) van een enkel dier gemiddeld over CS + proeven in een enkele sessie van de opleiding. Gegevens werden opgenomen vanaf een ECOG-array. De figuur vergelijkt de EEP spoor vóór (zwart) en na (rood) het verwijderen van enkele puls stimulus artefacten. Details van artefact reductie zie paragraaf 4.1.7. De vroege prominente negatieve piek is te zien bij een vertraging van 20 ms (N20). (B) verdere analyse van de ruimtelijke verdeling van de N20 amplitude in reactie op een CS + bij tHij rostrale stimulatie-elektrode (boven) en een CS- aan het caudale stimulatie-elektrode (onder) tonen de ruimtelijke resolutie van opgewekte toestanden gedurende auditieve cortex. Anatomische richtingen ten opzichte van de opname matrix zijn aangegeven met pijlen (d, rug-, c, caudale, l, laterale, m, mediale, r, rostraal, v, ventrale). Dit cijfer is aangepast van Deliano et al., 2009. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode van simultane site-specific ICMS en multi-channel elektrofysiologische opnames in een leren dier met behulp van een twee-weg aversieve voet shock-gecontroleerde shuttle-box systeem. Het protocol legt de nadruk technische kernbegrippen voor deze combinatie en wijst op het belang van de aarding van de dieren alleen via de gemeenschappelijke grond elektrode, het verlaten van de roostervloer op een drijvend spanning. Hier werd auditief shuttle-box leren toegepast op Mongoolse gerbils als-learning gerelateerde plastic reorganisaties van de auditieve cortex in deze dieren hebben uitgebreid 8,12,14,15,21,22 bestudeerd. Niettemin kan de beschreven protocol worden aangepast met kleine wijzigingen in andere knaagdieren, zoals bijvoorbeeld muizen 16. In dit opzicht is het belangrijk om te overwegen soortspecifieke aanpassingen betreffende hersteltijd na de operatie (2,17), de hoogte van de hindernis (2.1.1) en aan schokgevoeligheid van individuele dieren, die kan worden higHLY variabele (3.1.3-3.1.6).
Het protocol geeft nadere uitleg over hoe maatwerk elektrode ontwerpen kunnen worden gebruikt om verschillende sites in corticale weefsel leidt tot verschillende netwerk activeringen zoals afgeleid uit de analyse van de gelijktijdige elektrofysiologische multielectrode opnames 8,23 stimuleren. Afhankelijk van de afstand tussen de elektroden kan men verschillende delen van bijvoorbeeld topografische kaarten 9 stimuleren. Door toepassing layer-afhankelijke ICMS is het mogelijk om verschillend te activeren lange afstand corticocortical projecties leidt tot meer verspreide activatie van cortex door stimulatie in corticale ingang lagen III-IV. In plaats daarvan stimulatie corticoefferent uitgang lagen V-VI leidde tot een veel focale activatie van intracorticale en corticothalamic feedback circuits 8. Bij gebruik stimulatie arrays met twee of meer stimulatieelektroden kunnen bipolair ICMS worden toegepast in plaats van monopolaire ICMS. Een bipolaire stimulatie-modus meereffectief rekruteert neuronale vezels parallel aan de elektrodetoppen, bij voorkeur in de richting van de kathodische paal tegen nonparallel vezels 24. Zo'n stimulatie configuratie dus verhoogt de richting specificiteit van de opgeroepen neurale netwerk activeringen 8. Deze bijzondere directe manipulaties van corticale sublaminar netwerkactiviteiten met ICMS 8,9, hebben tot nu toe niet aangetoond door een andere techniek 3. Als voorbeeld van de kracht van deze werkwijze, een recent rapport ontrafeld de bijdrage van cortico-thalamocorticale feedback circuits perceptie middels detectie leren van intracorticale elektrische stimuli 8. Dit toont aan dat de directe corticale microstimulatie is een effectieve en state-of-the-art methode om koppelingsactiviteit causaal in bepaalde neuronale circuits en gedrag 1,3,11,25. Via lokale elektrische stimulering van corticale gebieden die overeenkomen met specifieke topografische kaart kenmerken, zoals instAnce een tonotopische regio in de auditieve cortex, kunnen onderwerpen worden getraind in de overdracht leren paradigma te vergelijken eigenschappen van waarnemingen opgewekt door de centrale elektrische of perifere sensorische stimulatie. Dergelijke experimenten kunnen de ontwikkeling van stimulatiestrategieën sensorische corticale neuroprostheses 5,9 stimuleren. Dit protocol kan ook worden gebruikt in de elektrische stimulatie van andere hersengebieden, zoals bijvoorbeeld het ventrale tegmentale gebied, te belonen verwerking en neuronale onderbouwing van diepe hersenstimulatie 26 bestuderen. Kritiek voor effectieve microstimulatie verschillende technische gegevens die moeten worden onderzocht op de achtergrond van de individuele instelling en elektroden gebruikt. In het algemeen is de invloed van de stimulatie parameters, zoals de stimulatie amplitude, polariteit, elektrode oriëntatie, enz., Zijn beoordeeld 11,24. Van belang is de ladingsoverdracht van de elektrode. De impedantie van een elektrode is daarom een kritische factor. Vandaar, controleer dan of tHij impedantie van de elektrodecontacten in de kQ bereik voor implantatie.
Verscheidene bijkomende verschijnselen van leren kan worden bestudeerd door geschikte variatie in de beschreven basisontwerp. Zo kan onderscheid leren in tegenstelling tot eenvoudige detectie leren worden onderzocht door het inbrengen van ten minste twee stimuli die moeten worden verbonden met go en Nogo reacties, respectievelijk 14,15. Op dezelfde categorie vorming leren kan worden bestudeerd door het combineren van dergelijke discriminatie paradigma 12,21. Shuttle-box paradigma's kunnen ook worden gebruikt om het werkgeheugen, gedragsinhibitie en cognitieve flexibiliteit, zoals bijvoorbeeld nodig is voor succesvolle reversal learning 14,17 of stel verschuiven onderzocht. Werkgeheugen kan worden beoordeeld door het vergelijken van 'vertraging' en 'sporen' van airconditioning. In 'vertraging' conditionering 27, is de CS gedurende de kritische CS-Amerikaanse tijd venster weergegeven zonder vertraging tussen CS vanFStel en de VS ontstaan. In 'spoor' conditionering, daarentegen, is een vertraging van enkele seconden nadat de offset van voorbijgaande CS presentatie. In tegenstelling tot de 'vertraging' conditioning 'trace' conditioneren zet een hoge belasting op het werkgeheugen en corticale verwerking. De combinatie discriminerende shuttle-box leerparadigma de van spatiotemporele in de lopende electrocorticogram, is een geschikte methode om dynamische toestanden identificatie van auditieve cortex verband met de stimulus discriminatie 9 en categorie vorming van 21. Aangezien shuttle-box training klassiek gebruikt als bidirectionele vermijden taak algemene conceptuele problemen vermijdingsleren toepassen voor al deze behavioral design; namelijk dat succesvolle vermijdingsgedrag expliciet voorkomt het optreden van de stimulus die dient als bekrachtiger. Appetitive wapening, bijvoorbeeld door directe elektrische stimulatie van middenhersenen beloning circuits, slechts been toegepast op shuttle-learning in sommige studies 26. Ook is shuttle-box leren voornamelijk gebruikt bij knaagdieren en is zelden toegepast in grotere proefdieren, zoals bijvoorbeeld honden.
Behalve met elektrofysiologische analyse kan shuttle-box leren verder worden gecombineerd met farmacologische interventie 8,17, laesie technieken 15, microdialyse 28 of optogenetics. Vooral de combinatie van onze protocol met optogenetic hulpmiddelen, door virale infectie van het modelsysteem (dwz Mongoolse gerbils) of door genetisch gemodificeerde dieren, zoals muizen, zou kunnen stijgen name de cellulaire subtype specificiteit van kunstmatige neuronale activatie waaronder corticale inhibitie, die niet toegankelijk is met behulp van ICMS 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door subsidies van de Deustche Forschungsgemeinschaft DFG en het Leibniz-Instituut voor Neurobiologie. Wij danken Maria-Marina Zempeltzi en Kathrin Ohl voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
- Cohen, M. R., Newsome, W. T. What electrical microstimulation has revealed about the neural basis of cognition. Current Opinion in Neurobiology. 14 (2), 169-177 (2004).
- Histed, M. H., Bonin, V., Reid, R. C. Direct activation of sparse, distributed populations of cortical neurons by electrical microstimulation. Neuron. 63 (4), 508-522 (2009).
- Histed, M. H., Ni, A. M., Maunsell, J. H. R. Insights into cortical mechanisms of behavior from microstimulation experiments. Progress in Neurobiology. 103, 115-130 (2013).
- Bradley, D. C., et al. Visuotopic mapping through a multichannel stimulating implant in primate V1. Journal of Neurophysiology. 93, 1659-1670 (2005).
- Scheich, H., Breindl, A. An Animal Model of Auditory Cortex Prostheses. Audiology and Neurootology. 7 (3), 191-194 (2002).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinas, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- Douglas, R. J., Martin, K. A. C.
- Happel, M. F. K., Deliano, M., Handschuh, J., Ohl, F. W. Dopamine-modulated recurrent corticoefferent feedback in primary sensory cortex promotes detection of behaviorally relevant stimuli. The Journal of Neuroscience. 34 (4), 1234-1247 (2014).
- Deliano, M., Scheich, H., Ohl, F. W. Auditory cortical activity after intracortical microstimulation and its role for sensory processing and learning. The Journal of Neuroscience. 29 (50), 15898-15909 (2009).
- DeYoe, E. A., Lewine, J. D., Doty, R. W. Laminar variation in threshold for detection of electrical excitation of striate cortex by macaques. Journal of Neurophysiology. 94 (5), 3443-3450 (2005).
- Tehovnik, E. J., Slocum, W. M., Schiller, P. H. Delaying visually guided saccades by microstimulation of macaque V1: spatial properties of delay fields. The European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2635-2643 (2005).
- Wetzel, W., Wagner, T., Ohl, F. W., Scheich, H. Categorical discrimination of direction in frequency-modulated tones by Mongolian gerbils. Behavioural Brain Research. 91, 29-39 (1998).
- Cain, C. K., LeDoux, J. E. Escape from fear: a detailed behavioral analysis of two atypical responses reinforced by CS termination. Journal of Experimental Psychology. Animal behavior processes. 33, 451-463 (2007).
- Stark, H., Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H. Dynamics of cortical theta activity correlates with stages of auditory avoidance strategy formation in a shuttle-box. Neuroscience. 151, 467-475 (2008).
- Ohl, F. W., Wetzel, W., Wagner, T., Rech, A., Scheich, H. Bilateral ablation of auditory cortex in Mongolian gerbil affects discrimination of frequency modulated tones but not of pure tones. Learning & Memory. 6 (4), 347-362 (1999).
- Kurt, S., Ehret, G. Auditory discrimination learning and knowledge transfer in mice depends on task difficulty. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8481-8485 (2010).
- Happel, M. F. K., et al. Enhanced cognitive flexibility in reversal learning induced by removal of the extracellular matrix in auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2800-2805 (2014).
- Thomas, H., Tillein, J., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). I. Electrophysiological mapping of frequency representation and distinction of fields. The European journal of neuroscience. 5, 882-897 (1993).
- Budinger, E., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). III. Anatomical subdivisions and corticocortical connections. European Journal of Neuroscience. 12, 2425-2451 (2000).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Ohl, F. W., Scheich, H., Freeman, W. J. Change in pattern of ongoing cortical activity with auditory category learning. Nature. 412 (6848), 733-736 (2001).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hearing Research. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Happel, M. F. K., Jeschke, M., Ohl, F. W. Spectral integration in primary auditory cortex attributable to temporally precise convergence of thalamocortical and intracortical input. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11114-11127 (2010).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Research. 98, 417-440 (1975).
- Clark, K. L., Armstrong, K. M., Moore, T. Probing neural circuitry and function with electrical microstimulation. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 278 (1709), 1121-1130 (2011).
- Ilango, A., Shumake, J., Wetzel, W., Scheich, H., Ohl, F. W. Electrical stimulation of lateral habenula during learning: frequency-dependent effects on acquisition but not retrieval of a two-way active avoidance response. PloS one. 8 (6), e65684 (2013).
- Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behavioral Neuroscience. 114, 1058-1067 (2000).
- Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H., Stark, H. Segregation of task-relevant conditioned stimuli from background stimuli by associative learning. Brain Research. 1297, 143-159 (2009).
