Summary
Shuttle-boksen unngåelse læring er veletablert i biologisk psykologi. Denne protokollen beskriver hvordan shuttle-boksen læring i gnagere kan kombineres med stedsspesifikke elektrisk intracortical microstimulation (ICMS) og samtidig kronisk in vivo innspillinger som et verktøy for å studere flere aspekter av læring og persepsjon.
Abstract
Shuttle-box unngåelse læring er en veletablert metode i biologisk psykologi og forsøksoppsett var tradisjonelt skreddersydd; nødvendig utstyr er nå tilgjengelig med flere kommersielle selskaper. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av en to-veis shuttle-box unngåelse læring paradigmet hos gnagere (her mongolsk ørkenrotte; Meriones unguiculatus) i kombinasjon med stedsspesifikke elektrisk intracortical microstimulation (ICMS) og samtidige kroniske elektro in vivo innspillinger. Den detaljerte protokollen er aktuelt å studere flere aspekter av læring atferd og oppfatning i forskjellige gnagerarter.
Stedsspesifikke ICMS av auditiv kortikale kretser som betingede stimuli her brukes som et verktøy for å teste perseptuelle relevans bestemt afferent, efferent og intracortical tilkoblinger. Distinkte aktiveringsmønstre kan fremkalt ved hjelp av ulike stimuleringselektrode arrays for lokale, lag avhengig ICMS eller fjerne ICMS nettsteder. Utnytte atferds signal deteksjon analyse kan det bestemmes hvilke stimulering strategi er mest effektive for å få fram en behaviorally påviselig og fremtredende signal. Videre parallelle multikanal-opptak med forskjellige elektrode design (overflateelektroder, dybdeelektroder, etc.) åpner for å undersøke nevrale observables over tidsforløpet for slike læringsprosesser. Det vil bli diskutert hvordan endringer i atferds design kan øke kognitiv kompleksitet (f.eks deteksjon, diskriminering, reversering læring).
Introduction
En grunnleggende målet for biologisk psykologi er å etablere konkrete koblinger mellom nerve strukturelle og funksjonelle egenskaper, læring og persepsjon. Nevrale aktiviteten knyttet til persepsjon og læring kan studeres ved elektrofysiologisk registrering av aksjonspotensialer og lokale feltpotensialer i ulike strukturer i hjernen på flere nettsteder. Mens elektro innspillinger gi korrelative assosiasjoner mellom nevral aktivitet og atferd, har direkte elektrisk intracortical microstimulation (ICMS) i over hundre år vært den mest direkte metoden for testing årsakssammenhenger av spente populasjoner av nerveceller og deres atferdsmessige og perseptuelle effekter 1 - 3. Mange studier har vist at dyr som er i stand til å gjøre bruk av ulike romlige og tidsmessige egenskaper av elektriske stimuli i perseptuelle oppgaver avhengig av stimulering stedet innen for eksempel retinotopic 4, tonotopic 5, eller somatotopic 6 regioner i cortex. Forplantning av elektrisk fremkalt aktivitet i cortex er hovedsakelig bestemt av utformingen av aksonal fibre og deres fordelt synaptisk tilkobling 2 at i cortex, er helt klart lag avhengig 7. Den resulterende polysynaptiske aktivering fremkalt av ICMS er heretter mye mer utbredt enn direkte virkningene av det elektriske feltet 2,8,9. Dette forklarer hvorfor terskler av perseptuelle effekter fremkalt av intracortical microstimulation kan være sterkt lag avhengig 8,10,11 og site-avhengige 9. En fersk studie viste i detalj at stimulering av øvre lag gitt mer utbredt aktivering av corticocortical kretser i hovedsak supragranular lag, mens stimulering av dypere lag av hjernebarken resultat i et samlings, tilbakevendende corticoefferent intracolumnar aktivering. Parallelle atferdseksperimenter viste at sistnevnte har mye lavere perseptuelle deteksjon thresholds 8. Derfor ble fordelen av stedsspesifikke ICMS som betinget stimuli utnyttes i kombinasjon med elektrofysiologiske opptak til årsaks relatere spesifikke cortical krets aktive 8 til atferdstiltak for læring og persepsjon i shuttle-boksen.
Toveis shuttle-box paradigmet er en godt etablert laboratorieapparat for å studere unngåelse læring 12. En shuttle-boksen består av 2 avdelinger atskilt av et hinder eller døråpning. En betinget stimulus (CS) som er representert ved et passende signal som et lys eller lyd, er betinget etterfulgt av en motvilje ubetinget stimulus (US), som for eksempel en fot sjokk over en metallgittergulv. Fagene kan lære å unngå USA ved skytteltrafikk fra en shuttle-box rommet til den andre som svar på CS. Shuttle-boksen læring innebærer en sekvens av skjelnes læringsfaser 13,14: For det første,fagene lærer å forutsi USA fra CS av klassisk betinging og å flykte fra USA av instrumental condition, som USA avsluttes ved skytteltrafikk. I en neste fase, fag lære å unngå USA helt ved skyt som svar på CS US før utbruddet (unngåelsesreaksjon). Vanligvis innebærer shuttle-box læring klassisk betinging, instrumental conditioning, samt målrettet atferd avhengig av læringsfasen 14.
Shuttle-boksen prosedyre kan settes opp lett og generelt produserer robust oppførsel etter et par daglige treninger 15 - 17. I tillegg til enkle unngåelse condition (gjenkjenning), kan shuttle-box videre brukes til å studere stimulus diskriminering ved å ansette go / Nogo paradigmer. Her blir dyrene trenet til å unngå USA av en betinget respons (CR) (gå oppførsel; transport inn i motsatt kammer) som svar på en <strong> go-stimulus (CS +) og av Nogo adferd (opphold i det aktuelle kammeret, ingen CR) som respons på en Nogo-stimulus (CS-) Parallell microstimulation og registrering av nevral aktivitet med høy tetthet multielectrode matriser tillater å studere. de fysiologiske mekanismene bak vellykket læring. Flere tekniske detaljer som er grunnleggende for de vellykkede kombinasjoner av shuttle-boksen trening, ICMS og parallelle elektrofysiologi, vil bli diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene som presenteres i dette arbeidet ble utført i samsvar med de etiske standarder definert av tysk lov for beskyttelse av forsøksdyr. Forsøkene ble godkjent av etisk komité i delstaten Sachsen-Anhalt.
1. Skreddersydd Multikanal elektrode Arrays for Microstimulation og opptak
- Skreddersydd microstimulation matrise
- For å levere ICMS, forberede stimuleringselektroder i ønsket romdesign (her lateral rekke 2 kanaler) med 3-cm lange teflonisolert rustfritt ståltråder (Ø med isolasjon = 50 mikrometer). Se figur 2.
- Krympe den ene enden av trådene til en mannlig tapp system (1,25 mm pitch).
- For en to-kanals array med ~ 0,5 mm eller ~ 0,7 mm elektrodeavstand pass ledninger vinkelrett gjennom to vertikalt på linje elektronmikrosobjektHolder nett (avstand på nett ~ 5 mm) guiding ledningene (0,1654 mm pitch).
- Sett mannlige pinner i pluggen boliger.
- Sett elektroden i en skål med elektrolytisk oppløsning (for eksempel 0,9% natriumklorid) og måle impedansen av hver kanal med en respektiv impedans måleanordning (f.eks., FHC Impedance Conditioning Module). Sikt på impedanser i 100-500 kohm rekkevidde.
- Hvis impedansen er for høy, gir kort elektrisk strøm (1 sek, 1 mA) gjennom kanalene for å senke den. Sjekk impedans igjen.
- Spesiallagde høyoppløselig flerkanals opptak arrays
Merk: Denne protokollen beskriver produksjon av overflate arrays for opptak electrocorticogram (ECOG) data. Imidlertid kan utførelser skreddersys for å møte kravene i de respektive problemstillingen (dybde opptak, etc.). Høyoppløselig flerkanals arrays er bygt med teflonisolert rustfritt stål ledninger (Ø med isolasjon = 50 mikrometer) krympet til en mannlig pin system (1,25 mm pitch).- For overflateelektrodegrupper, veilede 18 ledninger gjennom en 3 x 6 matrise av to forberedte elektronmikrosobjektholder nett.
- Legge inn 6 x 3 arrangement av ledningene mellom ristene med dental akryl og sette pinnene i støpselet boliger.
- Slipe dental akryl i en rektangulær blokk ved hjelp av vinkelsliper festet til en håndholdt drill.
- Sjekk at impedans på alle kanaler (se 1.1.6) er i området mellom 100-500 kohm.
- Før implantasjon (se trinn 2) slipe overflaten av matriser for å samsvare med konveksitet av kortikale overflaten.
2. Kirurgisk Implantasjon av matriser til Auditory Cortex i bedøvet mongolske Herbils for Kronisk bruk
- Hold offisiell godkjenning for å utføre alle nødvendige eksperimentelle tiltak som er planlagt. Wear hensiktspriate verneklær (frakk, sterile hansker, kirurgiske maske, hette).
- Bruk voksne mannlige mongolsk ørkenrotte (Meriones unguiculatus) eller andre gnagere. Bruk vernehansker og frakk og alltid bruke steriliserte og godt identifiserte kirurgiske verktøy.
- I tilfelle av ørkenrotte, bedøver dyr med en ip-injeksjon av en blanding av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) fortynnet i 0,9% steril natriumklorid-løsning. Opprettholde ved infusjon av 0,6 ml / time / kg av en blanding av ketamin komponering: xylazin: natriumklorid (0,9%) i et forhold på 9: 1: 10.
- Plasser dyret på en varmeplate for å opprettholde kroppstemperaturen ved 37 ° C ved en rektal probe tilbakemeldingssystem (for eksempel Verdenspresisjonsinstrumenter).
- Barbere pelsen dekker interoccipital, parietal, og tidsmessige bein. Aseptisk forberede innsnitt området med et effektivt desinfeksjonsmiddel (f.eks., Alternerende Betadine eller Nolvasan og 70% alkohol skrubb 3 ganger). Protect øyne mot tørking av øyesalve.
- Kutt kranie huden dekker interoccipital, parietal, og frontale bein ved hjelp av en skalpell og fjerne periosteum ved forsiktig å flytte en drill over beinoverflaten.
- Bor små hull i den kontralaterale parietal og frontale ben som lateral som mulig for å ikke hindre den senere hodefestet. Skru to benskruer med en diameter på omtrent 1 mm tett inn i hullene. Kontroller at isse skruen har god kontakt til dura, som det vil bli brukt som felles referanse og jord, samt returelektrode for elektrisk stimulering senere.
- Lim en liten aluminiums bar medialt over frontale bein og bruke den som leder fiksering under implantasjon av en headholder.
- Fjern skinnet dekker musculus temporalis på den ene siden ved hjelp av saks.
- Skjær av rygg del av tinningmuskelen for å få adgang til tinningbenet.
- Expose auditiv cortex av kraniotomi (~ 3 mm x 4 mm) avtinningbenet ved hjelp av en tannlege drill. Identifiser plasseringen av auditiv cortex basert på typiske blod-hjerne-fartøy signatur 18,19.
- Kontroller nøye snitt av dura med en mikro skalpell på det sted hvor stimuleringselektrode er implantert i hjernen. Forsiktig flytte langs overflaten til de dura tårer å forby skade på underliggende neuropil.
- Sett stimulering rekke henhold mikromanipluatoren kontroll. Velge en tangential innføringsvinkel for å tillate at epidural matrisen for å bli plassert over området av interesse. Avhengig innsetting vinkel og posisjon og rettet stedet for stimulering, vurdere innsettingsdybden nøye.
- Plasser epidural overflaten innspillingen array med god kontakt til hjernens overflate som dekker regionen av interesse (her auditiv cortex) av en annen micromanipulator. Pass på at rekken matcher krumningen av hjernebarken til å ikke rykke dura.
- Fikserer både elektrodegrupper og deres plugrhus med dental akryl til skallen.
- Cover utsatt kortikale overflaten med en antiseptisk smøremiddel (f.eks KY-Jelly) og nær kraniotomi med dental akryl (f.eks Paladur, Heraeus Ulzer). Husk at polymerisasjon kan produsere varme. Bruk tilstrekkelig smøremiddel mellom neuropil og dental akryl for å hindre kontakt dental akryl og cortical overflaten, da dette kan forårsake vevsskade.
- Nå tillater dyrene å komme før starten av ytterligere prosedyre. Utvinning ganger kan variere mellom artene (f.eks ørkenrotte: ≥3 dager, mus: ≥ 7 dager). Overvåk nøye statusen av dyret og gi smertestillende behandling i de følgende dager, om nødvendig (f.eks Meloxicam; 1 mg / kg postkirurgisk og 24 timer etter operasjonen).
3. To-veis Shuttle-box Design Bruke ICMS som betinget stimulus
- Shuttle-boksen trening
- Plasser en shuttle-box (custom-build eller noe kommersielt produkt, for eksempel E10-E15, Coulbourn Instruments) i en akustisk og elektrisk skjermet kammer. Boksen inneholder to rom adskilt av et hinder. Vurdere høyden på hinderet som det påvirker atferds favorisering av go-svar. Bruk passende høyder for bestemte arter (f.eks ~ 2 cm for mus, ~ 3 cm for ørkenrotte).
- Hvis du vil bruke fot-sjokk (US), bruke et rutenett gulvet med en avstand mellom sprinklene passende for arten under etterforskning 12,15. Ta alltid vare på at ingenting elektrisk snarveier de enkelte barer (avføring, hår, elektrode krem).
- Etter en betydelig utvinning tid til dyret (se 2.17), koble lagt opptak og stimulering kabel helst uten å bruke noen kortsiktig anestesi. Prøv å dekke dyret med et håndkle og forsiktig ta dyret i hendene. Avdekke hodet og kontakter på dyret med den andre hånden og koble til kablene. Tillate dyr å tilvenne til trening kammeret i 3 min før start av hver økt.
- Per treningsøkt (1 - 2 daglig) gjelder mellom 30-90 forsøk. Bruk prøve varighet på opp til 15 sek, og inter-rettssaken intervaller som varierer tilfeldig mellom 25 - 30 sek.
- For å levere ICMS for betinget stimulering til stimuleringselektroder bruke en multikanal stimulator (f.eks MCS STG2000). For å oppnå atferdsmessige effekter uten å skade hjernevevet, bruke pulstogene (for eksempel 300 ms lengde, 100 pps) fra bifasisk, lade balansert pulser (katodisk første) med en 200 ps fase varighet. Gjenta tog med en pause på 700 ms i en varighet av 4 sek (observasjonsvindu).
- For å presentere auditiv CS bruke en analog utgang PCI bord (f.eks NI PCI-6733). Programmere disse enhetene med Matlab fleksibelt kontrollere og hardware-utløser shuttle-box systemet via de digitale utgangslinjer.
- Route det analoge utgangssignal til the shuttle-box høyttalere via en lydforsterker.
- Betinget levere foten-sjokkere USA gjennom et rutenett gulvet. For optimal elektroopptakskvalitet, generere sjokk av en andre high-end flerkanals stimulator (MCS STG2000).
- Hvis du vil bruke gjenkjenning trening stede bare CS + stimuli. Her til stede tomme prøvelser uten CS og US ispedd mellom test studier (~ 10%) korrigere for partisk shuttle atferd (se punkt 3.2). For en mer krevende oppgave, trene dyr til å diskriminere mellom CS + og CS- stimuli som presenteres i samme økt i randomisert rekkefølge.
- Klassifisere en kupé endring etter CS + utbruddet innenfor en kritisk tidsvindu på 4 sek (CR) som en hit respons. I CS + prøvelser uten CR i den kritiske tidsvinduet (miss), umiddelbart levere en mild foten sjokk for 6 til 10 sek som ubetinget stimulus (US).
Merk: repetitive CS + stimulering som overlapper med USA vil redusere læring innsats for dyr ennd forbedre læring hastighet og ytelse ('forsinkelse' vs. 'spor' conditioning, se omtale). - For CS- prøvelser, klassifisere en kupé endring innenfor den kritiske tidsvinduet som falsk alarm respons, og gjelder USA for opp til 10 sek umiddelbart etter dette upassende CR. Gjelder ikke USA etter CS- når dyret holder seg i rommet (ingen CR) under den kritiske tidsvinduet, og klassifisere denne rettssaken som korrekt avvisning.
Merk: Viktigere, foten sjokkere USA er alltid slått av, når dyrene endrer rommet som svar på det (flukt). Bruk lengre kritiske tidsvinduer for CS- studier, for eksempel, hvis repetitive betinget stimulering brukes, selv om dette vil innføre en mer konservativ læring kriterium som det gir høyere innsats av dyret til å hemme CR. - For en effektiv sammenslutning av CS og US justere sjokk styrke i et moderat utvalg for å være aversive men ikke smertefullt. Optimal innledetl strømstyrke varierer mellom artene (f.eks 50 uA for mus, 200 uA for ørkenrotte). Derfor kan du se de neste to kuler for ytterligere tekniske detaljer:
- Individuelt tilpasse sjokket styrke i den første treningsøkten starter med milde amplituder (~ 200 uA for ørkenrotte). Hvis foten sjokk styrke er det for lavt, rømme ventetider jitter og sammenheng mellom CS og USA er ikke optimal.
- Alltid ta hensyn hvis dyrene begynner å vocalize og å fryse i respons til CS. I dette tilfelle fotsjokk styrke er for høy. Dette betinget frykt respons forstyrrer unngåelse læring.
- Nøye bestemme rømningsventetider. Øk fotsjokk styrke trinn-for-trinn dersom rømningsventetider er lengre enn 2 sekunder etter de første 20 forsøkene. Sjekk etter hver trening hvis dyret er under sjokk kontroll, det vil si, det viser flykte ventetider betydelig under 2 sek.
Merk: Unngå imidlertid å øke fotensjokkere styrke for fort, som atferdsstrategi av en svært stresset dyr kan falle tilbake til rene rømnings svar. Derfor nøye følge virkemåten og spesielt responsventetider mens justere amplituden av USA. For et eksempel se Figur 3E. - Hvis dyret viser CR, stoppe presentasjonen av CS umiddelbart. Dette er avgjørende for forsterkning av unngåelsesrespons.
- Hvis dyr har fått en unngåelsesstrategi, dvs. vise passende CR til alle CS, varierer parametere (ICMS amplitude, fase varighet, repetisjon hastighet etc.) til å utføre psykometriske analyser. Påfør para CS variasjon i en blokkvis mote med US sammenkobling, som imidlertid vil indusere læring og tilpasning.
- For å unngå dette, starter med 15 til 30 studier av den opprinnelige trening, og deretter tilfeldig flette serie variasjoner uten USA som testforsøk mellom de vanlige treningsforsøk med den opprinnelige CS-tallet. Maksimalt use 25% av testforsøk.
- Etter treningen fjerne dyret fra treningen kammeret og rengjør den komplette boksen nøye før opplæring av neste dyret. Prøv å unngå å trene forskjellige arter av gangen i samme boks, som deres naturlige lukten kan forstyrre trening ytelse.
- Analyse av treningsdata
- Registrere alle kupé endringer i habituering fasen.
- Registrere alle kupé endringer under trening og dele inn treff og falske alarmer, rømme svar (meteren og rygg skyttelbussene etter en falsk alarm) og spontane intertrial skyttelbussene (ITS).
- Beregn CR priser for CS + og CS- slik: hit prisene = Treff / antallet serie + forsøk; falske alarmer = falske alarmer / antall CS- prøvelser.
- Skaff CR priser session-messig. Men for å vurdere lærings dynamikken på et høyere tidsoppløsning, beregne CR priser fra kortere blokker av samme antall CS + og CS- studier (
- Plot CR priser som en funksjon av økt eller prøvestein for evaluering av trening fremgang og lærings dynamikk.
- For kvantifisering av de atferdsmessige følsomhet uavhengig av eksperimentelle betingelser biasing responsen av dyret, d 'utlede verdier basert på signaldeteksjons teori 8,9,17.
- For d 'bruk analyse Z-scorene til tilsvarende hit og falske alarmer (diskriminering lærings) eller rammet priser og ITS (deteksjon læring) som stammer fra de inverse av en standardisert normalfordelingsfunksjon og trekke fra disse z-score. Sette en terskelkriterium for påvisning av stimulus d '= 1,0, som tilsvarer en signalstyrke på ett standardavvik over støyen. Se figur 3 som eksempel.
- I tillegg bestemmer CR-, hvert reaksjonstider som reaksjon på forskjellige CS ved å måle tiden mellom CS utbruddet og adferdsrespons (komplett kammerendre).
- Få en mer detaljert adferdsanalyse fra videotaping shuttle-box atferd. Oppnå temp synkronisering mellom video- og opptakssystemer ved opptak triggerpulser fra shuttle-box eller stimulering system på audio spor av videoen. Videoanalyse gjør det mulig å asses oppmerksomhet og orienterings svarene av dyret før den CR.
4. I Vivo Elektro Teknikker i Learning Dyr
- Elektro opptak under trening
- Under trening, ta opp elektrofysiologiske signaler (for eksempel med de beskrevne ECOG-arrays) fra flere elektroder monopolarly mot felles referanse / jordingselektrode.
- Fôr signaler fra alle elektroder i en heads forsterker enten plugges direkte eller via en kort adapter inn i hodet kontakter.
- Koble heads til hovedforsterkeren via en sele av tynne, fleksible kabler innpakketav en wire for å beskytte den mot skade ved å bite dyr.
Merk: Mekanisk stress i kabelen sele kan bli avløst av en fjær ytterligere tillater fri bevegelse og rotasjon av dyret i boksen. Ideelle er bruken av et dreibart og motorisert dreie. Men for hørbar eksperimenter plassere sving utenfor lydisolert kammer eller lyd skjerme det med skum for å redusere høyfrekvent hørbar støy som produseres av sin motor. - Bruke en forforsterker i det skjermede boksen for å øke signal-til-støy-forhold og båndpassfilter signalet i det ønskede frekvensområde.
- Sample data på mer enn 1 kHz samplingsfrekvens (for lokale felt potensielle opptak) og minst 40 kHz (for action potensielle opptak) og lagre til PC for offline analyse. Bruk egnede filterinnstillingene for begge typer (f.eks 2 - 300 Hz for lokale feltet potensial; 300 - 4000 Hz for aksjonspotensialer).
- Sjekk nøye kvaliteten på opptaket før starten av tregner (ingen støy eller bevegelse gjenstander). Anvende en elektronisk FFT-filter til signalet for å bestemme amplituden av 50 Hz støy. Om nødvendig dobbeltsjekke alle forbindelser mellom hodet kontakt, kortene, de headstages, kabel sele, og forsterkere.
- For reduksjon av gjenstander i de registrerte data fremkalt ved elektrisk stimulering bruke en interpole prosedyre for å rekonstruere alle datapunkter som berøres av artefakt 1 ms før till ~ 5 ms etter utbruddet av hver puls. For dette, setter nuller mellom upåvirket datapunkter, og bruke en symmetrisk FIR-filter som minimerer gjennomsnitts-torget feil mellom de interpolerte punkter og deres ideelle verdier (Matlab er interp.m funksjon). Bruk denne fremgangsmåten til den rå signal, separat på hver kanal før videre analyse 9.
- Tekniske detaljer av parallell shuttle-boksen trening, ICMS, og opptak
- Generelt sikre at dyr føler deg komfortabel i boksen surrounding. At dyret kan bevege seg fritt, og nå alle hjørner av boksen. Tilstrekkelig tid til å tilvenne en dag før første trening (20 min) og før hver økt (3 min) er gunstig.
- Etter noen kirurgisk behandling, la dyret tilstrekkelig tid til å gjenopprette inkludert medisiner om nødvendig (se ovenfor 2.17) og begynne å trene dyret bare dersom dyrene ikke viser noen typiske tegn på å lide eller smerte (lukkede øyne, apatisk fenotype, scruffy pels 20).
- Sikre riktig elektrisk jording av rutenettet gulvet. Jordsløyfer mellom opptakssystem, shuttle-box og dyret må unngås. Jorde dyret bare via sin felles jordingselektrode, forlater gridfloor med flytende spenning.
- Koble multikanal stimulator (MCS STG2000) til hodet kontakten på implanterte stimulering elektrodesystem via egne linjer av motorisert dreie.
- Bruk felles jordingselektrode av opptaket som bakken eller returnere elektrode for jegCMS, så vel.
5. Histologisk analyse av elektrodeplasseringer
- Etter fullført treningssettet, kontrollere for den stabile posisjonen til stimuleringselektrode matrisen ved histologisk analyse.
- Bedøver dyr med en ip-injeksjon av en blanding av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) fortynnet i 0,9% steril natriumklorid. Da gjelder monopolar katodiske strøm (30 uA til 60 sek) leveres gjennom alle stimulasjonskanaler å oppnå jern innskudd i vevet ved posisjonen av implantasjon 8.
- Ved å følge denne fremgangsmåten, ofrer dyret ved en egnet og godkjent metode for avlivning (f.eks intraperitoneal injeksjon av en overdose av pentobarbital, 100 mg / kg).
- Fjern hjernen til dyret umiddelbart og fryse den i 2-metylbutan avkjølt til -70 ° C i flytende nitrogen.
- Nå kuttes regionen av interesse på en kryostat mikrotom til 50 mikrometer hORIZONTAL seksjoner.
- Histologi: Nissl og "Prussian Blue" -staining
- For identifisering av cortical lagene behandler hver andre skive med Nissl-farging. Først bade skiver 5 minutter i 0,05 M natriumacetat-trihydrat-buffer (pH 4,0 -4,2).
- Bade skiver for 5 - 10 min i 5% cresylfiolett acetat. Skyll skiver med destillert vann.
- Bade skiver av 2 min etter hverandre i 0,05 M natriumacetat-trihydrat-buffer (pH 4,0 - 4,2), og i oppløsninger av 50%, 70% og 90% etanol, henholdsvis.
- Bade skiver to ganger i isopropanol: 96% etanol (2: 1) i 5 minutter hver.
- Til slutt, bade skivene i Roticlear tre ganger i 5 min.
- Skaff plassering av stimulasjonskanaler med "Prussian Blue" -staining av annenhver skive som gjør jernet deponering fremkalt av lange monofasiske strømninger etter forsøkene synlige.
- Forbered en frisk løsning av 1% kalium hexacyanoferrat (II) trihydrat K 4[Fe (CN) 6] ved å blande 2 g K 4 [Fe (CN) 6] i 200 ml av 1% HCl.
- Legg 800 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4).
- Bade hjerneskiver i 10 minutter med destillert vann, og deretter i 10 minutter i hexacyanoferrat løsningen.
- Bade skiver to ganger i 10 minutter i 0,1 M fosfatbuffer og til slutt i 5 minutter i destillert vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne seksjonen viser et representativt eksempel på shuttle-box læring i en mongolsk ørkenrotte. Faget ble opplært til å diskriminere på ICMS området mellom to stimulerings elektroder implantert 700 mikrometer fra hverandre i auditiv cortex (figur 1 og 2). Stimulerings arrays kan tilpasses i forskjellige romlige design (figur 1). Her, diskriminering av de to ICMS nettstedene ble lært i løpet av 3 treningsøkter med presentasjon av 30 CS + og CS- hver (figur 3A-C). Dette indikeres med en stabil signifikant forskjell på de CR priser av hit og falsk alarm reaksjoner i hele 7 påfølgende treningene (Figur 3B). Tilsvarende d 'er> 1 i disse øktene (Figur 3C). Hurtigrømningsventetider mot USA er grunnleggende, som de gjenspeiler en effektiv motvilje ubetinget reaksjon. Dette kan garanteres ved å tilpasse fotsjokk styrke fra 200 &# 181; A i 50 uA trinn till rømnings er korte ventetider (se figur 3E). Parallelt elektrofysiologiske opptak fra en ECOG-matrise tillate å vurdere de stedsspesifikke spatiotemporal aktiveringsmønstre fremkalt av intracortical elektrisk CS + eller CS- ved stimulering nettsider adskilt med ~ 700 mikrometer (figur 4).
Figur 1. elektrodegruppen design. (A) Dybde array (2 x 1) for intracortical microstimulation på to forskjellige steder i cortex. Elektroder er anordnet i en interelektrodeavstand på ~ 700 mikrometer. Andre romlige design kan tillate lag avhengig lokal ICMS i ulike kortikale dybder eller laterale matriser med stimulerings steder langs en bestemt akse kortikalt vev, som for eksempel tonotopic gradient av auditiv cortex 8. (B) Epidural overflaterce array (3 x 6) for opptak av den electrocorticogram med høy romlig oppløsning. Elektroder ble laget av rustfritt stål (Ø 256 mm) arrangert i en 3x6 matrise med en inter avstand på ~ 600 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Plassering av implanterte stimulering og opptak elektroder. (A) Et par med to stimuleringselektroder (se figur 1A) S1 (mørkegrønn) og S2 (grønt lys) blir implantert inn i dybden av den rette primære auditive felt AI nær sin inngangslaget IV. Elektrodespissene kan plasseres langs den rostrocaudal aksen (kaudal elektrode S1, rostralt elektrode S2) med en interelektrodeavstand på ~ 700 mikrometer. 3 x 6 ECOG opptakarray (600 um interelektrodeavstand) er sentrert epiduralt over høyre AI. (B) Nissl-fargede horisontalsnitt av respektive hjerneregion etter eksperimentell fremgangsmåte viser to små lesjoner (piler), som var forårsaket av tuppene av de to implanterte stimuleringselektroder indikerer deres plassering innenfor time cortex. Stillingen kan bli ytterligere vurdert av "Prussian Blue" farging. Dette tallet har blitt forandret fra Deliano et al., 2009. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Shuttle-boksen trening data og analyse av ett enkelt dyr. (A) schemata på høyre beskrive oppgaven design for CS + og CS- prøvelser i en to-veis shuttle-box discriminatipå oppgaven og atferdsmessige utfall. (B) Learning kurvene plottet som hit og falske alarmer av individuelle treningsøkter. Signifikante forskjeller mellom hit og falske alarmer er merket med stjerne (Games-Howell test, p <0,05). (C) Sensitivity indeksen d '> 1 (se 3.2.7) kan brukes som terskelkriterium for vellykket diskriminering. (D ) Overvåking av de spontane kryssinger under tilvenning fasen generelt viser en nedgang i løpet av øktene. (E) Response ventetider under CS + prøvelser er plottet for individuelle studier enn alle treningsøktene. Alle svar med ventetider under 6 sek tilsvarer vellykkede hit svar. Legg merke til de lengre rømningsventetider i første halvdel av den første økten. Etter økende reduserte foten sjokk styrke rømningsventetider under 2 sek etter at amerikanske debut som indikerer tilstrekkelig sjokk kontroll. Histogrammer (høyre innfelt) av responsventetider er bimodal tilsvar å treffe svar (<6 sek) og rømme svar. (6 - 8 sek) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Parallell elektrofysiologisk registrering i et lærings dyr. (A) Typisk eksempel på en elektrisk fremkalt potensial (EEP) fra ett enkelt dyr i gjennomsnitt over CS + prøvelser i en enkelt økt med trening. Data ble registrert fra en ECOG-array. Figuren sammenligner EEP trace før (svart) og etter (rød) fjerning av enkelt puls stimulanse gjenstander. Detaljer av artefakt reduksjon se avsnitt 4.1.7. Den tidlige fremtredende negative spiss kan sees ved en ventetid på 20 ms (N20). (B) Ytterligere analyse av de romlige fordelinger av N20 amplitude som respons på en CS + i tHan rostralt stimuleringselektrode (øverst) og til en CS- ved kaudal stimuleringselektrode (nederst) viser den romlige oppløsningen av tilstander fremkalt gjennom auditiv cortex. Anatomiske retninger i forhold til opptaket matrisen er indikert med piler (d, dorsal, c, kaudal, l, sideveis, m, medial, R, rostral; v, ventral). Dette tallet har blitt forandret fra Deliano et al., 2009. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for samtidige stedsspesifikke ICMS og flerkanals elektrofysiologiske opptak i en lærings dyr ved hjelp av en toveis motvilje fotsjokk kontrollert shuttle-box system. Protokollen understreker tekniske nøkkelbegrep for en slik kombinasjon og påpeker viktigheten av jording dyret bare via sin felles jordingselektrode, forlater gridfloor med flytende spenning. Her ble det auditive shuttle-box læring brukes på mongolsk ørkenrotte som læringsrelaterte plast omorganiseringer av det auditive cortex i disse dyrene har blitt studert 8,12,14,15,21,22. Likevel kan den beskrevne protokoll tilpasses med mindre endringer i andre gnagere, som for eksempel mus 16. I denne forbindelse er det viktig å vurdere artsspesifikke tilpasninger vedrørende utvinning tid etter operasjonen (2,17), høyden av hinderet (2.1.1), og fot-sjokk følsomheten til individuelle dyr, som kan highly variabel (3.1.3-3.1.6).
Protokollen gir ytterligere detaljerte forklaringer om hvordan skreddersydde elektrode design kan brukes til å stimulere ulike steder i kortikale vev fører til forskjellige nettverksaktiveringer som stammer fra analyse av samtidige elektrofysiologiske multielectrode innspillinger 8,23. Avhengig av avstand elektroder kan man stimulere ulike regioner av for eksempel topografiske kart 9. Ved å påføre lag avhengig ICMS er det mulig å differentially aktivere langtrekkende corticocortical anslag fører til mer utbredt aktivering av cortex ved stimulering i kortikale innsatslagene III-IV. I stedet stimulering i corticoefferent utgangs lag V-VI ført til en mye mer fokal aktivering av intracortical og corticothalamic tilbakekoblingskretser 8. Ved bruk av stimulerings rekker med to eller flere stimuleringselektroder, kan bipolare ICMS anvendes i stedet for monopolar ICMS. En bipolar stimulering modus merrekrutterer effektivt neuronal fibre som går parallelt med elektrodespissene, fortrinnsvis i retning av den katodiske pol-parallelt i forhold til fibrene 24. En slik stimulering konfigurasjon dermed øker retnings spesifisitet av de fremkalt nevrale nettverk aktive 8. Disse spesielle direkte manipulasjoner av kortikale sublaminar nettverksaktiviteter med ICMS 8,9, har så langt ikke blitt vist av noen annen teknikk tre. Som et eksempel på kraften i denne metoden, raknet en fersk rapport bidraget fra CORTICO-thalamocortical tilbakemelding kretser til persepsjon hjelp deteksjon læring av intracortical elektrisk stimuli 8. Dette viser at direkte cortical microstimulation er en effektiv og state-of-the-art-metoden til årsakslinjeaktivitet i spesifiserte nevrale kretser og atferd 1,3,11,25. Ved lokal elektrisk stimulering av kortikale regioner som tilsvarer spesifikke topografiske kartfunksjoner, som for instAnce en tonotopic region i det auditive cortex, kan fagene bli opplært i overføringslærings paradigmer for å sammenligne egenskaper persepter fremkalt av sentrale elektriske eller perifer sensorisk stimulering. Slike eksperimenter kan stimulere til utvikling av stimulerings strategier for sensoriske cortical neuroprostheses 5,9. Denne protokollen kan også anvendes i den elektriske stimulering av andre hjerneområder, som for eksempel det ventrale tegmentale område, for å studere belønning behandling og neuronal fundamentet for dypt hjernestimulasjon 26. Kritisk for effektiv microstimulation er flere tekniske detaljer som må vurderes på bakgrunn av den enkelte oppsett og elektroder brukes. Generelt påvirkning av stimuleringsparametere, slik som stimulering amplitude, polaritet, elektrode orientering, etc., er blitt gjennomgått 11,24. Av betydning er overføring ladningen av elektroden. Impedansen til en elektrode er derfor en kritisk faktor. Derfor må du sjekke at tHan impedans av elektrodekontaktene er i kohm område før implantasjon.
Flere andre fenomener av læring kan studeres ved passende variasjon av de beskrevne grunnleggende konstruksjon. For eksempel kan diskriminering læring i motsetning til enkel gjenkjenning læring bli undersøkt ved å innføre minst to stimuli som må være forbundet med go og Nogo svar, henholdsvis 14,15. Tilsvar kategori formasjon læring kan studeres ved å kombinere slik diskriminering paradigmer 12,21. Shuttle-boks paradigmer kan også anvendes for å undersøke arbeidsminne, adferdsinhibering og kognitiv fleksibilitet som eksempelvis er nødvendig for vellykket reversering lære 14,17 eller sett giring. Arbeidsminnet kan vurderes ved å sammenligne "forsinkelse" og "spor" condition. I "forsinkelse" condition 27, er CS presentert gjennom den kritiske CS-amerikansk tid vindu uten forsinkelse mellom CS avFSET og US utbruddet. I "trace" kondisjonering, på den annen side, er det en forsinkelse på flere sekunder etter forskyvningen av transient CS presentasjon. I motsetning til "forsinkelse" condition "spor" condition setter en høy belastning på arbeidsminnet og kortikal prosessering. Kombinere diskriminerende shuttle-box lærings paradigmer med analyse av tid og rom mønstre i den pågående electrocorticogram, er en egnet metode for å identifisere dynamiske tilstander av auditiv cortex knyttet til stimulus diskriminering 9, og kategori formasjon 21. Men som shuttle-boksen trening er klassisk brukes som toveis unngåelse oppgave, ikke de generelle konseptuelle problemer med unngåelse læring gjelde for alle disse atferds design; nemlig at vellykket unngåelsesadferd eksplisitt forhindrer forekomst av stimulus som tjener som forsterker. Appetitive forsterkning, for eksempel ved direkte elektrisk stimulering av midthjernen belønning kretser, har bare bien brukes til shuttle-boksen læring i noen studier 26. Også har shuttle-box læring hovedsakelig vært brukt med gnagerarter og har blitt sjelden brukt i større forsøksdyr, som for eksempel hunder.
Foruten med elektrofysiologisk analyse, kan shuttle-box læring videre kombineres med farmakologisk intervensjon 8,17, lesjon teknikker 15, mikrodialyse 28, eller optogenetics. Spesielt en kombinasjon av et protokoll med optogenetic verktøy, enten ved viral infeksjon i modellsystemet (dvs. mongolske ørkenrotte), eller ved genetisk modifiserte dyr, som mus, ville tillate å øke spesielt den cellulære subtype spesifisiteten av kunstig neuronal aktivering inkludert kortikal hemming, som ikke er tilgjengelig ved hjelp ICMS tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Deustche Forschungsgemeinschaft DFG og Leibniz-instituttet for nevrobiologi. Vi takker Maria-Marina Zempeltzi og Kathrin Ohl for teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
- Cohen, M. R., Newsome, W. T. What electrical microstimulation has revealed about the neural basis of cognition. Current Opinion in Neurobiology. 14 (2), 169-177 (2004).
- Histed, M. H., Bonin, V., Reid, R. C. Direct activation of sparse, distributed populations of cortical neurons by electrical microstimulation. Neuron. 63 (4), 508-522 (2009).
- Histed, M. H., Ni, A. M., Maunsell, J. H. R. Insights into cortical mechanisms of behavior from microstimulation experiments. Progress in Neurobiology. 103, 115-130 (2013).
- Bradley, D. C., et al. Visuotopic mapping through a multichannel stimulating implant in primate V1. Journal of Neurophysiology. 93, 1659-1670 (2005).
- Scheich, H., Breindl, A. An Animal Model of Auditory Cortex Prostheses. Audiology and Neurootology. 7 (3), 191-194 (2002).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinas, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- Douglas, R. J., Martin, K. A. C.
- Happel, M. F. K., Deliano, M., Handschuh, J., Ohl, F. W. Dopamine-modulated recurrent corticoefferent feedback in primary sensory cortex promotes detection of behaviorally relevant stimuli. The Journal of Neuroscience. 34 (4), 1234-1247 (2014).
- Deliano, M., Scheich, H., Ohl, F. W. Auditory cortical activity after intracortical microstimulation and its role for sensory processing and learning. The Journal of Neuroscience. 29 (50), 15898-15909 (2009).
- DeYoe, E. A., Lewine, J. D., Doty, R. W. Laminar variation in threshold for detection of electrical excitation of striate cortex by macaques. Journal of Neurophysiology. 94 (5), 3443-3450 (2005).
- Tehovnik, E. J., Slocum, W. M., Schiller, P. H. Delaying visually guided saccades by microstimulation of macaque V1: spatial properties of delay fields. The European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2635-2643 (2005).
- Wetzel, W., Wagner, T., Ohl, F. W., Scheich, H. Categorical discrimination of direction in frequency-modulated tones by Mongolian gerbils. Behavioural Brain Research. 91, 29-39 (1998).
- Cain, C. K., LeDoux, J. E. Escape from fear: a detailed behavioral analysis of two atypical responses reinforced by CS termination. Journal of Experimental Psychology. Animal behavior processes. 33, 451-463 (2007).
- Stark, H., Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H. Dynamics of cortical theta activity correlates with stages of auditory avoidance strategy formation in a shuttle-box. Neuroscience. 151, 467-475 (2008).
- Ohl, F. W., Wetzel, W., Wagner, T., Rech, A., Scheich, H. Bilateral ablation of auditory cortex in Mongolian gerbil affects discrimination of frequency modulated tones but not of pure tones. Learning & Memory. 6 (4), 347-362 (1999).
- Kurt, S., Ehret, G. Auditory discrimination learning and knowledge transfer in mice depends on task difficulty. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8481-8485 (2010).
- Happel, M. F. K., et al. Enhanced cognitive flexibility in reversal learning induced by removal of the extracellular matrix in auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2800-2805 (2014).
- Thomas, H., Tillein, J., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). I. Electrophysiological mapping of frequency representation and distinction of fields. The European journal of neuroscience. 5, 882-897 (1993).
- Budinger, E., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). III. Anatomical subdivisions and corticocortical connections. European Journal of Neuroscience. 12, 2425-2451 (2000).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Ohl, F. W., Scheich, H., Freeman, W. J. Change in pattern of ongoing cortical activity with auditory category learning. Nature. 412 (6848), 733-736 (2001).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hearing Research. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Happel, M. F. K., Jeschke, M., Ohl, F. W. Spectral integration in primary auditory cortex attributable to temporally precise convergence of thalamocortical and intracortical input. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11114-11127 (2010).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Research. 98, 417-440 (1975).
- Clark, K. L., Armstrong, K. M., Moore, T. Probing neural circuitry and function with electrical microstimulation. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 278 (1709), 1121-1130 (2011).
- Ilango, A., Shumake, J., Wetzel, W., Scheich, H., Ohl, F. W. Electrical stimulation of lateral habenula during learning: frequency-dependent effects on acquisition but not retrieval of a two-way active avoidance response. PloS one. 8 (6), e65684 (2013).
- Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behavioral Neuroscience. 114, 1058-1067 (2000).
- Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H., Stark, H. Segregation of task-relevant conditioned stimuli from background stimuli by associative learning. Brain Research. 1297, 143-159 (2009).
