Summary
셔틀 박스 회피 학습은 행동 신경 과학에 잘 확립되어있다. 이 프로토콜은 설치류에서 학습 셔틀 상자가 사이트 별 전기 intracortical 미세 자극 (ICMS) 및 학습과 인식의 여러 측면을 연구하는 도구로 생체 내 녹음 동시 만성와 결합 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
셔틀 박스 회피 학습 행동 신경 과학 및 실험 설정에서 잘 확립 된 방법은 전통적으로 맞춤 제작했다입니다 필요한 장비는 여러 상업 회사에 의해 사용할 수 있습니다. 조합 사이트 별 전기 intracortical 미세 자극 (ICMS) 동시 만성 전기 생리학 생체 기록과,이 프로토콜은 설치류에서 양방향 셔틀 상자 회피 학습 패러다임의 상세한 설명 (Meriones unguiculatus 여기 몽골어 게르 빌 루스 쥐)를 제공합니다. 자세한 프로토콜은 서로 다른 설치류 종의 학습 행동과 인식의 여러 측면을 연구에 적용 할 수있다.
여기 conditioned 자극으로 청각 피질 회로의 사이트 별 ICMS 특정 구 심성, 원심성 및 intracortical 연결의 지각 관련성을 테스트하는 도구로 사용된다. 별개의 활성화 패턴이 상이한 자극 전극 도착을 사용하여 유발 될 수있다지역, 계층에 의존하는 ICMS 또는 먼 ICMS 사이트 AYS. 자극 전략 및 두드러진 행동면 검출 신호를 유도하는 가장 효과적인 것이 결정될 수 행동 신호 검출 분석을 이용. 또한, (표면 전극 등, 깊이 전극) 다른 전극 설계를 이용하여 병렬 멀티 - 레코딩은 학습 과정의 시간 과정 동안 신경 세포의 관찰 가능한 조사 허용한다. 그것은 행동 디자인의 변화가인지 적 복잡성을 증가시킬 수있는 방법을 설명합니다 (예를 들어, 감지, 차별, 반전 학습)됩니다.
Introduction
행동 신경 과학의 기본 목표는 신경 세포의 구조 및 기능적 특성, 학습과 인식 사이에 특정 링크를 설정하는 것입니다. 인식 및 학습과 관련된 신경 활동은 여러 사이트에서 다양한 뇌 구조에서 활동 전위 및 지역 현장 잠재력의 전기 생리 기록하여 공부하실 수 있습니다. 3 - 전기 생리 녹음 신경 활동과 행동 사이의 상호 연결을 제공하는 반면, 세기 이상에 대한 직접 전기 intracortical 미세 자극 (ICMS)는 신경 세포의 흥분 집단과 그들의 행동과 지각 효과 1의 테스트 인과 관계에 대한 가장 직접적인 방법이었다. 많은 연구는 동물 인스턴스 retinotopic 4, T에 대한 내 자극 사이트에 따라 지각 작업 전기 자극의 다양한 공간과 시간 특성을 활용할 수 있다는 것을 증명하고있다피질에서 onotopic 5, somatotopic 6 지역. 피질의 전기적으로 유발 된 활동의 전파는 주로 축삭 섬유와 피질에, 명확 층 의존 7, 그들의 분산 시냅스 연결 2의 레이아웃에 의해 결정된다. ICMS에 의해 유발 된 결과 polysynaptic 활성화는 훨씬 더 이제부터는 전기 필드 2,8,9의 직접적인 영향보다 넓은 확산이다. intracortical 미세 자극에 의해 유도 지각 효과의 한계가 강하게 층 의존 8,10,11 및 사이트에 의존 9 될 수 있습니다 이유를 설명. 최근의 연구는 피질 결과의 깊은 층의 자극 활성화 intracolumnar 초점, 재발 corticoefferent에있는 동안 상위 계층의 자극은 주로 supragranular 층에 corticocortical 회로의 더 넓은 확산 활성화를 산출하는 것이 구체적으로 보여 주었다. 병렬 행동 실험은 후자가 훨씬 낮은 지각 검출 THR이 있는지 밝혀esholds 8. 인과 8 셔틀 상자에 학습과 인식의 행동 조치와 관련된 대뇌 피질 회로의 활성화를 관계에 따라서, 특정 사이트 ICMS로 조절 된 자극의 장점은 전기 생리 녹음과 함께 이용되었다.
양방향 셔틀 박스 패러다임은 회피 학습 (12)을 연구하는 잘 확립 된 실험 장치이다. 셔틀 상자는 장애물 또는 출입구에 의해 분리 된 2 구획으로 구성되어 있습니다. 빛이나 소리와 같은 적절한 신호에 의해 표시되는 조건 자극 (CS)는, 우발적, 혐오 무조건 자극 (US) 뒤에 예를 들어 같은 금속 그리드 바닥을 통해 발 충격. 피험자는 CS에 대한 응답으로 다른 하나의 셔틀 박스 구획에서 왕복으로 US를 피하는 것을 배울 수있다. 첫째 : 셔틀 박스 학습 13,14 구별 학습 단계의 시퀀스를 포함주제는 고전적 조건 형성에 의해 CS에서 미국을 예측하고, 미국은 왕복에 종료 될 때, 악기 조절에 의해 미국에서 탈출하는 법을 배워야. 다음 단계에서, 주제는 미국의 발병하기 전에 CS (회피 반응)에 대한 응답으로 왕복으로 모두 미국을 피하기 위해 배웁니다. 일반적으로, 셔틀 박스 학습은 고전적 조건 형성, 악기 조절뿐만 아니라, 상 (14)을 학습에 따라 목표 지향적 행동을 포함한다.
셔틀 박스 절차를 쉽게 설정하고 일반적으로 몇 일간 훈련 15 일 이후 강력한 행동을 생성 할 수있다 - (17). 간단한 회피 컨디셔닝 (검출)에 더하여, 셔틀 박스 나아가 / 노고 패러다임을 이용하여 자극 차별을 연구하는데 사용될 수있다. 여기에, 동물은 조건 반응에 의해 미국 (CR) (동작을 이동을, 반대 구획에 셔틀) 방지하기 위해 훈련에 대한 응답으로 <공부를 할 수 있도록 노고 자극 (CS-)에 대한 응답으로 고밀도 다중 전극 배열과 평행 미세 자극과 신경 활동의 기록.; strong>을 이동-자극 (CS +)와 노고 행동으로는 (더 CR을 현재 구획에 머물 없음) 성공적인 학습을 기초 생리 메커니즘. 셔틀 상자 훈련, ICMS 및 병렬 전기 생리학의 성공적인 조합에 대한 기본적인 몇 가지 기술적 인 세부 사항이 논의 될 것이다.
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Protocol
이 연구에서 제시된 모든 실험은 실험 동물의 보호를위한 독일의 법에 의해 정의 된 윤리 기준과 일치 실시 하였다. 실험은 작센 - 안할 트의 상태의 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 주문 제작 미세 자극 및 녹화를위한 멀티 채널 전극 배열
- 주문 제작 미세 자극 배열
- ICMS를 전달하기 위해, (Ø = 아이솔레이션과 50 μm의) 3-cm 길이 테플론 절연 스테인레스 스틸 와이어를 사용하여 원하는 공간 디자인 (2 채널의 여기 횡 배열)에 자극 전극을 준비한다. 그림 2를 참조하십시오.
- 핀 시스템 (1.25 mm 피치)에 전선의 한쪽 끝을 압착.
- 2 채널과 어레이 ~ 0.5 mm 또는 ~을위한 와이어 (0.1654 mm 피치)를 안내하는 수직으로 두 개의 수직 배향 전자 현미경 물체 홀더 그리드 (~ 5mm 그리드의 거리) 내지 0.7 mm의 전극 간 거리 통과 전선.
- 플러그 하우징에 핀을 넣습니다.
- 전해액 (예를 들어, 0.9 % 염화나트륨)과 접시에 전극을 넣어 각 임피던스 측정 장치와 각 채널의 임피던스를 측정 (예., FHC 임피던스 냉방 모듈). 100-500 kΩ의 범위에서 임피던스 목표로하고 있습니다.
- 임피던스가 너무 높으면을 낮추는 채널을 통해 단락 전류 (1 초, 1mA)를 제공한다. 다시 임피던스를 확인하십시오.
- 주문 제작 고해상도 멀티 채널 녹음 배열
참고 :이 프로토콜은 electrocorticogram (ECOG) 데이터를 기록하기위한 표면 어레이의 제조에 대해 설명합니다. 그러나, 디자인은 각 연구 문제의 요구 (깊이 녹음 등)을 만족하도록 조정될 수있다. 고해상도 멀티 어레이 건설 장 아르테플론 절연 스테인레스 스틸 와이어 (μm의 분리와 O = 50)에 의해 T는 핀 시스템 (1.25 mm 피치)에 압착.- 표면 전극 배열의 경우, 두 가지 준비를 전자 현미경 객체 홀더 그리드의 3 × 6 행렬을 통해 18 와이어를 안내합니다.
- 치과 아크릴과 격자 사이의 전선의 6 × 3 배열을 포함하고 플러그 하우징에 핀을 넣어.
- 휴대용 드릴에 장착 된 분쇄기를 사용하여 직사각형 블록으로 치과 아크릴 갈기.
- 500 kΩ의 - (1.1.6 참조) 모든 채널의 임피던스를 체크 (100) 사이의 범위이다.
- 주입 전에 피질골 표면의 볼록 상태와 일치하도록 배열의 연마 표면 (공정 2 참조).
만성 사용에 대한 마취 몽골어 Herbils에서 청각 피질로 배열 2. 외과 이식
- 계획되어 필요한 모든 실험 단계를 실행하는 공식 승인을 잡으십시오. 아프로을 착용절한 보호 의류 (코트, 멸균 장갑, 수술 용 마스크, 후드).
- 성인 남성 몽골어 게르 빌 루스 쥐 (Meriones unguiculatus) 또는 다른 설치류 종을 사용합니다. 멸균 잘 식별 수술 도구를 사용하여 항상 보호 장갑과 코트를 착용합니다.
- 게르 빌 루스 쥐의 경우에는, 0.9 % 멸균 식염수에 희석 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 혼합물의 IP 주입하여 동물을 마취시키다. 1 : 109의 비율로 염화나트륨 (0.9 %) : 자일 라진 : 케타민의 혼합물 작곡 0.6 ㎖ / 시간 / kg의 주입에 의해 유지한다.
- 직장 프로브 피드백 시스템에 의해 37 ℃에서 체온을 유지하기위한 가열 플레이트 상에 동물을 배치 (예를 들어, 세계 정밀 기기).
- 모피 커버 interoccipital, 정수리, 시간적 뼈를 면도. 무균 효과적인 소독제와 절개 사이트를 준비 (예., Betadine 또는 Nolvasan 70 % 알코올 스크럽 3 회 교대). 홍보눈 연고에 의한 건조에 대한 otect 눈.
- interoccipital, 정수리를 덮고있는 두개골 피부를 잘라하고, 메스를 사용하여 뼈를 정면 부드럽게 뼈 표면에 드릴을 이동하여 골막을 제거합니다.
- 나중에 헤드 마운트 방해하지 않도록 반대측 정수리 가능한 한 측면 정면 뼈에 작은 구멍을 드릴. 지금 단단히 구멍에 약 1mm의 직경을 갖는 두 개의 뼈 나사를 나사. 나중에에 전기 자극에 대한 공통 기준 및 접지뿐만 아니라 반환 전극으로 사용되는 바와 같이 정수리 나사, 경질 좋은 접촉을 가지고 있는지 확인하십시오.
- 정면 뼈를 통해 내측으로 작은 알루미늄 막대를 접착제와 headholder에 의해 주입하는 동안 헤드 고정으로 사용.
- 한쪽 이용 가위에의 musculus 측두근을 커버 피부를 제거합니다.
- 측두골에 입학을 얻기 위해 시간 근육의 지느러미 부분을 잘라.
- 개두술 (~ 3mm × 4 ㎜)의 의해 청각 피질 노출치과 용 드릴을 사용하여 측두골. 일반적인 혈액 - 뇌 혈관 서명 (18, 19)에 따라 청각 피질의 위치를 확인합니다.
- 신중 자극 전극을 뇌에 이식되는 위치에서 마이크로 메스 경질의 절개를. 경질 눈물이 기본 neuropil의 손상을 금지 할 때까지 부드럽게 표면을 따라 이동합니다.
- 미세 조작기의 통제하에 자극 배열을 삽입합니다. 경막 어레이는 관심 영역 위에 배치 될 수 있도록 삽입 접선 각도를 선택. 삽입 각도와 위치 및 자극의 목적 사이트에 따라주의 깊게 삽입 깊이를 고려한다.
- 초 미세 조작기로 관심 영역 (여기 청각 피질)을 포함하는 뇌 표면에 좋은 접촉과 경막 외 표면 기록 배열을 놓습니다. 배열이 경질을 들여하지 피질의 곡률과 일치주의하십시오.
- 전극 배열과 플러그 모두를 흥분시키는두개골에 치과 아크릴과 하우징.
- 커버 치과 아크릴과 살균 윤활제 (예를 들어, KY 젤리)와 가까운 개두술과 대뇌 피질의 표면에 노출 (예를 들어, Paladur, 헤라우스 Ulzer). 중합 열을 생성 할 수 있음을 유의하십시오. 이 조직 손상을 일으킬 수 있으므로, 치과 아크릴 및 대뇌 피질 표면의 접촉을 방지하기 위해 neuropil 및 치과 아크릴 사이에 충분한 윤활제를 사용합니다.
- 현재 동물 어떤 추가 절차가 시작되기 전에 회수 할 수있다. 복구 시간은 종 (: ≥3 일, 마우스 : ≥7 일 예를 들어, 게르 빌 루스 쥐) 사이에 다를 수 있습니다. 신중 동물의 상태를 모니터링하고 다음 일 진통 치료 주면 적용 (예를 들어, 멜 록시 캄, 1 ㎎ / ㎏ 수술후 및 수술 후 24 시간).
ICMS 같은 조건 자극을 사용하여 3. 양방향 셔틀 박스 디자인
- 셔틀 박스 훈련
- (C 셔틀 상자를 배치예를 들어 ustom 빌드 또는 상용 제품, 음향 및 전기적 차폐 실 E10-E15, 쿨본 (Coulbourn) 악기). 상자가 장애물에 의해 분리 된 두 개의 구획이 포함되어 있습니다. 갈-반응의 행동 바이어스에 영향을 미친다로 장애물의 높이를 고려한다. 특정 종에 대한 적절한 높이를 사용 (예를 들어, ~ 쥐 2cm ~ 게르 빌 루스 쥐에 대한 3cm).
- 발 충격 (미국)를 적용하려면 조사 12,15 아래에있는 종에 해당하는 바 사이의 거리 그리드 바닥을 사용합니다. 항상 아무것도 전기적으로 개별 바 (대변, 머리카락, 전극 크림을) 바로 가기 없음을주의하십시오.
- 동물 (2.17 참조)의 상당한 회복 시간 후, 바람직하게는 임의의 단기 마취를 이용하지 않고 기록 및 자극 케이블 피사체를 연결한다. 수건으로 동물을 충당하기 위해 시도하고 부드럽게 손에 동물을. 다른 손으로 동물의 머리와 커넥터를 폭로하고 케이블을 연결합니다. 동물이 각 세션의 시작하기 전에 3 분 동안 교육 실에 길들을 허용합니다.
- 교육 세션 당 90 시험 - (1-2 일) (30) 사이에 적용 할 수 있습니다. 사용 시험 최대 15 초 지속 시간, 25 사이에 무작위로 변화 간 시험 간격 - 30 초.
- 자극 전극하도록 조정 ICMS 자극을 전달하기 위해 (예를 들어, MCS STG2000) 멀티 자극기를 사용한다. 200 μs 위상 지속 시간을 펄스 트레인 (예를 들어, MS (300)의 길이, 100 PPS) 이상성, 전하 균형 펄스 (제 1 음극) 적용, 뇌 조직에 손상을주지 않고 행동 효과를 얻었다. 4 초 (관찰 창)의 지속 시간 700 ms의 일시 정지와 함께 기차를 반복합니다.
- 청각 CS를 제시하는 아날로그 출력 PCI 보드 (예를 들어, NI의 PCI-6733)를 사용한다. 유연하게 제어하고 디지털 출력 라인을 통해 셔틀 박스 시스템을 하드웨어 트리거 matlab에 이러한 디바이스를 프로그램.
- 행 1~ 아날로그 출력 신호오디오 앰프를 통해 전자 셔틀 박스 스피커.
- 조건부 제공 그리드 바닥을 통해 미국에 발을 충격. 최적의 전기 생리 기록 품질을 위해, 두 번째 하이 엔드 멀티 채널 자극기 (MCS STG2000)에 의해 충격을 생성합니다.
- 만 연사 + 자극 현재 탐지 훈련을 적용합니다. 여기에, 테스트 시험 (~ 10 %) 사이에 산재 CS 미국없이 본 빈 시험은 바이어스 셔틀 행동 (3.2 참조)을 보정한다. 더 까다로운 작업의 경우, CS + 및 무작위 순서로 같은 세션에서 발표 CS-자극을 구별하기 위해 동물을 훈련.
- 히트 응답으로 4 초 (CR)의 중요한 시간 창 내에서 CS + 발병 후 구획의 변화를 분류. 중요한 시간 창 (미스)에서 CR없이 연사 + 시험에서 즉시 무조건 자극 (US)로 6 ~ 10 초 동안 가벼운 발 충격을 제공합니다.
참고 : 반복적 인 CS + 자극 미국과 중첩 동물에 대한 학습 노력을 줄일 수ND (설명을 참조, '추적'조절 대 '지연') 학습 속도와 성능을 향상시킬 수 있습니다. - CS-시험의 경우, 중요한 시간 창 거짓 경보 응답 내 구획 변경을 분류, 즉시이 부적절 CR 후 최대 10 초 동안 미국을 적용합니다. 동물이 중요한 시간 창 동안 구획 (NO CR)에 체류 할 때 CS-후 미국을 적용하고,이 시험을 같은 올바른 거부를 분류하지 마십시오.
참고 : 동물이 (탈출)에 대한 응답으로 구획을 변경할 때 중요한 것은, 발, 미국은 항상 꺼져 충격. 이 CR을 억제하는 동물로 높은 노력을 제공한다으로이 더 보수적 인 학습 기준을 부과하지만, 반복적 인 conditioned 자극을 사용하는 경우 CS-시험, 예를 들어, 더 긴 중요한 시간 창을 사용합니다. - CS와 미국의 효과적인 연관에 대해 혐오하지만 고통스럽지되기 위해 적당한 범위에서 충격 강도를 조정합니다. 최적의 initiaL 현재 강도는 종 사이의 차이 (예를 들어, 마우스 50 μA, 게르 빌 루스 쥐 200 μA). 따라서, 더 기술적 인 세부 사항에 대한 다음 두 글 머리 기호를 참조하십시오
- 개별적 온화한 진폭 (모래 쥐 ~ 200 μA)로 시작하는 제 1 트레이닝 세션에서 충격 강도를 적응. 발 충격 강도가 너무 낮 으면 CS 및 US가 최적이 아닌 사이, 지연 지터와 관련하여 탈출.
- 동물 목소리를하고 CS에 대한 응답으로 동결하기 시작하면 항상주의를 기울입니다. 이 경우 footshock 강도가 너무 높습니다. 이 conditioned 공포 반응은 회피 학습을 방해한다.
- 조심스럽게 탈출 대기 시간을 결정합니다. 단계별 탈출 대기 시간은 처음 20 시험 후 2 초보다 긴 경우 발 충격 강도를 높입니다. 동물 즉 충격 제어, 아래의 경우 모든 훈련 후 확인, 그것은 상당히 2 초 이하로 대기 시간을 탈출 보여줍니다.
참고 : 그러나, 발을 증가 방지높은 응력 동물의 행동 전략은 순수한 탈출 응답에 다시 떨어질 수 있기 때문에, 너무 빨리 힘을 충격. US의 진폭을 조정하면서 따라서 밀접하게 동작하고, 특히 응답 대기 시간을 관찰한다. 예를 들어 그림 3E를 참조하십시오. - 동물이 CR을 표시하는 경우, 즉시 CS의 프리젠 테이션을 중지합니다. 이것은 회피 반응의 강화에 매우 중요하다.
- 동물 회피 전략, 즉 획득 한 경우, 심리 분석을 수행 할 수있는 매개 변수 (ICMS의 진폭, 위상 지속 시간, 반복 속도 등), 모든 CS에 적합한 CR을 보여 달라. 그러나 학습과 적응을 유도 할 것이다 미국의 페어링과 블록 단위의 방식으로 파라 메트릭 CS 변화를 적용합니다.
- 이 문제를 방지하려면, 원래 훈련의 15 ~ 30 시험 시작 후 무작위로 원래의 CS의와 정규 교육 시험 사이의 테스트 시험으로 미국없이 CS 변화를 흩뿌 리다. 최대한 U시험 시험 자체 25 %.
- 교육 후 교육 실에서 동물을 제거하고 조심스럽게 다음 동물의 훈련 전에 완전한 상자를 청소합니다. 자연 냄새가 훈련 성능을 방해 할 수 있으므로, 동일한 상자에 한 번에 다른 종을 훈련하지 않도록하십시오.
- 훈련 데이터 분석
- 습관화 단계에서 모든 구획 변경 사항을 기록합니다.
- (ITS) 응답 (미스 다시 셔틀 허위 경보 후) 및 자연 intertrial 셔틀 탈출, 훈련 동안 모든 구획 변경 사항을 기록하고 안타 잘못된 경보로 나눕니다.
- 다음과 같이 CS + 및 CS-에 대한 CR 비율 계산 : 적중률 = hits / CS + 시련의 수를; 허위 경보 율 = 거짓 경보 / CS - 시련의 수입니다.
- 세션 현명한 CR 속도를 얻습니다. 그러나, 더 높은 시간 해상도로 학습 동력학을 평가하기 (CS + 및 CS- 시험 동일한 수의 짧은 블록에서 CR 요금을 계산할
- 교육 진행 및 학습 역학을 평가하기위한 세션 또는 시험 블록의 함수로 플롯 CR 속도.
- 동물의 반응을 편향 실험 조건 독립적 행동 민감성의 정량, 신호 검출 이론에 기초 8,9,17 D '값을 도출.
- 해당 히트 및 허위 경보 율 (차별 학습) 또는 이러한 Z-점수를 표준 정규 분포 함수의 역함수에서 파생 된 요금과 ITS (검출 학습) 공격 및 빼기의 D '분석 사용 Z-점수하십시오. D의 자극 검출 '= 1.0, 소음 위의 하나의 표준 편차의 신호 강도에 대응하기위한 임계 값 기준을 설정합니다. 예를 들어 그림 3을 참조하십시오.
- 또한 CR-을 결정하고 (CS 발병 및 행동 사이의 응답 시간을 측정하여 전체 구획을 다른 CS에 응답하여 반응 시간을 탈출)로 변경합니다.
- 셔틀 상자 동작을 찍고에서 자세한 행동 분석을 얻습니다. 비디오 오디오 트레이스에 셔틀 박스 또는 자극 시스템에서 트리거 펄스를 기록하여, 기록 시스템과 비디오 사이의 시간 동기화를 달성한다. 비디오 분석은 CR 앞에 동물의 엉덩이의 관심과 배향 응답 할 수 있습니다.
학습 동물 생체 전기 생리 기술 4.
- 훈련 도중 전기 생리 기록
- 훈련하는 동안, 여러 전극에서 공통 기준 / 접지 전극에 대해 monopolarly (설명 ECOG-배열, 예를 들어) 전기 생리 신호를 기록한다.
- headstage 증폭기에 모든 전극으로부터 공급 신호는 직접 또는 헤드 커넥터에 짧은 어댑터를 통해 연결.
- 포장 얇고 유연한 케이블 하네스를 통해 메인 앰프 headstage 연결금속으로 동물을 물고 손상으로부터 보호하기 위해 메쉬.
주 : 케이블 하네스에 기계적 스트레스가 더 상자에 동물의 자유로운 이동과 회전을 허용하는 스프링에 의해 완화 될 수있다. 이상적인 전형 및 모터 회전의 사용이다. 청각 실험은 방음 챔버 외부 회전을 걸거나 사운드 그러나, 그 모터에 의해 생성 된 고주파 청각 소음을 줄이기 위해 거품을 보호. - 신호 - 대 - 잡음 비율 및 대역 통과가 원하는 주파수 범위에서 신호를 필터링 증가 차폐 박스 전치를 사용한다.
- (로컬 필드 가능성 녹음 용) 이상 1 kHz 샘플링 주파수 (활동 전위 기록에 대한) 적어도 40 kHz에서의 샘플 데이터와 오프라인 분석을 위해 PC에 저장합니다. 두 가지 유형에 적합한 필터 설정을 사용합니다 (예 : 2 - 로컬 필드 가능성에 대한 300 Hz에서 300 - 활동 전위에 대한 4,000 Hz에서).
- 신중 t 시작 전에 녹화 품질을 확인(소음이나 움직임 유물) 비가 없습니다. 50 Hz에서 노이즈의 진폭을 결정하는 신호에 온라인 FFT 필터를 적용한다. 필요한 경우 헤드 커넥터 사이의 모든 연결을 두 번 확인, 어댑터, headstages, 케이블 하네스, 그리고 앰프.
- 전기 자극에 의해 유발 기록 된 데이터에 유물의 감소를 들어 5 ~까지 MS 각 펄스의 발병 후 1 밀리 초 전에 이슈의 영향을받는 모든 데이터 포인트를 재구성하기 위해 보간 절차를 사용합니다. 이 경우, 영향을받지 데이터 포인트 사이에 0을 삽입하고 보간 점과 이상 값 (matlab에의 interp.m 기능) 사이의 평균 제곱 오차를 최소화하는 대칭 FIR 필터를 적용합니다. 별도로 추가 분석 (9) 전에 각 채널에서, 원시 신호에이 절차를 적용합니다.
- 병렬 셔틀 상자 훈련, ICMS, 기록의 기술 세부 사항
- 일반적으로, 동물 상자 surroundi에서 편안 보장NG. 동물이 자유롭게 이동하고 상자의 모든 구석에 도달 할 수 있습니다. 첫 번째 훈련 (20 분) 및 각 세션 전에 (3 분) 전에 하루를 길들 수있는 충분한 시간이 도움이됩니다.
- 어떤 수술 적 치료 후, 동물 충분한 시간 (2.17 위 참조) 필요한 경우를 포함하여 약을 복구하고 동물이 고통을 고통의 전형적인 증상 (눈을 감 으면, 무기력 표현형, 초라한 모피를 표시하지 않는 경우, 단지 동물을 훈련을 시작할 수 있도록 20).
- 그리드 바닥의 적절한 전기 접지를 확인합니다. 기록 시스템, 셔틀 박스 및 동물 사이의 접지 루프는 피해야한다. 부동 전압에서 gridfloor를 떠나, 단지 그것의 공통 접지 전극을 통해 동물을 접지합니다.
- 모터 회전의 별도의 라인을 통해 이식 자극 전극 배열의 헤드 커넥터에 멀티 채널 자극기 (MCS STG2000)를 연결합니다.
- 지상으로 기록의 공통 접지 전극을 사용하거나 I에 대한 전극을 반환CMS뿐만 아니라.
전극의 위치 5. 조직 학적 분석
- 전체 훈련 설정에 따라, 조직 학적 분석에 의한 자극 전극 배열의 안정적인 위치를 제어 할 수 있습니다.
- 0.9 % 염화 나트륨 멸균 희석 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 혼합물의 IP 주입하여 동물을 마취. 이어서 주입 (8)의 위치에 조직 철 침전물을 수득 모든 자극 채널을 통해 전달되는 전류 음극 모노 폴라 (60 초 동안 30 μA)를 적용한다.
- 이 절차에 따라, 안락사의 적절한 승인 방법 (100 ㎎ / ㎏ 펜토 바르 비탈의 과다 복용의 예 복강 내 주사)에 의해 동물을 희생.
- 바로 동물의 뇌를 제거하고 2 메틸 부탄에서 동결은 액체 질소에 ° C ~ -70으로 냉각.
- 이제 50 μm의 시간에 그라 이오 스탯 마이크로톰에 관심 영역을 잘라orizontal 섹션.
- 조직학 : Nissl와 "프 러시안 블루"-staining
- 대뇌 피질의 층의 식별을 위해 Nissl - 염색 초마다 조각을 취급합니다. 먼저, 슬라이스을 0.05 M 나트륨 아세테이트 삼수화물 완충액 (pH 4.0 -4.2)에서 5 분간 입욕.
- 5 % 크레 실 바이올렛 아세테이트 10 분 - 5 조각을 목욕. 증류수로 조각을 씻어.
- 0.05 M 나트륨 아세테이트 트리 히드 레이트 완충액 (pH 4.0-4.2)에서 2 분간 연속적 대한 슬라이스 목욕, 각각 50 %, 70 % 및 90 % 에탄올의 용액이다.
- 이소프로판올에 두 번 조각을 목욕 : 96 % 에탄올 (2 : 1) 5 분 각각.
- 마지막 5 분 동안 Roticlear 세 번 슬라이스 목욕.
- 눈에 보이는 실험 후 긴 단상 전류에 의해 유발 철 침착하게 다른 모든 조각의 "프 러시안 블루"-staining에 의해 자극 채널의 위치를 얻습니다.
- 1 % 칼륨 hexacyanoferrat의 새로운 솔루션을 준비합니다 (II) 수화물 K 4[의 Fe (CN) 6] K의 4 2g을 혼합하여 [의 Fe (CN) 6], 1 %의 HCl 200ml에.
- 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.4)의 800 ML을 추가합니다.
- hexacyanoferrat 용액에 10 분 동안 증류수에 10 분 동안 뇌 조각을 목욕합니다.
- 0.1 M 인산염 완충액에서 10 분간 증류수에서 마지막 5 분 동안 두번 슬라이스 목욕.
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Representative Results
이 섹션에서는 몽골 햄스터에서 셔틀 박스 학습의 대표적인 예를 보여줍니다. 피사체는 두 전극 사이의 자극 ICMS 사이트 청각 피질에서 서로 떨어져 700 μm의 주입을 구별하도록 훈련시켰다 (도 1 및도 2). 자극 어레이는 서로 다른 공간 디자인 (그림 1)에서 사용자 정의 할 수 있습니다. 여기, 두 ICMS 사이트의 차별 30 CS + 및 CS - 각 (그림 3A-C)의 프리젠 테이션이 3 훈련에서 배운했다. 이 7 연속 교육 세션 (그림 3B)에 걸쳐 히트 거짓 경보 응답의 CR 속도를 안정적으로 유의 한 차이로 표시됩니다. 이에 대응하여, D는 '>이 세션 (그림 3C)에서 1입니다. 그들은 효과적인 혐오 무조건 반응을 반영하는 바와 같이 미국을 향해 빠른 탈출 대기 시간은 기본이다. 이는 200에서 발 충격 강도를 적용하여 보장 될 수# 181; 탈출 대기 시간까지 50 μA 단계 (그림 3 E 참조) 짧다. 병행, ECOG-배열에서 전기 생리 녹음 ~ 700 μm의 (그림 4)로 구분 자극 사이트에서 intracortical 전기 CS + 또는 CS-에 의해 유발 된 사이트 별 시공간 활성화 패턴을 평가 할 수 있습니다.
1. 전극 어레이 설계 도표. 피질에서 두 개의 서로 다른 사이트에서 intracortical 미세 자극에 대한 () 깊이 어레이 (2 × 1). 전극 ~ 700 ㎛, 전극 간 거리를두고 배치된다. 다른 공간 디자인 예를 청각 피질 (8)의 tonotopic 그라데이션으로, 다른 대뇌 피질의 깊이 또는 대뇌 피질 조직의 특정 축을 따라 자극 사이트와 측면 배열에서 레이어에 의존하는 지역 ICMS을 허용 할 수 있습니다. (B) 경막 외 마취의 표면 처높은 공간 해상도에서 electrocorticogram의 기록에 대한 CE 배열 (× 6 3). 전극은 스테인레스 스틸 와이어 ~ 600 μm의의 간 거리를 3 × 6 행렬로 배열 (O 256 μm의)에서 만들어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이식 자극과 기록 전극의 그림 2. 위치. (A) 두 자극 전극 (그림 1A 참조) (S1) (짙은 녹색)과 S2 (밝은 녹색) 입력 층 4에 가까운 오른쪽 차 청각 필드 AI의 깊이로 이식의 쌍. 전극 팁은 ~ 700 μm의의 간 거리와 rostrocaudal 축 (꼬리 전극 (S1), 주동이의 전극 S2)를 따라 배치 할 수 있습니다. 3 × 6 ECOG 기록어레이 (600 μm의의 전극 간 거리) 오른쪽 AI 위에 경막 중심된다. (B) 실험 절차는 두 개의 작은 병변 (화살표)를 표시 한 후, 각 뇌 영역의 수평 단면을 Nissl 염색, 두 주입 자극 전극의 선단에 의해 야기 된 시간적 피질 내의 그들의 위치를 나타낸다. 위치는 상기 "감청"염색으로 평가 될 수있다. 이 그림에서 Deliano 등. 수정 된 2009 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 셔틀 박스 훈련 데이터와 하나의 개별 동물의 분석. 오른쪽 (A) 도식은 양방향 셔틀 박스 discriminati에서 작업 CS +에 대한 설계 및 CS - 실험을 설명작업 및 행동 결과에. (B) 학습 곡선은 개별 교육 세션의 히트 거짓 경보 비율로 꾸몄다. 히트 및 허위 경보 율 사이의 유의 한 차이는 별표 (게임 - 하웰 시험, P로 표시됩니다 <0.05). (C) 감도 인덱스 D '> (1) (3.2.7 참조) 성공적으로 차별에 대한 임계 값 기준으로 사용할 수있다. (D를 습관화 단계에서 자발적인 횡단의) 모니터링은 일반적으로 세션을 통해 감소를 보여줍니다. (E) 응답 대기 시간을 연사 + 시험은 모든 교육 세션을 통해 개별 시험에 대한 플롯되는 동안. 6 초 이하 대기 시간에 모든 응답이 성공적으로 히트 응답에 해당합니다. 첫 번째 세션의 첫 번째 절반 이상 탈출 대기 시간이 있습니다. 증가 후 발 충격 강도 탈출 대기 시간이 충분한 충격 제어를 나타내는 미국 발병 후 2 초 이하로 감소했다. 응답 대기 시간의 히스토그램 (오른쪽 삽입은) bimod된다응답 (<6 초) 공격과 응답 탈출에 해당하는 알. (6-8 초) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
학습 동물 4에 병렬 전기 생리 녹음을 그림. 하나의 동물에서 (A) 전기 유발 전위 (EEP)의 전형적인 예는 교육의 하나의 세션에서 CS + 시련에 걸쳐 평균. 데이터는 ECOG 배열에서 기록되었다. 그림은 (검정) 전 단일 펄스 자극 아티팩트 (빨간색)을 제거한 후 EEP 추적을 비교합니다. 아티팩트 감소의 세부 사항은 섹션 4.1.7을 참조하십시오. 초기의 저명한 음의 피크 (20) MS (N20)의 대기 시간에 볼 수 있습니다. (B) t에서 CS +에 응답 N20 진폭의 공간 분포의 추가 분석그는 꼬리 자극 전극 (하단) 청각 피질 전체에 유발 된 상태의 공간 해상도를 공개에 자극 전극 (위)와 CS-에를 주동이. 기록 배열에 대해 해부학 적 방향을 화살표로 표시됩니다 (; C, 꼬리, L, 측면, M, 중간, R, 주동이, D, 지느러미 V, 복부). 이 그림에서 Deliano 등. 수정 된 2009 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 양방향 혐오 발 충격 제어 셔틀 박스 시스템을 사용하여 동물의 학습 동시 부위 특이 ICMS 및 멀티 채널의 전기 생리 학적 기록 방법을 설명한다. 프로토콜은 조합에 대한 기술 핵심 개념을 강조하고, 단지 그것의 공통 접지 전극을 통해 동물을 접지 부동 전압에서 gridfloor을 떠날의 중요성을 지적한다. 이 동물의 청각 피질의 학습 관련 플라스틱 재구성이 광범위하게 8,12,14,15,21,22 연구되고있다 여기에, 청각 셔틀 박스 학습 몽골 게르 빌 루스 쥐에 적용 하였다. 그럼에도 불구하고, 설명 프로토콜 인스턴스 마우스 (16) 같은 다른 설치류 종에 작은 변화로 적용 할 수 있습니다. 이 점에서이 종 특이 수술 (2.17) 후 복구 시간에 관한 적응, 장애물 (2.1.1) 및 개별 동물의 발 충격 감도의 높이, HIG 할 수있는 고려하는 것이 중요하다hly 변수 (3.1.3-3.1.6).
프로토콜은 또한 주문품 전극 설계가 동시 다중 전극 전기 생리 레코딩 8,23의 분석으로부터 유도 된 바와 같이 별개의 네트워크 활성화 선도 피질 조직에서의 다른 부위를 자극 할 수있는 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 전극의 거리에 따라 하나의 인스턴스 지형도 9의 다른 지역을 자극 할 수 있습니다. 차동 대뇌 피질의 입력 층 III-IV의 자극에 의해 대뇌 피질의 더 넓은 확산 활성화로 이어지는 장거리 corticocortical 전망을 활성화 층 의존 ICMS을 적용하여 것이 가능하다. 대신, corticoefferent 출력 층 V-VI에 자극이 intracortical 및 corticothalamic 피드백 회로 (8)의 훨씬 더 초점 활성화되었다. 둘 또는 그 이상의 자극 전극에 자극 배열을 사용하는 경우, 바이폴라 ICMS 대신 폴라 ICMS으로 적용될 수있다. 바이폴라 자극 모드 더효과적으로 바람직 비평 섬유 (24)와 비교하여 캐소드 극의 방향으로, 전극의 끝과 평행하게 실행하는 신경 섬유를 모집하고 있습니다. 이러한 자극 구성 때문에 유발 된 신경 네트워크 활성화 (8)의 방향 특이성을 증가시킨다. ICMS 8,9를 사용하여 대뇌 피질의 추궁 네트워크 활동이 특히 직접 조작은, 지금까지 다른 기술 3으로 표시되지 않았다. 이 방법의 전력을 예를 들어, 최근 리포트 intracortical 전기 자극 (8)의 검출을 이용하여 인식 학습에 cortico-thalamocortical 피드백 회로의 기여를 풀어. 이것은 직접 대뇌 피질의 미세 자극 지정한 신경 회로와 행동 1,3,11,25에 링크 활동을 인과 적 효과적이고 최첨단 방법이라고 설명한다. 대뇌 피질의 지역의 지역의 전기 자극이 이달에 관해서는, 특정 지형지도 기능에 대응하여청각 피질에서 tonotopic 지역을 ANCE, 주제는 중앙 전기 또는 말초 감각 자극에 의해 유도 지각 표상의 특성을 비교하기 위해 전송 학습 패러다임에서 훈련 할 수있다. 이러한 실험은 감각 피질 자극 neuroprostheses 5,9위한 전략의 개발을 자극 할 수도있다. 이 프로토콜은 또한 증정 처리 및 깊은 뇌 자극 (26)의 토대 신경 연구를, 예를 복측 피개 영역으로서, 다른 뇌 영역의 전기적 자극에 이용 될 수있다. 효과적인 미세 자극에 대해 긴급 사용되는 개인 설정 및 전극의 배경에 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 세부 사항입니다. 일반적으로, 자극 매개 변수의 영향 등 자극 진폭, 극성, 전극 방향처럼, 11,24을 검토하고있다. 중요도의 전극에 의해 전하 전송이다. 전극의 임피던스는 따라서 매우 중요한 요소이다. 따라서, 그 T를 확인그 전극 접점의 임피던스는 주입 전에 kΩ의 범위에있다.
학습의 몇 가지 추가 현상이 설명 된 기본 설계의 적절한 변화에 의해 공부하실 수 있습니다. 예를 들어, 간단한 검출 학습 대조적 학습 판별이 각각 14, 15, 및 이동 노고 응답과 연관되는 2 개 이상의 자극을 도입하여 조사 할 수있다. 마찬가지로 범주 형성 학습이 같은 차별을 결합하여 연구 할 수는 12,21 패러다임. 셔틀 박스 패러다임은 또한 작업 메모리, 행동 억제 14,17 또는 설정과 이동을 성공적으로 반전 학습에 필요한 인스턴스인지 적 유연성을 조사하기 위해 이용 될 수있다. 작업 메모리는 '지연'과 '추적'조절을 비교하여 평가할 수있다. '지연'조화 (27)에서, CS는 CS의 사이에 지체없이 중요한 CS-미국 시간 창을 통해 제시FSET 미국 개시. '추적'컨디셔닝 한편, 과도 CS 프레젠테이션 오프셋 후 수초의 지연이 존재한다. '지연'에어컨과는 달리 '추적'에어컨이 작동 메모리와 대뇌 피질의 처리에 높은 부하를 넣습니다. 지속적인 electrocorticogram의 시공간 패턴 분석과 차별적 셔틀 박스 학습 패러다임을 결합, 청각 자극 차별 9 관련된 피질 및 범주 형성 (21)의 동적 상태를 식별 할 수있는 적절한 방법이다. 셔틀 상자 훈련은 고전 양방향 회피 작업으로 사용하지만, 회피 학습과 일반 개념 문제는 이러한 행동 설계의 모든 신청 않는다; 즉 그 성공적인 회피 동작을 명시 적 보강제로서 기능 자극의 발생을 방지한다. Appetitive 보강, 중뇌 보상 회로의 직접적인 전기 자극에 의해, 예를 들어, 유일한 비를 갖는다N은 일부 연구 (26) 학습 셔틀 상자에 적용. 또한, 셔틀 박스 학습은 주로 설치류 종에 사용 된 거의 인스턴스 개로서, 더 큰 실험 동물에 적용되었습니다.
전기 생리 학적 분석 외에, 셔틀 박스 학습 약리학 적 개입은 또한 8, 17, 병변 기법 15, 28 미세 투석 또는 optogenetics와 결합 될 수있다. 특히, 하나의 모델 시스템 (즉, 몽골 모래 쥐)의 바이러스 감염에 의해, 또는 유전자 변형 동물 optogenetic 도구와의 프로토콜의 조합을, 마우스로, 특히 대뇌 피질 포함한 인공 신경 활성화 셀룰러 서브 타입 특이성을 높이기 위해 허용 ICMS (3)를 사용하여 액세스 할 수 없습니다 억제.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
작업은 Deustche Forschungsgemeinschaft DFG 및 신경 생물학에 대한 라이프니츠 - 연구소의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 기술 지원을 마리아 - 마리나 Zempeltzi과 캐더린 OHL 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
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