Summary
Shuttle-box undgåelse læring veletableret i biologisk psykologi. Denne protokol beskriver, hvordan shuttle-box læring i gnavere kan kombineres med stedsspecifik elektrisk intracortical microstimulation (ICMS) og samtidig kronisk in vivo optagelser som et redskab til at studere flere aspekter af læring og perception.
Abstract
Shuttle-box undgåelse læring er en veletableret metode i biologisk psykologi og forsøgsopstillinger var traditionelt skræddersyet; det nødvendige udstyr er nu tilgængelig med flere kommercielle selskaber. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af en to-vejs shuttle-box undgåelse læring i gnavere (her mongolske ørkenrotter, Meriones unguiculatus) i kombination med stedsspecifik elektrisk intracortical microstimulation (ICMS) og samtidige kroniske elektrofysiologiske in vivo optagelser. Den detaljerede protokol gælder at studere flere aspekter af læring adfærd og opfattelse i forskellige gnavere.
Site-specifikke ICMS af auditive kortikale kredsløb som aircondition stimuli her bruges som et værktøj til at teste perceptuelle relevans af specifikke afferent, efferent og intracortical forbindelser. Tydelige aktivering mønstre kan fremkaldes ved hjælp af forskellige stimulationselektrode arrays for lokale, lag-afhængige ICMS eller fjerne ICMS sites. Ved hjælp af adfærdsmæssige analyse detekteringssignal kan det afgøres, hvilken stimulering strategi er mest effektive til fremkaldelse af en adfærdsmæssigt påviseligt og iøjnefaldende signal. Endvidere parallelle multikanal-optagelser ved hjælp af forskellige elektrode design (overfladeelektroder, dybde elektroder, etc.) giver mulighed for at undersøge neuronale observable over tidsforløbet af sådanne læreprocesser. Det vil blive diskuteret, hvordan ændringer i den adfærdsmæssige design kan øge kognitive kompleksitet (f.eks afsløring, diskrimination, tilbageførsel læring).
Introduction
En grundlæggende formål med adfærdsmæssige neurovidenskab er at fastsætte specifikke forbindelser mellem neuronale strukturelle og funktionelle egenskaber, læring og perception. Neurale aktivitet i forbindelse med perception og læring kan studeres ved elektrofysiologiske registrering af aktionspotentialer og lokale feltpotentialer i forskellige hjerne strukturer på flere steder. Ud fra følgende betragtninger elektrofysiologiske optagelser giver korrelative sammenhænge mellem neurale aktivitet og adfærd, har direkte elektrisk intracortical microstimulation (ICMS) i over et århundrede været den mest direkte metode til test årsagssammenhænge af ophidsede populationer af neuroner og deres adfærdsmæssige og perceptuelle effekter 1 - 3. Mange undersøgelser har vist, at dyrene er i stand til at gøre brug af forskellige rumlige og tidslige egenskaber af elektriske stimuli i perceptuelle opgaver afhængigt af stimulering stedet inden for eksempelvis retinotopisk 4, tonotopic 5 eller somatotopic 6 regioner i cortex. Opformering af elektrisk fremkaldte aktivitet i cortex er hovedsageligt bestemt af layoutet af axonale fibre og deres fordelt synaptisk konnektivitet 2, at det i cortex, er helt klart lag-afhængig 7. Den resulterende polysynaptiske aktivering fremkaldt af ICMS er fremover langt mere udbredt, end de direkte virkninger af det elektriske felt 2,8,9. Dette forklarer, hvorfor tærskler for perceptuelle effekter fremkaldt af intracortical microstimulation kan være kraftigt lag-afhængige 8,10,11 og stedafhængige 9. En nylig undersøgelse viste, i detaljer, at stimulation af øvre lag gav mere udbredt aktivering af corticocortical kredsløb i primært supragranular lag, mens stimulation af dybere lag af cortex resultat i et samlingspunkt, tilbagevendende corticoefferent intracolumnar aktivering. Parallelle adfærdsmæssige eksperimenter viste, at sidstnævnte har meget lavere perceptuelle afsløring thresholds 8. Derfor blev den fordel stedspecifikke ICMS som betinget stimuli udnyttes i kombination med elektrofysiologiske optagelser til kausalt relatere specifikke kortikale kredsløb aktiveringer 8 til adfærdsmæssige foranstaltninger for læring og perception i rumfærgen-box.
De to-vejs shuttle-box paradigme er en veletableret laboratorieudstyr til at studere undgåelse læring 12. En shuttle-box består af 2 rum adskilt af en hurdle eller døråbning. En betinget stimulus (CS), der er repræsenteret ved en egnet signal som et lys eller lyd, med betinget efterfulgt af et afskrækningsmiddel ubetinget stimulus (US), som for eksempel en stød i foden over en metalgittergulv. Emner kan lære at undgå USA ved shuttling fra en shuttle-box rum til den anden som reaktion på CS. Shuttle-box læring indebærer en sekvens af skelnes faser læring 13,14: For det førstefag lærer at forudsige USA fra CS ved klassisk konditionering og at flygte fra USA af instrumental condition, da USA er afsluttet på pendulfart. I en næste fase, lære emner for at undgå USA helt ved shuttling som reaktion på CS før US indtræden (undgåelse reaktion). Generelt shuttle-box læring indebærer klassisk konditionering, instrumental condition, samt målrettet adfærd afhængig af at lære fase 14.
Rumfærgen-boksen procedure kan sættes op så let og generelt producerer robust opførsel efter et par daglige træningssessioner 15 - 17. Ud over simpel undgåelse conditioning (påvisning), kan rumfærgen-box yderligere bruges til at studere stimulus diskrimination ved at ansætte go / Nogo paradigmer. Her bliver dyr uddannet til at undgå USA med en betinget respons (CR) (gå adfærd shuttle til modsatte rum) som reaktion på en <strong> go-stimulus (CS +) og ved Nogo adfærd (ophold i den aktuelle rum, ingen CR) som reaktion på en Nogo-stimulus (CS) Parallel microstimulation og registrering af neurale aktivitet med høj densitet multielectrode arrays tillader at studere. de fysiologiske mekanismer, der ligger til grund vellykket læring. Flere tekniske detaljer, der er grundlæggende for de succesfulde kombinationer af shuttle-box uddannelse, ICMS og parallel elektrofysiologi, vil blive diskuteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter præsenteres i dette arbejde blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder defineret af den tyske lov om beskyttelse af forsøgsdyr. Eksperimenter blev godkendt af den etiske komité i staten Sachsen-Anhalt.
1. Skræddersyede Multikanal Elektrode Arrays til microstimulation og indspilning
- Skræddersyede microstimulation vifte
- For at levere ICMS, forberede stimulation elektroderne i den ønskede rumdesign (her lateral vifte af 2 kanaler) ved hjælp af 3-cm lange Teflon-isoleret rustfri ståltråde (Ø med isolering = 50 um). Se figur 2.
- Crimp ene ende af trådene til en han-stik-system (1,25 mm pitch).
- For en 2-kanals array med ~ 0,5 mm eller ~ 0,7 mm elektrode afstand pass ledninger vinkelret gennem to lodret linie elektronmikroskopi objekt-holder gitre (afstand på net ~ 5 mm) vejledende ledningerne (0,1654 mm pitch).
- Put mandlige ben i stikket boliger.
- Sæt elektroden i en skål med elektrolytisk opløsning (f.eks 0,9% natriumchlorid) og måle impedans på hver kanal med en respektiv impedans måleindretning (f.eks., FHC Impedans Conditioning Module). Sigt mod impedanser i 100 til 500 kohm rækkevidde.
- Hvis impedansen er for høj, leverer kort elektrisk strøm (1 sek, 1 mA) gennem kanalerne for at sænke det. Tjek impedans igen.
- Skræddersyede høj opløsning multikanal optagelse arrays
Bemærk: Denne protokol beskriver fremstilling af overflade arrays til optagelse electrocorticogram (ECoG) data. Dog kan design være skræddersyet til at opfylde kravene i de respektive forskningsspørgsmål (dybde optagelser, etc.). Høj opløsning multikanal arrays er built ved Teflon-isoleret rustfri ståltråde (Ø med isolering = 50 um) krympet til en mandlig pin-system (1,25 mm pitch).- For overfladeelektrode arrays, guide 18 tråde gennem en 3 x 6 matrix af to forberedte elektronmikroskopi objekt-indehaveren net.
- Indlejre 6 x 3 arrangement af ledningerne mellem nettene med dental akryl og sætte stifter i stikket boliger.
- Grind dental acryl i en rektangulær blok ved hjælp grinder fastgjort til en håndholdt boremaskine.
- Kontroller, at impedansen af alle kanaler (se 1.1.6) er i området mellem 100 - 500 kohm.
- Før implantation (se trin 2) grind overfladen af arrays, der svarer til konveksitet kortikale overflade.
2. kirurgisk implantation af arrays i Auditiv Cortex i bedøvet mongolske Herbils for Kronisk brug
- Hold officiel godkendelse til at udføre alle nødvendige eksperimentelle trin, der er planlagt. Wear hensigtsrelevant beskyttelsesbeklædning (frakke, sterile handsker, kirurgisk maske, hætte).
- Brug voksne mandlige mongolske hoppemus (Meriones unguiculatus) eller andre gnavere. Bær beskyttelseshandsker og pels og altid bruge steriliseret og godt identificerede kirurgiske værktøjer.
- I tilfælde af hoppemus, bedøve dyr med en IP-injektion af en blanding af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) fortyndet i 0,9% steril natriumchlorid. Oprethold ved infusion af 0,6 ml / time / kg af en blanding af ketamin komponere: xylazin: natriumchlorid (0,9%) i forholdet 9: 1: 10.
- Placer dyr på en varmeplade for at opretholde legemstemperatur ved 37 ° C ved en rektal probe feedback-system (f.eks, Verden Precision Instruments).
- Barbere pels dækker interoccipital, parietal og tidsmæssige knogler. Aseptisk forberede incisionssted med en effektiv desinfektionsmiddel (f.eks. Skiftevis Betadine eller Nolvasan og 70% alkohol scrubs 3 gange). Protect øjne mod udtørring ved øjet salve.
- Skær kraniel hud dækker interoccipital, parietal og frontal knogler ved hjælp af en skalpel og fjern periost ved forsigtigt at flytte en boremaskine i knoglen overfladen.
- Bor små huller i den kontralaterale parietal og pandeben lateral som muligt for ikke at hindre den senere hovedmonteringsindretningen. Nu skrues to knogleskruer med en diameter på ca. 1 mm stramt i hullerne. Sikre, at parietale skruen har god kontakt til dura, da det vil blive brugt som fælles reference og jord, samt returelektroden for elektrisk stimulering senere.
- Lim en lille aluminium bar medialt over frontale knogler og bruge det som hoved fiksering under implantation af en headholder.
- Fjern hud dækker musculus temporalis På den ene side ved hjælp af en saks.
- Skær den dorsale del af Tindingmusklen at få adgang til tindingebenet.
- Udsætte auditive cortex ved kraniotomi (~ 3 mm x 4 mm)tindingebenet ved hjælp af en tandlægebor. Identificer placeringen af den auditive cortex baseret på den typiske blod-hjerne-fartøj signatur 18,19.
- Gør nøje et snit af dura med en mikro skalpel på det sted, hvor stimulering elektrode implanteret i hjernen. Bevæge sig forsigtigt langs overfladen indtil dura tårer at forbyde beskadigelse af underliggende neuropil.
- Indsæt stimulation matrix under mikromanipulator kontrol. Vælg en tangentiel indføring vinkel for at tillade epidural matrix, der skal placeres over området af interesse. Afhængigt af indsættelse vinkel og position og den tilsigtede sted for stimulation, nøje overveje indstiksdybde.
- Placer epidural overflade optagelse array med god kontakt til hjernen overflade, der dækker området af interesse (her auditive cortex) af en anden mikromanipulator. Pas på, at array matcher krumning af cortex til ikke indrykke dura.
- Fiksere begge elektrodesæt og plughuse med dental acryl til kraniet.
- Cover udsatte kortikale overflade med en antiseptisk smøremiddel (f.eks KY-Jelly) og tæt kraniotomi med dental akryl (f.eks Paladur, Heraeus Ulzer). Husk på, at polymerisering kan producere varme. Brug tilstrækkelig smøremiddel mellem neuropil og dental akryl til at forhindre enhver kontakt af dental akryl og den kortikale overflade, da dette kan forårsage vævsskader.
- Nu, at dyrene kan komme sig før starten af yderligere procedure. Recovery tider kan variere mellem arter (f.eks ørkenrotter: ≥3 dage, mus: ≥ 7 dage). Nøje overvåge status af dyret og give analgetisk behandling i de følgende dage, hvis det er relevant (f.eks Meloxicam; 1 mg / kg postsurgical og 24 timer efter kirurgi).
3. To-vejs Shuttle-box-design Brug ICMS som betinget stimulus
- Shuttle-box træning
- Placer en shuttle-box (custom-build eller ethvert kommercielt produkt, f.eks E10-E15, Coulbourn Instruments) i en akustisk og elektrisk afskærmet kammer. Boksen indeholder to kamre adskilt af en forhindring. Overvej højden af hurdle som den påvirker adfærdsmæssige bias go-svar. Brug passende højder for bestemte arter (fx ~ 2 cm for mus, ~ 3 cm for ørkenrotter).
- At anvende mund- chok (US), skal du bruge et gitter gulv med en afstand mellem stængerne passende for arten undersøgte 12,15. Sørg altid for, at intet elektrisk genveje de enkelte barer (afføring, hår, elektrode creme).
- Efter en betydelig genopretning tid af dyret (se 2.17), tilslut motivet til optagelsen og stimulering kabel helst uden brug af kortsigtet anæstesi. Forsøge at dække dyret med et håndklæde og forsigtigt tager dyret i hænderne. Afdække hovedet og stik af dyret med den anden hånd, og tilslut kablerne. Tillad dyr at vænne til uddannelsen kammer i 3 min før start af hver session.
- Pr træningssession (1 - 2 dagligt) gælder mellem 30-90 forsøg. Brug forsøg varigheder på op til 15 sek, og inter-forsøg intervaller, der varierer tilfældigt mellem 25-30 sek.
- For at levere ICMS for betinget stimulation til stimulation elektroderne bruger en multikanal stimulator (f.eks MCS STG2000). For at opnå adfærdsmæssige effekter uden at beskadige hjernevævet, anvender puls tog (fx 300 ms længde, 100 KKS) i bifasisk charge-balanceret pulser (katodisk først) med en 200 mikrosekunder fase varighed. Gentag tog med en pause på 700 ms til en varighed på 4 sek (observation vindue).
- Til at præsentere auditive CS bruger en analog udgang PCI bord (f.eks NI PCI-6733). Programmering af disse enheder med Matlab til fleksibelt styre og hardware-udløser shuttle-box-system via de digitale output linjer.
- Rute det analoge udgangssignal til the shuttle-box højttalere via en audio-forstærker.
- Betinget levere mund- chokere os gennem et gitter gulv. For optimal elektrofysiologisk optagekvalitet, generere chok af en anden high-end multikanal stimulator (MCS STG2000).
- At anvende uddannelsen til stede kun CS + stimuli afsløring. Her, at de nuværende tomme forsøg uden CS og US afbrudt mellem test forsøg (~ 10%) korrigere for partisk shuttle adfærd (se 3.2). For en mere krævende opgave, træne dyrene til at skelne mellem CS + og CS stimuli præsenteret i samme session i randomiserede rækkefølge.
- Klassificere et rum ændring efter CS + debut inden for et kritisk tidspunkt vindue på 4 sek (CR) som et hit svar. I CS + forsøg uden CR i den kritiske tid vindue (miss), straks levere en mild mund chok for 6 til 10 sek som ubetinget stimulus (US).
Bemærk: gentagne CS + stimulering, der overlapper med USA vil reducere læring indsats for dyr ennd forbedre læring hastighed og ydeevne (»forsinkelse« vs. 'spor' condition se diskussionen). - For CS- forsøg klassificere et rum ændring inden for den kritiske tidsvindue som falsk alarm reaktion, og anvende USA i op til 10 sek umiddelbart efter denne upassende CR. Må ikke anvendes USA efter CS når dyret forbliver i rummet (ingen CR) i den kritiske tid vinduet, og klassificere dette forsøg så korrekt afvisning.
Bemærk: Det er vigtigt, foden chokere USA er altid slukket, når dyrene ændrer rum som reaktion på det (flugt). Brug længere kritiske tidsvinduer for CS forsøg, fx, hvis der anvendes gentagne betinget stimulation, selv om dette vil pålægge en mere konservativ kriterium læring som det giver højere indsats fra dyret til at hæmme CR. - For en effektiv sammenslutning af CS og USA justere chok styrke i et moderat interval for at blive afskrækningsmiddel, men ikke smertefuldt. Optimal initial nuværende styrke varierer mellem arterne (fx 50 uA for mus, 200 uA til ørkenrotter). Derfor, se de næste to kugler for yderligere tekniske detaljer:
- Individuelt tilpasse chok styrke i den første træningssession starter med milde amplituder (~ 200 uA til ørkenrotter). Hvis mund chok styrke det er for lavt, latenstider for at slippe jitter og association mellem CS og USA ikke er optimal.
- Vær altid opmærksom, hvis dyrene begynder at vocalize og at fryse som svar på CS. I dette tilfælde fodchok styrke er for høj. Dette betinget frygt respons forstyrrer undgåelse læring.
- Bestemme forsigtigt escape ventetid. Øge mund chok styrke trin-for-trin, hvis flugt latenstider er længere end 2 sek efter de første 20 forsøg. Kontroller efter hver træning, hvis dyret er under chok kontrol, dvs, det viser latenstider for at slippe væsentligt under 2 sek.
Bemærk: Men undgå at øge fodchok styrke for hurtigt, da den adfærdsmæssige strategi af en meget stresset dyr kan falde tilbage til rene flugt svar. Derfor nøje observere adfærd og især respons latenstider mens du justerer amplituden af USA. For eksempel se figur 3E. - Hvis dyret viser CR, stop præsentation af CS samme. Dette er afgørende for en styrkelse af undgåelse respons.
- Hvis dyrene har erhvervet en undgåelse strategi, dvs vise passende CR til alle CS, varierer parametre (ICMS amplitude, fase varighed, gentagelse sats etc.) til at udføre psykometriske analyser. Påfør parametrisk CS variation i en blokvis måde med amerikanske parring, som vil dog fremkalde læring og tilpasning.
- For at undgå dette, skal du starte med 15 til 30 forsøg med den oprindelige uddannelse, og derefter tilfældigt intersperse CS variationer uden USA som test forsøg mellem de regelmæssige træning forsøg med det originale CS s. Højst uSE 25% af test forsøg.
- Efter træningen fjerne dyret fra uddannelse kammeret og omhyggeligt rense rubrik før træning af den næste dyr. Prøv at undgå at træne forskellige arter ad gangen i samme boks, som deres naturlige lugt kan forstyrre træning ydeevne.
- Analyse af træningsdata
- Registrere alle rum ændringer i tilvænning fase.
- Registrere alle rum ændringer i løbet af uddannelsen og deler sig i hits og falske alarmer, flygte reaktioner (misses og tilbage pendulfart efter en falsk alarm) og spontane interforsøgsinterval pendulfart (ITS).
- Beregn CR priser til CS + og CS som følger: hit satser = hits / antal CS + forsøg; falsk alarm satser = falske alarmer / antal CS forsøg.
- Opnå CR satser session-wise. Men for at vurdere læring dynamikken ved en højere tidsmæssig opløsning, beregne CR priser fra kortere blokke af samme antal CS + og CS forsøg (
- Plot CR satser som en funktion af sessionen eller retssag blokken for evaluering af den uddannelse fremskridt og læring dynamik.
- Til kvantificering af adfærdsmæssige følsomhed uafhængig af eksperimentelle betingelser forspænder respons af dyret, udlede d 'værdier baseret på detekteringssignal teori 8,9,17.
- For d 'analyse Brug Z-scores af tilsvarende hit og falsk alarm satser (læring forskelsbehandling) eller ramt satser og ITS (læring detektion) afledt af inverse af en standardiseret normalfordeling funktion og trække disse z-scores. Indstil en tærskelværdi kriterium for stimulus påvisning af d '= 1,0, hvilket svarer til en signalstyrke én standardafvigelse over støjen. Se figur 3 som eksempel.
- Derudover bestemme CR- og undslippe reaktionstider som reaktion på forskellige CS ved at måle tidsperioden mellem CS debut og adfærdsmæssig respons (komplet rumændres).
- Anskaf en mere detaljeret adfærdsanalyse fra videooptagelser shuttle-box adfærd. Opnå tidsmæssig synkronisering mellem video og registreringssystemer ved at optage triggerimpulser fra rumfærgen-box eller stimulering system på audio spor af videoen. Video analyse gør det muligt at vurdere opmærksomhed og orientere reaktioner af dyret forud for CR.
4. In vivo Elektrofysiologiske Teknikker i Learning Dyr
- Elektrofysiologiske optagelse under træning
- Under træningen optage elektrofysiologiske signaler (f.eks med de beskrevne ECoG-arrays) fra flere elektroder monopolarly mod fælles reference / jordelektrode.
- Feed signaler fra alle elektroder i et hovedtrin forstærker enten tilsluttes direkte eller via en kort adapter i hovedet stik.
- Slut hovedtrin til de vigtigste forstærker via et seletøj af tynde, fleksible kabler indpakketaf en metalnet at beskytte det mod skader ved at bide dyr.
Bemærk: Mekanisk stress i kablet sele kan afhjælpes ved en fjeder yderligere tillader fri bevægelighed og rotation af dyret i kassen. Ideal er brugen af en drejelig og motordrejefod. Men for auditive eksperimenter placere svirvel uden for lydisoleret kammer eller lyd skjold det med skum for at reducere den høje frekvens auditive støj fra dens motor. - Brug en forforstærker i skærm boks for at øge signal-støj-forhold og båndpasfilter signalet i det ønskede frekvensområde.
- Sample data på mere end 1 kHz samplingsfrekvens (til lokal field potentielle optagelser) og mindst 40 kHz (til handling potentiale optagelser) og gemme til pc'en for offline analyse. Brug egnede filterindstillinger for begge typer (f.eks 2-300 Hz til lokale potentiale område; 300 - 4.000 Hz for aktionspotentialer).
- Kontroller omhyggeligt kvaliteten af optagelsen før starten af tregner (ingen støj eller bevægelse artefakter). Anvend en online FFT-filter til signalet for at bestemme amplituden af 50 Hz støj. Hvis det er nødvendigt dobbelttjekke alle forbindelser mellem hoved-stik, adapterne, de headstages, kabeltræet og forstærkere.
- For reduktion af artefakter i de registrerede data fremkaldt ved elektrisk stimulering anvende en interpolation procedure at rekonstruere alle datapunkter berørt af artefakt 1 ms før indtil ~ 5 ms efter starten af hver impuls. For dette, indsætte nuller mellem de upåvirkede datapunkter, og anvende en symmetrisk FIR-filter, der minimerer de gennemsnitlige-square fejl mellem de interpolerede punkter og deres ideelle værdier (Matlabs interp.m funktion). Anvend denne procedure til det rå signal, separat på hver kanal, før yderligere analyse 9.
- Tekniske detaljer i parallel shuttle-box uddannelse, ICMS, og optagelse
- Generelt sikre, at dyrene føler sig trygge i kassen surrounding. Så dyret kan bevæge sig frit og nå alle hjørner af kassen. Tilstrækkelig tid til at vænne en dag før den første træning (20 min) og før hver session (3 min) er gavnligt.
- Efter enhver kirurgisk behandling, så dyret er tilstrækkelig tid til at komme, herunder medicin, hvis det er nødvendigt (se ovenfor 2.17), og begynde at træne dyret kun, hvis dyrene ikke viser nogen typiske tegn på at lide eller smerte (lukkede øjne, sløv fænotype, scruffy pels 20).
- Sikre korrekt elektrisk jordforbindelse af nettet gulvet. Jordsløjfer mellem registreringssystem, shuttle-box og dyret skal undgås. Ground dyret kun via sin fælles jordelektrode, forlader gridfloor med variabel spænding.
- Tilslut multikanal stimulator (MCS STG2000) til hovedet stikket på implanterede stimulation elektrodesættet via separate linjer af den motoriserede svirvel.
- Brug det fælles fodslag elektrode optagelse som jorden eller returnere elektrode for jegCMS, så godt.
5. Histologisk Analyse af Elektrode positioner
- Efter den samlede uddannelse sæt, kontrol for stabile position af stimulationselektrode array ved histologisk analyse.
- Bedøve dyr med en IP-injektion af en blanding af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) fortyndet i 0,9% sterilt natriumchlorid. Så gælder monopolær katodisk (30 uA til 60 sek) leveret gennem alle stimulationskanaler at opnå jernforekomst i vævet ved positionen for implantation 8.
- Efter denne procedure, ofrer dyret ved en hensigtsmæssig og godkendt metode til eutanasi (f.eks intraperitoneal injektion af en overdosis af pentobarbital, 100 mg / kg).
- Fjern hjernen af dyret straks og fryse den i 2-methylbutan afkølet til -70 ° C i flydende nitrogen.
- Nu skæres området af interesse på en kryostat mikrotom i 50 um hORISONTALE sektioner.
- Histologi: Nissl og "Prussian Blue" -staining
- Til identifikation af kortikale lag behandler hver anden skive med Nissl-farvning. Først bade skiver 5 min i 0,05 M natriumacetat-trihydrat (pH 4,0 -4,2).
- Bade skiver for 5 - 10 minutter i 5% cresylviolet acetat. Skyl skiver med destilleret vand.
- Bade udsnit til 2 min efter hinanden i 0,05 M natriumacetat-trihydrat (pH 4,0 - 4.2), og i opløsninger af 50%, 70% og 90% ethanol, henholdsvis.
- Bade skiver to gange i isopropanol: 96% ethanol (2: 1) i 5 minutter hver.
- Endelig bade skiver i Roticlear tre gange i 5 min.
- Opnå placering af stimulation kanaler ved "Prussian Blue" -staining af enhver anden skive, der gør jern deposition fremkaldt af lange monofasiske strømme efter eksperimenterne synlige.
- Forbered en frisk opløsning af 1% kalium hexacyanoferrat (II) trihydrat K 4[Fe (CN) 6] ved at blande 2 g K 4 [Fe (CN) 6] i 200 ml 1% HCI.
- Tilføj 800 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4).
- Bade hjerneskiver i 10 minutter med destilleret vand og derefter i 10 minutter i hexacyanoferrat opløsning.
- Bade skiver to gange i 10 minutter i 0,1 M phosphatbuffer og endelig i 5 minutter i destilleret vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit illustrerer et repræsentativt eksempel på shuttle-box læring i en mongolsk hoppemus. Emnet blev trænet til at skelne mellem ICMS-sted mellem to elektroder implanteret stimulation 700 um fra hinanden i cortex (figur 1 og 2). Stimulation arrays kan tilpasses i forskellige rumlige designs (Figur 1). Her blev diskrimination af de to ICMS sites lært inden for 3 træningspas med præsentation af 30 CS + og CS hver (figur 3A-C). Dette angives med en stabil signifikant forskel i CR satser hit og falsk alarm reaktioner i hele 7 på hinanden følgende træningssessioner (figur 3B). Tilsvarende, d 'er> 1 i disse sessioner (figur 3C). Hurtig flugt latenstider mod USA er grundlæggende, da de afspejler en effektiv aversiv ubetinget respons. Dette kan sikres ved at tilpasse mund chok styrke fra 200 &# 181; A i 50 uA trin indtil latenstider for at slippe er korte (se figur 3 E). Sideløbende elektrofysiologiske optagelser fra en ECoG array muligt at vurdere de stedspecifikke Spatiotemporal aktivering mønstre fremkaldt af intracortical elektriske CS + eller CS ved stimulation steder adskilt af ~ 700 um (figur 4).
Figur 1. elektrodesæt designs. (A) Dybde array (2 x 1) til intracortical microstimulation på to forskellige steder i cortex. Elektroder er anbragt i en afstand på interelectrode ~ 700 um. Andre rumlige design kan give mulighed for lag-afhængig lokale ICMS i forskellige kortikale dybder eller laterale arrays med stimulation steder langs en bestemt akse cortexvæv, som for eksempel tonotopic gradient af auditive cortex 8. (B) Epidural Surface array (3 x 6) til optagelse af electrocorticogram ved høj rumlig opløsning. Elektroder blev fremstillet af rustfrit stål tråd (Ø 256 um) arrangeret i en 3x6 matrix med en interelectrode afstand på ~ 600 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Placering af implanterede stimulering og registrering elektroder. (A) Et par to stimulation elektroder (se figur 1A) S1 (mørkegrøn) og S2 (lysegrøn) implanteres i dybden af højre primære auditive felt AI tæt på dens input lag IV. Elektrodespidserne kan placeres langs rostrocaudal akse (caudale elektrode S1, rostral elektrode S2) med en interelectrode afstand på ~ 700 um. De 3 x 6 ECoG optagelsearray (600 um interelectrode afstand) er centreret epiduralt over den højre AI. (B) Nissl-farvet horisontale afsnit af respektive område af hjernen efter eksperimentel procedure viser to små læsioner (pile), der var forårsaget af spidserne af de to implanterede stimulation elektroder angivelse af deres placering i tidsmæssig cortex. Positionen kan yderligere evalueres ved "Prussian Blue" farvning. Dette tal har været ændret siden Deliano et al., 2009. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Shuttle-box træningsdata og analyse af et enkelt dyr. (A) Skemata på højre beskrives opgaven design til CS + og CS forsøg i et to-vejs shuttle-box diskrimineringpå opgaven og adfærdsmæssige resultater. (B) Learning kurver plottet som hit og falsk alarm satser for de enkelte træningspas. Signifikante forskelle mellem hit og af falske alarmer er markeret med en stjerne (Games-Howell test, p <0,05). (C) Sensitivity Index d '> 1 (se 3.2.7) kan anvendes som tærskelkriterium for vellykket diskrimination. (D ) Overvågning af de spontane krydsninger under tilvænning fase viser generelt et fald i løbet af sessioner. (E) Respons ventetid under CS + forsøg er plottet for individuelle forsøg end alle træningspas. Alle svar med latenstider under 6 sek svarer til en vellykket hit svar. Bemærk de længere escape latenstider i den første halvdel af den første session. Efter at være steget faldt stød i foden styrke latenstider for at slippe under 2 sek efter os indtræden angiver tilstrækkelig stød kontrol. Histogrammer (højre indeniliggende) af respons latenstider er bimodal svarende til at ramme reaktioner (<6 sek) og undslippe svar. (6 - 8 sek) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Parallel elektrofysiologiske optagelse i en læring dyr. (A) Typisk eksempel på en elektrisk fremkaldte potentiale (EEP) fra et enkelt dyr i gennemsnit på tværs af CS + forsøg i en enkelt session uddannelse. Der blev optaget fra en ECOG-array. Figuren sammenligner EEP spor før (sort) og efter (rød) fjernelse af enkelte puls stimulus artefakter. Nærmere oplysninger om artefakt reduktion se afsnit 4.1.7. Den tidlige fremtrædende negative peak kan ses på en latenstid på 20 ms (N20). (B) Yderligere analyse af de rumlige fordelinger af N20 amplitude som svar på en CS + ved than rostrale stimulationselektrode (øverst) og en CS på caudale stimulationselektrode (nederst) viser den rumlige opløsning af fremkaldte tilstande i hele cortex. Anatomiske retninger i forhold til optagelsen arrayet er angivet med pile (D, dorsal C, caudal l, lateral m, mediale R, rostralt v, ventrale). Dette tal har været ændret siden Deliano et al., 2009. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode samtidige stedsspecifikke ICMS og multi-kanal elektrofysiologiske optagelser i en lærer dyret ved hjælp af en to-vejs aversiv mund-chok kontrolleret shuttle-box-systemet. Protokollen lægger vægt tekniske centrale begreber for en sådan kombination, og påpeger vigtigheden af grundstødning dyret kun via sin fælles jordelektrode, forlader gridfloor med variabel spænding. Her blev auditive shuttle-box læring anvendt på mongolske ørkenrotter som læring-relaterede plast reorganisering af den auditive cortex i disse dyr er blevet undersøgt udførligt 8,12,14,15,21,22. Ikke desto mindre kan den beskrevne protokol tilpasses med mindre ændringer til andre gnaver arter, som f.eks mus 16. I den forbindelse er det vigtigt at overveje artsspecifikke tilpasninger vedrørende inddrivelse tid efter operationen (2,17), højde hurdle (2.1.1), og mund- chok følsomhed individuelle dyr, som kan HIGHly variabel (3.1.3-3.1.6).
Protokollen giver yderligere detaljerede forklaringer på, hvordan skræddersyede elektrode design kan bruges til at stimulere forskellige steder i kortikale væv, der fører til forskellige netværk aktiveringer som stammer fra en analyse af samtidige elektrofysiologiske multielectrode optagelser 8,23. Afhængigt af afstanden elektroder man kan stimulere forskellige områder af f.eks topografiske kort 9. Ved at anvende lag-afhængig ICMS er det muligt at aktivere differentielt langtrækkende corticocortical fremspring fører til mere udbredt aktivering af cortex ved stimulering i corticale input lag III-IV. I stedet stimulering i corticoefferent output lag V-VI førte til en langt mere samlingspunkt aktivering af intracortical og corticothalamic feedback-kredsløb 8. Ved brug af stimulation arrays med to eller flere stimulation elektroder, kan bipolar ICMS anvendes i stedet for monopolar ICMS. Bipolar stimuleringsmodus mereeffektivt rekrutterer neuronale fibre løber parallelt med elektrodespidserne, fortrinsvis i retning af det katodiske pol i forhold til ikke-parallelle fibre 24. En sådan stimulering konfiguration dermed øger retningsbestemt specificitet af de fremkaldte neuronale netværk aktiveringer 8. Disse særlige direkte manipulationer af kortikale sublaminar netværksaktiviteter hjælp ICMS 8,9, har hidtil ikke vist sig af nogen anden teknik 3. Som et eksempel på kraften i denne metode, en nylig rapport unraveled bidrag cortico thalamus feedback-kredsløb til opfattelsen hjælp indlæring af intracortical elektriske stimuli 8 afsløring. Dette viser, at direkte kortikale microstimulation er en effektiv og state-of-the-art metode til kausalt link aktivitet i bestemte neurale kredsløb og adfærd 1,3,11,25. Ved lokal elektrisk stimulation af kortikale regioner svarende til specifikke topografiske kort funktioner, som for inststemmelse en tonotopic region i den auditive cortex, kan fag blive trænet i transfer learning paradigmer at sammenligne egenskaberne af perceptioner fremkaldt af central elektrisk eller perifer sensorisk stimulation. Sådanne eksperimenter kan stimulere udviklingen af stimulation strategier for sensoriske kortikale neuroprostheses 5,9. Denne protokol kan også anvendes i den elektriske stimulation af andre hjerneområder, som for eksempel den ventrale tegmentalområde, at studere Belønningsbehandlingen og neuronale fundament for deep brain stimulation 26. Kritisk for effektiv microstimulation er flere tekniske detaljer, der skal overvejes på baggrund af den enkelte opsætning og elektroder anvendes. Generelt indflydelse stimuleringsparametre, som stimulering amplitude, polaritet, elektroden orientering osv er gennemgået 11,24. Af betydning er ladningsoverførslen af elektroden. Impedansen af en elektrode dermed er en kritisk faktor. Derfor kontrollere, at than impedans af elektrodekontakter er i kohm området inden implantation.
Adskillige yderligere fænomener læring kan studeres ved passende variation af den beskrevne grundlæggende design. For eksempel kan diskrimination læring i modsætning til simpel detektion læring undersøges ved at indføre mindst to stimuli, der skal være forbundet med go og Nogo reaktioner henholdsvis 14,15. Tilsvarende kategori dannelse læring kan studeres ved at kombinere en sådan forskelsbehandling paradigmer 12,21. Shuttle-box paradigmer kan også anvendes til at undersøge arbejdshukommelsen, adfærdshæmning og kognitiv fleksibilitet for eksempel nødvendige for en vellykket vending læring 14,17 eller indstille gearskift. Arbejdshukommelse kan vurderes ved at sammenligne »forsinkelse« og »spor« condition. I »forsinkelse« condition 27, er CS præsenteres i hele den kritiske CS-amerikansk tid vindue uden forsinkelse mellem CS affset og amerikanske debut. I 'spor' condition, på den anden side er der en forsinkelse på flere sekunder efter forskydningen af forbigående CS præsentation. I modsætning til »forsinkelse« condition 'spor' condition sætter en stor belastning på arbejdshukommelse og kortikal behandling. Ved at kombinere diskriminerende shuttle-box læring paradigmer med analysen af spatiotemporale mønstre i den igangværende electrocorticogram, er en egnet metode til at identificere dynamiske tilstande af auditive cortex relateret til stimulus diskrimination 9, og kategori dannelse 21. Men som shuttle-box træning klassisk bruges som to-vejs undgåelse opgave, de generelle begrebsmæssige problemer med undgåelse læring finder anvendelse for alle disse adfærdsmæssige mønstre; nemlig at en vellykket undgåelsesadfærd udtrykkeligt forhindrer forekomsten af stimulus, der tjener som forstærker. Appetitforstyrrelser forstærkning, for eksempel ved direkte elektrisk stimulering af midthjernen belønning kredsløb, kun har bin anvendt på shuttle-box læring i nogle undersøgelser 26. Desuden har shuttle-box læring hovedsageligt været anvendt med gnaverarter og er kun sjældent anvendt i større laboratoriedyr, som f.eks hunde.
Ud med elektrofysiologisk analyse, kan shuttle-box læring yderligere kombineres med farmakologisk intervention 8,17, læsioner teknikker 15, mikrodialyse 28, eller optogenetics. Især kombinationen af vores protokol med optogenetic værktøjer, enten ved virusinfektion i modelsystemet (dvs. mongolske hoppemus), eller ved genetisk modificerede dyr, såsom mus, vil gøre det muligt at øge især den cellulære subtype specificitet kunstige neuronale aktivering herunder cortical hæmning, hvilket ikke er tilgængelig ved brug ICMS 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af tilskud fra kanalen Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG og Leibniz-instituttet for neurobiologi. Vi takker Maria-Marina Zempeltzi og Kathrin Ohl til teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
- Cohen, M. R., Newsome, W. T. What electrical microstimulation has revealed about the neural basis of cognition. Current Opinion in Neurobiology. 14 (2), 169-177 (2004).
- Histed, M. H., Bonin, V., Reid, R. C. Direct activation of sparse, distributed populations of cortical neurons by electrical microstimulation. Neuron. 63 (4), 508-522 (2009).
- Histed, M. H., Ni, A. M., Maunsell, J. H. R. Insights into cortical mechanisms of behavior from microstimulation experiments. Progress in Neurobiology. 103, 115-130 (2013).
- Bradley, D. C., et al. Visuotopic mapping through a multichannel stimulating implant in primate V1. Journal of Neurophysiology. 93, 1659-1670 (2005).
- Scheich, H., Breindl, A. An Animal Model of Auditory Cortex Prostheses. Audiology and Neurootology. 7 (3), 191-194 (2002).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinas, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- Douglas, R. J., Martin, K. A. C.
- Happel, M. F. K., Deliano, M., Handschuh, J., Ohl, F. W. Dopamine-modulated recurrent corticoefferent feedback in primary sensory cortex promotes detection of behaviorally relevant stimuli. The Journal of Neuroscience. 34 (4), 1234-1247 (2014).
- Deliano, M., Scheich, H., Ohl, F. W. Auditory cortical activity after intracortical microstimulation and its role for sensory processing and learning. The Journal of Neuroscience. 29 (50), 15898-15909 (2009).
- DeYoe, E. A., Lewine, J. D., Doty, R. W. Laminar variation in threshold for detection of electrical excitation of striate cortex by macaques. Journal of Neurophysiology. 94 (5), 3443-3450 (2005).
- Tehovnik, E. J., Slocum, W. M., Schiller, P. H. Delaying visually guided saccades by microstimulation of macaque V1: spatial properties of delay fields. The European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2635-2643 (2005).
- Wetzel, W., Wagner, T., Ohl, F. W., Scheich, H. Categorical discrimination of direction in frequency-modulated tones by Mongolian gerbils. Behavioural Brain Research. 91, 29-39 (1998).
- Cain, C. K., LeDoux, J. E. Escape from fear: a detailed behavioral analysis of two atypical responses reinforced by CS termination. Journal of Experimental Psychology. Animal behavior processes. 33, 451-463 (2007).
- Stark, H., Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H. Dynamics of cortical theta activity correlates with stages of auditory avoidance strategy formation in a shuttle-box. Neuroscience. 151, 467-475 (2008).
- Ohl, F. W., Wetzel, W., Wagner, T., Rech, A., Scheich, H. Bilateral ablation of auditory cortex in Mongolian gerbil affects discrimination of frequency modulated tones but not of pure tones. Learning & Memory. 6 (4), 347-362 (1999).
- Kurt, S., Ehret, G. Auditory discrimination learning and knowledge transfer in mice depends on task difficulty. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8481-8485 (2010).
- Happel, M. F. K., et al. Enhanced cognitive flexibility in reversal learning induced by removal of the extracellular matrix in auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2800-2805 (2014).
- Thomas, H., Tillein, J., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). I. Electrophysiological mapping of frequency representation and distinction of fields. The European journal of neuroscience. 5, 882-897 (1993).
- Budinger, E., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). III. Anatomical subdivisions and corticocortical connections. European Journal of Neuroscience. 12, 2425-2451 (2000).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Ohl, F. W., Scheich, H., Freeman, W. J. Change in pattern of ongoing cortical activity with auditory category learning. Nature. 412 (6848), 733-736 (2001).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hearing Research. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Happel, M. F. K., Jeschke, M., Ohl, F. W. Spectral integration in primary auditory cortex attributable to temporally precise convergence of thalamocortical and intracortical input. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11114-11127 (2010).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Research. 98, 417-440 (1975).
- Clark, K. L., Armstrong, K. M., Moore, T. Probing neural circuitry and function with electrical microstimulation. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 278 (1709), 1121-1130 (2011).
- Ilango, A., Shumake, J., Wetzel, W., Scheich, H., Ohl, F. W. Electrical stimulation of lateral habenula during learning: frequency-dependent effects on acquisition but not retrieval of a two-way active avoidance response. PloS one. 8 (6), e65684 (2013).
- Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behavioral Neuroscience. 114, 1058-1067 (2000).
- Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H., Stark, H. Segregation of task-relevant conditioned stimuli from background stimuli by associative learning. Brain Research. 1297, 143-159 (2009).
