Introduction
在眼科，基因治疗已成为治疗方式在单基因遗传性视网膜病变。存在与基因在视网膜色素上皮细胞（RPE）包括莱伯先天性amurosis 1,2，色素性视网膜炎3，和脉络膜4相关遗传性视网膜病变。基因治疗的研究领域正在扩大在临床前研究和使用病毒载体的临床试验，例如腺机相关病毒（AAV）， 慢病毒 （LV）和腺病毒 （广告）5。不同的病毒载体具有不同的取向，在视网膜上。一种安全有效的基因治疗，病毒载体应仔细根据靶细胞和靶基因。
基因递送途径也很重要，为有效的基因递送至靶细胞，因此，应该仔细选择为好。用于眼内递送病毒载体的两种最常见的方法是subretINAL注射玻璃体内注射6。后者，玻璃体内注射，已被广泛地用于药物输送到治疗在湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）和黄斑水肿脉络膜新生血管形成，糖尿病性视网膜病7。玻璃体内途径提供的病毒载体到玻璃体和视网膜内层的暴露，但向量到外视网膜的扩散受到限制。另一方面，在视网膜下途径提供直接递送病毒载体到视网膜和RPE之间的潜在空间，诱导局部疱。因此，视网膜下注射是目前被认为用于靶向感光细胞和RPE一个更有效的路由。在手术方式上，玻璃体被选为安全区的玻璃体内注射，避免在人类患者视网膜损伤。通过简单地修改这个方法给小鼠，我们可以通过角膜缘视网膜下的方法或intravireally注入病毒载体。
在这个视频本文中，我们证明视网膜下注射病毒载体的容易且方便的方法到小鼠视网膜色素上皮。在后方缘用30 G 1/2单针穿刺后，一个33克钝针配备微升注射器插入通过角膜缘穿刺部位的视网膜下腔。 1.5病毒载体 - 2微升体积被注入到视网膜和RPE诱导视网膜下泡之间的潜在空间。这个过程可以在直视下使用手术显微镜下进行。反复练习将保证复制的结果，即使没有气泡形成的直接可视化。这将有助于研究人员进行精确和节省时间用于实验的小鼠视网膜色素上皮基因传递。
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Protocol
对动物的所有实验均按照研究协会在视觉与眼科声明使用动物的眼科和视觉研究的进行，以及指导方针和条例规定由首尔国立大学机构动物护理和使用委员会和国立首尔大学附属医院生物安全委员会。
1.准备注射套件和病毒载体
- 制备微升注射器配备有33克钝针用环氧乙烷气体消毒。稀释在PBS中的病毒载体用于在微管（ 即，1×10 6 TU /微升）在足够滴度。冲洗注射器数次用病毒载体以除去在注射器任何死角。
病毒载体2.视网膜下注射
- 麻醉成年小鼠（ 即，6 - 8周龄）腹膜内注射tiletami的混合物的NE和唑拉西泮（1：1，2.25毫克/公斤体重）和赛拉嗪盐酸盐（0.7毫克/公斤体重）或另一种合适的麻醉制度。
- 瞳孔扩张与去氧肾上腺素0.5％滴眼剂及托0.5％。
- 2μl病毒载体 - 通过加载1.5准备的注射器微升。
- 打开眼睑和突出眼睛，以暴露赤道注射方便和在手术显微镜下重点关注。保持凸眼睛的位置，直到在完成注射针，或位移可以发生在注射过程。要牢牢占据眼球，将手指眶缘外。
- 申请一滴眼科粘弹性溶液到角膜表面。
- 放置在角膜上以可视化的视网膜的顶部小圆盖滑动。
- 穿刺小孔后略有使用无菌30 G 1/2针为进一步视网膜下注射角膜缘。让孔劣质FOr处的右眼，和优越的用于左眼为方便。
注：如果孔是由在时间或鼻腔，很难涵盖在注射后的眼睑。初始穿刺应略作出后侧到角膜缘，以避免其沿角膜缘运行，并且可以容易地识别该边缘血管。要小心，以避免撞上镜头针，而在初始穿刺。不要插入针头的整个斜面，以避免爆胎的镜头。 - 将微升注射器33克钝针经过前期的穿刺孔，并接近针进入视网膜下腔，直到点，当轻微的感觉到阻力。
注：对于视网膜下注射时，针最好接近角是针对虹膜平面约45度，并且钝针应当向后推向乳头周围区域。虚线方框表示整个玻璃体腔建议针途径视网膜下注射液中的n 图1。
注：不会有阻力觉得当刺穿（或合格）的视网膜层，因为他们是非常柔软。因此，温和阻力的第一感觉指示该针已触到RPE层和所述针的插入应当停止。小心不要穿透巩膜组织过度的压力，因为在针应放置在潜在视网膜下腔。如果针头穿刺由剩余电力的巩膜组织，其进入无阻力眼外轨道的空间。 （这一步是至关重要的）
在视网膜下注射的图1示意图。H＆E的小鼠眼描绘的结构用针通路为视网膜下注射标记的染色的横截面（虚线正方形）。放大倍数：40X，比例尺： 500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 轻轻注入病毒载体（ 即，1×10 6 TU /微升）到视网膜下腔无震颤，以避免不必要的组织损伤，并轻轻拔出针头。在2.4中描述的注射过程中牢牢占据眼球。
- 观察注射手术显微镜下后形成的水泡视网膜下，以确保没有视网膜出血。
图2.视网膜下Belb没有形成视网膜出血，视网膜下注射手术显微镜下视网膜后的belb微观角度显示没有视网膜出血成功水泡形成。M /文件/ ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
- 轻轻合上眼睑覆盖注射部位为自密封。返回小鼠家笼永葆直到评价。
注：在研究人员习惯的程序，它们可以通过跳过这些步骤获得快速的程序可重复的结果（2.5，6和10）
3.评估基因传递的视网膜色素上皮细胞的功效
- 牺牲小鼠中的CO 2室中。用剪刀剜除眼睛。
- 固定在眼睛中，在4℃的4％多聚甲醛溶液至少1小时至数天。
- 抢用细镊子角膜和穿刺微型剪刀角膜。沿缘剪式后取下眼角膜。取出钳镜头。
- 修剪睫状体具有mICRO剪刀使视网膜脱离。轻轻一拉从RPE /脉络膜/巩膜复杂的整个视网膜。切RPE /脉络膜/巩膜复杂的径向从外围向中心靠近视神经几次，以4〜8叶平安装。
- 翻转RPE /脉络膜/巩膜复杂，使RPE的一面朝下，并修剪在巩膜侧的肌肉，包括，结膜和视神经所有剩余的组织。这个步骤是重要的，以一平的RPE /脉络膜/巩膜复杂的，因为任何残留组织使复杂的不均匀。
- 孵育一级和二级抗体复合物为特定的研究目的（可选，请参阅详细方法的引用）。平面安装的RPE /脉络膜/巩膜载玻片上复合物和吸收的PBS用吸水海绵。
- 加入30微升的安装解决方案，然后将盖子滑。观察样品载体递送的荧光显微镜下的功效。保持的样品中的冰箱进一步观察。
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Representative Results
通过该协议评估视网膜下注射病毒基因转导的功效，我们用巨细胞病毒启动子表达GFP和RFP的指标市售LV载体。根据研究目的合适的时间后，眼睛被摘除。对于代表性的结果，眼睛被剜出10周20周视网膜下注射后。完全除去使用上述方法的视网膜后，RPE /脉络膜/巩膜复杂的平面安装在荧光显微镜下进行了评价。代表性结果示于图3A（与完全除去视网膜的很好的例子）和图3B（差例如具有完整视网膜）。虽然残存神经视网膜（尤其光感受器外节段）在RPE层的存在不干扰分析RPE中基因递送面积，它阻断GFP / RFP和抑制直接visua的荧光补肾中药RPE层进行进一步的分析。因此，彻底清除从RPE /脉络膜/巩膜复杂的神经视网膜将提供更好的结果。
图3. RPE /脉络膜/巩膜的例子复杂平贴根据彻底清除视网膜。20周慢病毒视网膜下注射用GFP / RFP基因后。 （ 一 ）良好的RPE例如完全切除视网膜平片显示GFP / RFP中的RPE细胞清晰离散表达式。 （B）中的RPE的差例如平面安装，由于没有去除的视网膜显示了基因递送与RFP信号，这是不充分的分析RPE病变区域。放大倍数：40X，比例尺：500微米请点击此处查看该图的放大版本。
即 2微升）的病毒效价，以判断疗效。这有助于调节适当病毒滴度实验。
RPE /脉络膜的代表性结果/巩膜复杂平坦支座10周后视网膜下注射以各种放大倍率如图4（40X）和图5（400倍）中示出。低放大率图像是足以评估GFP / RFP的表达的区域。另一方面，具有高放大率的图像是必要的用于与给研究者的特定目的的其它的RPE病理。这些图像机智ħ不同放大倍率有助于理解在RPE病毒表达模式（ 图4和5）。我们还检查GFP / RFP表达多达36周后注射。 （数据未示出）的GFP / RFP表达36周后喷射后仍观察到。
图4. RPE的示例/脉络膜/巩膜复杂的慢病毒视网膜下注射用GFP / RFP基因（放大倍数：40X）后平贴10周。（A）绿色通道，绿色荧光蛋白（B）红色通道的RFP。比例尺：500微米请点击此处查看该图的放大版本。
图5. RPE /脉络膜/巩膜复合平板为例慢病毒的视网膜下注射用GFP / RFP基因（放大倍数：400倍）后-mount 10周。（A）绿色通道，绿色荧光蛋白（B）红色通道的RFP。比例尺：50微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这个视频文章中，我们介绍了缘，方法视网膜下注射技术详细RPE /脉络膜/巩膜平座的代表性成果。这是一个简单而方便的技术为视网膜下注射病毒载体进入RPE。的气泡形成在注射过程中直接可视化是准确的交货期为初学者的一个重要步骤。有在Journal引入可视化实验8-10中某些视网膜下注射技术。视网膜下空间是视网膜和RPE之间的潜在空间，因此有两种可能的路由接近视网膜下的空间。一个是通过玻璃体和视网膜的内部的方法来视网膜下腔，另一个是通过RPE细胞和巩膜的外部的方法。这缘，方法视网膜下注射技术是通过玻璃体内的空间和视网膜前者。这种技术具有这样的优点，以提供多个后部疱形成相比后者因为后者一接近角使得从经由巩膜隧道或切口的周边，这应使在周边视网膜一个疱。此外，简单的穿刺缘比巩膜隧道不容易穿透视网膜。对于新生小鼠，但是，它是使用外部方法9更合适。由于新生小鼠的眼球是非常小的，充满镜头，角膜缘，技术，方法可能会导致不必要的白内障的形成，甚至眼球痨。
还有在这个协议中的一些关键步骤。首先，初始穿刺应地方稍微后侧到角膜缘，因为太前穿刺在角膜使得虹膜监禁，或太后穿刺使得直接孔在周边视网膜。其次，建议要小心避免碰撞镜头针，而在初始穿刺。最好不要插入针头的整个斜面，以避免爆胎的镜头。第三，将b针的EST接近角是针对虹膜平面约45度，并且钝针应当向后推向乳头周围区域。最后，针应在注射过程中放置在视网膜下腔，从而获得均匀的气泡形成，否则流离失所针导致玻璃体内注射。
映入眼帘的是一个小器官具有独特的功能，使它成为基因治疗11有吸引力的目标。具体地讲，它是一个小封闭隔室与免疫特权，使基因治疗具有相对低的毒性和在眼睛的免疫反应和不利的全身效应。方便的可视化，并准备无障碍手术方法是眼部基因治疗等优点。视网膜有一个高度组织化的层状结构与10不同的层。因此，精确的空间基因递送只能通过眼内注射的适当的方法来实现的。对于INTR两种最常用的方法aocular递送病毒载体是玻璃体内注射和视网膜下注射6。在一般情况下，玻璃体内注射是用于靶向视网膜神经节细胞和米勒细胞内视网膜优选的途径。视网膜下注射是外视网膜靶向感光细胞和视网膜色素上皮细胞的优选路线。在RPE的高效转导，有必要提供病毒载体视网膜下，尽管为视网膜损伤的可能性。
在这项研究中，我们用LV的载体与GFP和RFP的可视化。因为病毒载体有向性为视网膜特定的细胞类型，病毒载体应根据AAV，LV的取向和广告的靶细胞5来选择。例如，AAV2 / 2，AAV2 / 6和AAV2 / 8是最高的传导效率RGC和Müller细胞。 AAV2 / 5，2/7，2/8和2/9有效地转导感光细胞和RPE与AAV2 / 8是小鼠5,12最有效的血清型5。对于LV载体，有玻璃体内注射13之后的高级别RPE细胞中表达视网膜下注射后，但很少或没有表达。
为了有效的基因传递到RPE，病毒启动子也应考虑。病毒启动子，如巨细胞病毒（CMV）启动子和嵌合鸡β-肌动蛋白/ CMV增强子是强和普遍存在的启动子，因此，它们在大多数基因治疗的研究中使用。在RPE中，CMV启动子，估计表达与RPE65子14相比十倍尽可能多的蛋白质。重要的是，在启动子和病毒载体包括血清型的最优组合应达到更好的结果就证明了RPE65的上级表达当人RPE65启动子被封装在血清型的rAAV2 / 4比的rAAV2 / 2 15。专注于基因传递到视网膜色素上皮细胞，RPE-SPecific启动子如RPE65或VMD2子减小了脱靶安全问题16。
AMD是一种复杂的疾病，有两个阶段以称为干性AMD退行性相位和特征由称为湿性AMD的脉络膜新生血管形成的一个阶段。此外，AMD是一种疾病，其中众多遗传易感性，包括补体因子H（CFH），补体C3，补体因子I（CFI），年龄相关性黄斑病变的易感性2（ARMS2）和ApoE基因相结合，与环境风险因素17。由于遗传风险因素的复杂性中的AMD，没有单一的候选基因的基因治疗。因此，目前的基因治疗中，AMD的重点是基因转移表达靶向脉络膜新生血管形成的抗血管生成蛋白在湿性AMD 18。有没有候选基因还用于治疗干性AMD与基因治疗。最近，我们建议细胞内β-淀粉样蛋白的积累可以有关干燥在转基因小鼠19的AMD的特征。此外，视网膜下注射β淀粉样蛋白，就由RPE小鼠（数据未公布）。我们可以切割细胞内β-淀粉样蛋白与病毒蛋白酶20。因此，我们进一步研究了基因治疗干性AMD与潜在目标。
总之，基因治疗眼疾病比在任何其他器官更有前途。此外，视网膜下注射是一种基本技术基因治疗视网膜疾病，特别是关系到感光细胞和视网膜色素上皮。因此，我们希望该技术越来越广泛地被使用，并且可以向基因治疗不仅在单基因遗传性视网膜病变，而且在年龄相关性黄斑变性的进展。
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Acknowledgments
这项研究是由首尔国立大学研究资助（800-20140542）的支持下，先锋研究计划NRF / MEST的（2012-0009544），和NRF / MEST的生物信号分析技术创新计划（2009-0090895），及NRF / MEST的格兰特（2015M3A9E6028949）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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