Introduction
眼科では、遺伝子治療は、単一遺伝子継承網膜症における治療法として浮上しています。レーバー先天性amurosis 1,2、網膜色素変性症3、および先天性脈絡膜欠如4を含む網膜色素上皮（RPE）における遺伝子に関連した継承された網膜症があります。遺伝子治療の研究分野は、前臨床研究や、 アデノ -関連ウイルス（AAV）、 レンチウイルス （LV）およびアデノウイルス （AD）などのウイルスベクターを用いた臨床試験の両方に拡大している5。別のウイルスベクターは、網膜内の異なる親和性を有しています。安全かつ効果的な遺伝子治療のために、ウイルスベクターは、注意深く標的細胞および標的遺伝子に応じて選択されるべきです。
遺伝子送達の経路は、従って、それは慎重に同様に選択されるべきで、また、細胞を標的とする効果的な遺伝子送達のために重要です。ウイルスベクターの眼内送達のための2つの最も一般的な方法は、subretされていますinal注射や硝子体内注射6。後者は、硝子体内注射は、広く滲出型加齢黄斑変性症（AMD）および糖尿病性網膜症7の黄斑浮腫で脈絡膜血管新生を治療するための薬物送達のために使用されています。硝子体内経路は、硝子体と内側の網膜へのウイルスベクターの露出を提供していますが、外側の網膜へのベクターの拡散が制限されています。一方、網膜下の経路は、ローカライズ胞を誘導する、網膜とRPEの間の潜在的な空間へのウイルスベクターの直接送達を提供します。したがって、網膜下注射は、現在、光受容体細胞およびRPEを標的とする、より効率的なルートであると考えられます。外科的アプローチの面では、プラナは、ヒト患者における網膜の損傷を避けるために硝子体内注射のための安全なエリアとして選択されているPARS。単にマウスにこの方法を変更することによって、私たちは輪部アプローチを介して、網膜下またはintravireallyウイルスベクターを注入することができます。
このビデオで記事は、我々は、マウスのRPEへのウイルスベクターの網膜下注射の簡単で便利な方法を示しています。 30 G 1/2針で角膜輪部の後方に単一の穿刺後、33 G鈍針搭載マイクロリットルのシリンジは輪部穿刺部位を介して網膜下腔に挿入されます。 1.5のウイルスベクター - 2μlのボリュームが網膜下ブレブを誘発網膜とRPEとの間の潜在的な空間に注入されます。この手順では、手術用顕微鏡を用いて直接可視化の下で行うことができます。反復練習も、ブレブ形成の直接可視化することなく、複製の結果を保証します。これは、研究者がマウスのRPEにおける網膜下の遺伝子送達のために、正確かつ時間節約実験を行うのに役立ちます。
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Protocol
動物の全ての実験は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文の研究のための協会に従って実行、およびガイドラインや規制は、ソウル国立大学施設内動物管理使用委員会とソウルで定められました大学病院バイオセーフティ委員会。
1.インジェクションキットおよびウイルスベクターを準備
- 酸化エチレンガスを使用して滅菌33 G鈍針を備えたマイクロシリンジを準備します。マイクロチューブ（ すなわち、1×10 6 TU /μL）で十分な力価のために、PBS中のウイルスベクターを希釈します。シリンジ内の任意のデッドスペースを除去するために、ウイルスベクターを用いて、シリンジを数回フラッシュします。
ウイルスベクターの2網膜下注射
- tiletamiの混合物の腹腔内注射で-成体マウス（8週齢、すなわち、6）麻酔NE及びゾラゼパム（1：1、2.25 mg / kg体重）及びキシラジン塩酸塩（0.7 mg / kg体重）、または代替の適切な麻酔レジーム。
- フェニレフリン0.5％の点眼で瞳孔を拡張し、0.5％のトロピカミド。
- ウイルスベクター2μlの - 1.5でロードすることにより、マイクロシリンジを準備します。
- まぶたを開いて、便利な注射のための赤道を露出させ、手術用顕微鏡下に集中するために目を突出しています。注入を終えまで突出目の位置を維持する、または針の変位が注入中に発生する可能性があります。しっかりと眼球を保持するために、眼窩縁の外側に指を置きます。
- 角膜表面への眼科用粘弾性溶液の液滴を適用します。
- 網膜を視覚化するために、角膜の上に小さな丸いカバースライドを置きます。
- さらに網膜下注射のための無菌の30 G 1/2針を使用して角膜縁にわずかに後方に小さな穴を穿刺。劣っFO穴を作りますR右目、利便性のために、左眼のための優れました。
注：穴が時間的または経鼻で行われる場合、それは注射後まぶたによって覆われるのは難しいです。初期パンクはわずか輪部に沿って実行して、容易に認識することができ輪部血管を回避するために、角膜輪部に後方なされるべきです。最初の穿刺をしながら針でレンズを打つないように注意してください。レンズ穿刺を回避するために、針の全体の傘を挿入しないでください。 - プレパンクチャーホールを介してマイクロリットルの注射器の33 G鈍針を置き、穏やかな抵抗が感じられる点まで、網膜下腔に針を近づけます。
注：網膜下注射のために、針の最良のアプローチ角は、虹彩面に対して約45度であり、鈍い針は乳頭周囲の領域に向かって後方に押されるべきです。点線の四角は網膜下の充血のために硝子体腔を横切る示唆針経路を示しました図1中のn。
注：彼らは非常に柔らかいようピアス（または通過）網膜層ときに抵抗が感じないがあるでしょう。このように、軽度の抵抗の最初の気持ちは、針が既にRPE層に触れた、針の挿入が停止されるべきであることを示しています。針は、潜在的な網膜下腔に配置する必要がありますので、過度の圧力と強膜組織を貫通しないように注意してください。針が過大な力で強膜組織を穿刺した場合、それは抵抗なく外眼軌道の空間に入ります。 （このステップは非常に重要です）
網膜下注射の図1の模式図で。H＆Eは、マークされた網膜下注射用の針経路（点線の四角）との構造を描いたマウスの眼の断面を染色しました。倍率：40X、スケールバー： 500ミクロン。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
- 不要な組織の損傷を避けるため、ゆっくりと針を撤回する震えずに網膜下の空間に静かにウイルスベクター（ すなわち、1×10 6 TU /μl）を注入します。 2.4で説明したように、注射の際にしっかりと眼球を保持します。
- 何の網膜出血がないことを確認する手術用顕微鏡下で注入後の網膜下ブレブの形成を観察します。
図2.網膜出血せずに網膜下Belb形成。手術用顕微鏡下での網膜下注射後の網膜下belbの顕微鏡図は、網膜出血のない成功ブレブ形成を示します。M /ファイル/ ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
- 静かに自己封止用注射部位をカバーするために瞼を閉じます。ホームケージにマウスを返し、評価まで生き続けます。
注：研究者は手順に慣れた後、彼らはこれらのステップをスキップすることにより、迅速な手順で再現性のある結果を得ることができます（2.5、6、および10）
網膜色素上皮における遺伝子送達の有効性の評価3。
- CO 2チャンバー内でマウスを生け贄に捧げます。はさみを使用して、目を摘出。
- 数日に最低1時間、4℃で4％パラホルムアルデヒド溶液中で目を修正しました。
- 細かい鉗子で角膜をつかみ、マイクロはさみで角膜を穿刺。角膜輪部に沿ってシザリング後の角膜を削除します。ピンセットでレンズを取り外してください。
- mの毛様体トリムicro-はさみ網膜剥離を可能にします。静かRPE /脈絡膜/強膜複合体からの全網膜を引っ張ります。フラットマウント用4〜8葉を作るために視神経に近い中心に周囲から放射状に数回RPE /脈絡膜/強膜複合体をカットします。
- ダウンRPE側を行い、筋肉、結膜および視神経を含む強膜側の残りのすべての組織をトリミングするRPE /脈絡膜/強膜複合体を反転します。残りの組織は複雑な凹凸を作るため、この手順は、フラットRPE /脈絡膜/強膜複合体を作ることが重要です。
- （詳細な方法のための参考文献を参照して、オプション）特定の研究目的のために一次および二次抗体との複合体をインキュベートします。スライドガラス上のRPE /脈絡膜/強膜複合体をフラットマウントし、吸収性スポンジを含むPBSを吸収します。
- 取付溶液30μlを添加して、カバースライドを配置します。フルオレセイン顕微鏡下でベクター送達の有効性のためのサンプルを観察します。でサンプルを保ちますさらに観察用冷蔵庫。
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Representative Results
このプロトコルにより、ウイルスの遺伝子導入の網膜下注射の有効性を評価するために、我々は、インジケータ用GFPおよびRFPの両方を発現するCMVプロモーターを有する市販のLVベクターを使用していました。目は研究目的に応じて適切な期間の後に摘出しました。代表的な結果を得るためには、目が網膜下注射後10週および20週に摘出しました。上述の方法を用いて網膜を完全に除去した後、RPE /脈絡膜/強膜複合体の平らなマウントは、蛍光顕微鏡下で評価しました。代表的な結果を図3（a）（網膜の完全な除去との良好な例）および図3B（無傷の網膜と悪い例）に示しました。 RPE層の上に残存神経網膜（特に光受容体の外節）の存在はRPEにおける遺伝子送達の領域を分析するために干渉しなかったが、それは、GFP / RFPおよび阻害し、直接visuaの蛍光をブロックさらなる分析のためにRPE層のlization。従って、RPE /脈絡膜/強膜複合体からの神経網膜の完全な除去は、より良い結果を提供するであろう。
図3.強膜RPE /脈絡膜/の例複雑なフラットマウント網膜の完全な除去に応じて。二十週GFP / RFP遺伝子を有するレンチウイルスの網膜下注射後。フラット網膜を完全に除去してマウント（A）RPEの良い例は、RPE細胞におけるGFP / RFPを明確にし、個別の発現を示します。フラットによる網膜のない除去をマウント（B）RPEの悪い例は、RPEの病理を分析するには不十分であるRFP信号に遺伝子送達の領域を示しています。倍率：40X、スケールバー：500μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
すなわち、2μL）あたりのウイルス力価に応じて、GFP / RFP発現の存在によって有効性を判断するために、より信頼性の高いであろう。これは、実験のために適切なウイルス力価を調整するのに役立ちます。
RPE /脈絡膜/強膜複雑なフラットの代表的な結果は、網膜下注射は、 図4（40X）および図5（400X）で、様々な倍率で示した10週間後にマウントします。低倍率の画像は、GFP / RFP発現の面積を評価するのに十分です。一方、高倍率の画像は研究者の特定の目的に係るその他のRPEの病理のために必要です。これらの画像のウィットH様々な倍率は、RPEにおけるウイルス発現パターン（ 図4、図5）を理解するのに役立ちます。また、36週間注射後にまでGFP / RFPの発現をチェックしています。 GFP / RFPの発現は依然として36週間後注射後に観察された（データは示さず）。
図4 RPEの例強膜/脈絡/コンプレックスGFP / RFP遺伝子（倍率：40倍）とレンチウイルスの網膜下注射後10週をフラットマウントします。（A）緑チャンネルをGFP（B）RFPのための赤チャンネルのために。スケールバー：500μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
RPE /脈絡膜/強膜複合マンションの実施例5図GFP / RFP遺伝子（倍率：400倍）でのレンチウイルスの網膜下注射後-mount 10週間。（A）GFP（B）RFPのための赤チャネルのための緑のチャンネル。スケールバー：50μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このビデオの記事では、RPE /脈絡膜/強膜フラットマウントの代表的な結果で詳細に輪部-アプローチ網膜下注入技術を説明しました。これは、RPEへのウイルスベクターの網膜下注射のための簡単で便利な技術です。注入時のブレブ形成の直接可視化は初心者のための正確な配達のための重要なステップです。可視化実験8-10誌で紹介し、いくつかの網膜下注入技術があります。網膜下腔は網膜とRPEの間の潜在的な空間であり、したがって、網膜下腔に接近するための2つの可能なルートがあります。一つは、硝子体と網膜を介して網膜下腔への内部的なアプローチであり、他方は、RPEおよび強膜を介して外部のアプローチです。この縁-アプローチ網膜下注入技術は、硝子体内空間と網膜を介して、前者です。この技術は、後者に比べて後方ブレブ形成を提供するという利点を有しているため、後者のApproachは周辺網膜を介して行われるべき、強膜トンネルまたは切開を介して周辺側からブレブを行います。また、シンプルな輪部穿刺は、網膜の浸透せず、強膜トンネルよりも容易です。新生仔マウスの場合、しかし、それは外部のアプローチ9を用いることがより適切であろう。新生児マウスの眼球が非常に小さいとレンズの完全であるため、輪部·アプローチの手法は、不要な白内障形成、あるいは眼球萎縮を引き起こす可能性があります。
このプロトコルでいくつかの重要なステップがあります。まず、最初の穿刺は、角膜にすぎ前方穿刺虹彩投獄を行い、またはあまりにも後方穿刺は周辺網膜に直接穴を作るための場所が少し輪部に後方にする必要があります。第二に、それは最初の穿刺しながら針でレンズを打撃を避けるように注意することをお勧めします。これは、レンズの穿刺を回避するために、針の全体のかさを挿入しない方が良いです。第三に、B針のESTの進入角は、虹彩面に対して約45度であり、鈍い針は乳頭周囲の領域に向かって後方に押されるべきです。最後に、針は、それ以外の場合は変位針が硝子体内注射を引き起こし、均一なブレブ形成、その結果、注射中網膜下腔に配置する必要があります。
目は遺伝子治療の11の魅力的な標的にするユニークな機能を備えた小さな器官です。具体的には、比較的低毒性および眼における免疫反応と有害な全身作用に遺伝子治療を可能にし、免疫特権を持つ小囲まれた区画があります。外科的アプローチに簡単に可視化し、準備ができて、アクセシビリティの遺伝子治療のための眼の他の利点です。網膜は、10の別個の層を有する高度に組織の層状構造を有しています。したがって、正確な空間的な遺伝子送達は、眼内注射の適切な方法によって達成することができます。 INTRのための2つの最も一般的な方法ウイルスベクターのaocular送達は、硝子体内注射し、網膜下注射6です。一般的には、硝子体内注射は、網膜神経節細胞とミュラー細胞を標的と内側の網膜のための好ましい経路です。網膜下注射は光受容体細胞及びRPE細胞を標的外網膜のための好ましい経路です。 RPEにおける効率的な形質導入のためには、網膜への損傷の可能性にもかかわらず、網膜下にウイルスベクターを送達することが必要です。
本研究では、視覚化のために、GFPおよびRFPにLVベクターを使用していました。ウイルスベクターは、網膜の特定の細胞型に対する向性を有するので、ウイルスベクターはAAV、LVの親和性、及び5細胞を標的とする広告に応じて選択されるべきです。例えば、AAV2 / 2は、AAV2 / 6およびAAV2 / 8はRGCとミュラー細胞への最高の形質導入効率です。 AAV2 / 5、2/7、2/8と2/9を効率的にAAV2 / 8はマウス5,12の中で最も効率的な血清型であると、光受容体細胞およびRPEを形質導入します5を形質導入します。 LVベクターは、硝子体内注射後の網膜下注射の13後のRPE細胞中での発現が、 ほとんど、または全く発現の高レベルがあります。
RPEへの効果的な遺伝子送達のために、ウイルスプロモーターも考慮すべきです。そのようなサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよびキメラニワトリβ-アクチン/ CMVエンハンサープロモーターなどのウイルスプロモーターは、従って、それらは、遺伝子治療研究の大部分で使用される、強力なユビキタスプロモーターです。 RPEは、CMVプロモーターは、RPE65プロモーター14と比較して10倍ほどタンパク質を発現すると推定されます。 RPE65の優れた表現によって示されるように重要なのは、血清型を含むプロモーターおよびウイルスベクターの最適な組み合わせは、より良い結果を得るために達成する必要があるときに、人間RPE65プロモーター/ 2 15 rAAV2をより血清型rAAV2を/ 4にパッケージ化されています。 RPE細胞への遺伝子送達を中心に、RPE-SP例えば、RPE65またはVMD2プロモーターなどecificプロモーターがオフターゲット安全性が16を発行低減します。
AMDは、ドライ型AMDと呼ばれる変性相、などの滲出型AMDと呼ばれる脈絡膜血管新生によって特徴付けられる位相を持つ2つの段階があり、複雑な疾患です。また、AMDは、補体因子H（CFH）を含む多数の遺伝的感受性は、I（CFI）、加齢性黄斑症感受性2（ARMS2）とアポEが17因子 、環境リスクと組み合わされる要因を、C3を補完する補完する疾患です。によりAMDの遺伝的リスク因子の複雑な性質のために、その遺伝子治療のための単一の候補遺伝子が存在しません。したがって、AMDにおける現在の遺伝子治療は、滲出型AMD 18における脈絡膜血管新生を標的とする抗血管形成タンパク質を発現する遺伝子導入に焦点を当てています。いかなる候補遺伝子は、遺伝子治療で乾燥AMDを治療するための、まだ存在しません。最近、我々は、細胞内のアミロイドβの蓄積ができたことを示唆しましたトランスジェニックマウス19で、AMDの機能を乾燥に関連します。また、網膜下に注入されたアミロイドβマウスはRPE中に取り込まれた（データは公開されていません）。我々は、ウイルスプロテアーゼ20で細胞内のアミロイドβを切断することができます。そこで、さらに潜在的なターゲットとドライAMDにおける遺伝子治療を研究しました。
結論として、眼疾患における遺伝子治療は、他の臓器よりも有望です。また、網膜下注射は、特に光受容体およびRPE細胞に関連して、網膜疾患における遺伝子治療のための基本的な技術です。そこで、この技術は、より広く使用されているになり、単一遺伝子継承網膜症にも加齢黄斑変性症だけでなく、遺伝子治療の発展に貢献できることを願っています。
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Acknowledgments
この研究は、ソウル大学研究助成（800から20140542）によってサポートされていました、NRF / MESTのパイオニア研究プログラム（2012から0009544）、およびNRF / MESTの生体信号解析技術イノベーションプログラム（2009から0090895）、とNRF / MESTのグラント（2015M3A9E6028949）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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