Introduction
ברפואת עיניים, ריפוי גנטי התגלה כשיטת הטיפול בretinopathies ירש monogenic. יש retinopathies ירושה הקשורים לגנים באפיתל של רשתית פיגמנט (RPE) כולל amurosis לבר מולדת 1,2, פיגמנטוזה רטיניטיס 3, וchoroideremia 4. שדה המחקר של ריפוי גנטי מתרחב בשני מחקרים פרה-קליניים וניסויים קליניים באמצעות וקטורים ויראליים כגון וירוס adeno -associated (AAV), lentivirus (LV) ואדנווירוס (מודעות) 5. יש וקטורים ויראליים שונים כמיהות שונות ברשתית. לריפוי גנטי בטוח ויעיל, יש לבחור וקטורים ויראליים בזהירות בהתאם לתאי מטרה וגני המטרה.
תוואי מסירת הגן הוא גם חשובים למסירת גן יעילה למקד תאים, ובכך, אותו יש לבחור בקפידה, כמו גם. שתי שיטות הנפוצות ביותר למסירת התוך עינית של וקטורים ויראליים הם subretהזרקת INAL והזרקת זגוגית 6. ההזרקה האחרונה, הזגוגית, כבר בשימוש נרחב למסירת תרופה לטיפול בneovascularization choroidal בניוון רטוב הקשורות לגיל מקולרי (AMD) ובצקת מקולרית ברטינופתיה סוכרתית 7. מסלול זגוגית מספק חשיפה של וקטורים ויראליים לרשתית זגוגית והפנימית, אבל דיפוזיה של הווקטורים לרשתית חיצונית היא מוגבלת. מצד השני, מסלול subretinal מספק משלוח ישיר של וקטורים ויראליים למרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית, גרימת בועה מקומית. לכן, הזרקת subretinal נחשבת כיום דרך יעילה יותר למיקוד תאי קולטי האור ורשתית. במונחים של גישה ניתוחית, pars Plana נבחר כאזור בטוח להזרקת זגוגית כדי למנוע נזק ברשתית בחולים אנושיים. פשוט על ידי שינוי בגישה זו כדי עכברים, אנחנו יכולים להזריק וקטורים ויראליים subretinally או intravireally באמצעות גישת limbal.
בסרטון הזהמאמר, אנחנו מדגימים שיטה קלה ונוחה של הזרקת subretinal של וקטורים ויראליים לרשתית עכברים. לאחר ניקור יחיד באחורי לימבוס עם מחט 30 G 1/2, מזרק microliter המצויד 33 מחט קהה G מוכנס לתוך חלל subretinal באמצעות האתר לנקב limbal. הווקטורים ויראליים של 1.5 - 2 μl נפח מוזרקים למרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית גרימת שלפוחיות subretinal. הליך זה יכול להתבצע תחת הדמיה ישירה באמצעות מיקרוסקופ הניתוחי. תרגול חוזרים ונשנים יבטיח תוצאות לשכפול גם ללא הדמיה ישירה של היווצרות בועה. זה יעזור לי החוקרים לבצע ניסויים מדויקים וחיסכון בזמן למסירת גן subretinal ברשתית עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לעמותה למחקר בהצהרת חזון ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, וההנחיות והתקנות שנקבעו על ידי הוועדה מוסדית אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש סיאול הלאומית וסיאול הלאומית ועדת בטיחות ביולוגית בבית חולים האוניברסיטאי.
1. הכנת ערכת הזרקה ווקטורים ויראליים
- הכן את מזרק microliter מצויד במחט קהה 33 G המעוקרים באמצעות גז אתילן אוקסיד. לדלל את הווקטורים ויראליים בPBS לכייל נאות בצינור מיקרו (כלומר, 1 x 10 6 TU / μl). לשטוף את המזרק מספר פעמים עם וקטורים ויראליים כדי להסיר כל שטח מת במזרק.
2. הזרקת subretinal של וקטורים ויראליים
- להרדים את העכברים הבוגרים (כלומר, 6-8 שבועות) עם זריקת intraperitoneal של התערובת של tiletamine וzolazepam (1: 1, 2.25 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) וhydrochloride xylazine (0.7 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) או משטר הרדמה מתאים חלופית.
- להתרחב תלמידים עם ירידה של 0.5% עין phenylephrine וtropicamide 0.5%.
- הכן את מזרק microliter על ידי טעינה עם 1.5 - 2 μl של וקטורים ויראליים.
- פתח את העפעף ובולט לעין כדי לחשוף את קו המשווה להזרקה נוחה ולהתמקד במתחת למיקרוסקופ ההפעלה. לשמור על מיקום העין בלטו עד גמר ההזרקה, או עקירה של המחט יכול להתרחש במהלך ההזרקה. להחזיק את גלגל העין בחוזקה, למקם את האצבעות מחוץ לשפת מסלולית.
- החל ירידה של פתרון viscoelastic עיניים אל פני השטח של הקרנית.
- מקום שקופית כיסוי עגול קטנה בחלק העליון של הקרנית כדי להמחיש את הרשתית.
- לנקב חור קטן באחורי קלה לימבוס באמצעות מחט סטרילית 30 G 1/2 להזרקת subretinal נוספת. הפוך את החור נחותים FOr עין ימין, ומעולה לעין השמאל לנוחות.
הערה: אם החור הוא עשה בזמן, או באף, זה קשה להיות מכוסה על ידי העפעף לאחר ההזרקה. לנקב ראשוני צריכים להיעשות מעט אחורי לימבוס, כדי למנוע את כלי limbal אשר לרוץ לאורך ימבוס וניתן לזהות בקלות. להיות זהיר כדי להימנע מפגיעה בעדשה עם מחט בעת ביצוע הניקור הראשוני. אל תכניס את כל השיפוע של המחט, כדי למנוע ניקור עדשה. - מניחים את המחט הקהה 33 G של מזרק microliter דרך החור המנוקב מראש ומתקרב למחט לתוך חלל subretinal עד הנקודה שבה התנגדות קלה מורגשת.
הערה: להזרקת subretinal, זווית הגישה הטובה ביותר של המחט היא כ -45 מעלות נגד מטוס איריס, והמחט הקהה יש דחף בדיעבד כלפי אזור peripapillary. כיכר מנוקדת הצביעה על מסלול המחט הציע על פני חלל הזגוגית לInjectio subretinaln באיור 1.
הערה: לא יהיה התנגדות הרגישה כאשר פירסינג (או הפטירה) שכבות רשתית כפי שהם רכים מאוד. לפיכך, התחושה הראשונה של התנגדות מתונה מצביעה על כך שהמחט כבר נגעה בשכבת הרשתית והחדרת המחט צריכה להיפסק. היזהר שלא לחדור לרקמות scleral עם לחץ מוגזם בגלל המחט צריכה להיות ממוקמת בחלל subretinal הפוטנציאלי. אם המחט מפוצצת רקמות scleral ידי כוח מופרז, הוא נכנס לתוך חללי מסלולית extraocular ללא התנגדות. (שלב זה הוא קריטי)
איור 1. סכמטי תרשים של הזרקת subretinal. H & E סעיף מוכתם צלב של העין העכבר המתארת את המבנים עם מסלול מחט להזרקת subretinal המסומן (כיכר מקווקו). הגדלה: 40X, בר סולם: 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- להזריק את הווקטורים ויראליים (כלומר, 1 x 10 6 TU / μl) בעדינות לתוך חלל subretinal ללא רעד, כדי למנוע נזק לרקמות לא רצויים ולמשוך את המחט בעדינות. החזק את גלגל העין בחוזקה במהלך ההזרקה כפי שתואר ב2.4.
- לצפות את ההיווצרות של בועה subretinal לאחר ההזרקה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שאין דימום ברשתית.
איור 2. גיבוש subretinal Belb ללא רשתית דימום. מבט מיקרוסקופי של belb subretinal לאחר הזרקת subretinal תחת מיקרוסקופ ניתן לראות היווצרות בועה מוצלחת ללא דימום ברשתית.מ '/ קבצים / ftp_upload / 53030 53030fig2large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- בעדינות לסגור את העפעף כדי לכסות את אתר ההזרקה לאיטום עצמי. להחזיר את העכברים לכלוב בבית ולהישאר בחיים עד ההערכה.
הערה: לאחר שהחוקרים להתרגל לנהלים, הם יכולים לקבל את תוצאות הדיר עם נהלים מהירים על ידי דילוג על השלבים הבאים (2.5, 6, ו -10)
3. הערכת היעילות של ג'ין משלוח ברשתית פיגמנט האפיתל
- להקריב את העכברים בתא CO 2. Enucleate העיניים באמצעות מספריים.
- תקן את העיניים בפתרון paraformaldehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 מינימום לכמה ימים.
- תפוס את הקרנית עם מלקחיים עדינים ולנקב את הקרנית עם מיקרו מספריים. הסר את הקרנית לאחר המספריים לאורך ימבוס. הסר את העדשה עם מלקחיים.
- חתוך את גוף הריסים עם מ 'icro-מספריים המאפשרים היפרדות רשתית. משוך בעדינות את כל הרשתית מהרשתית / דמית העין / מורכבת לובן העין. חותך את הרשתית / דמית העין / המורכב scleral רדיאלית מהפריפריה למרכז ליד כמה פעמים עצב הראייה לעשות 4-8 עלים להרכבה שטוחה.
- הפוך את הרשתית / דמית העין / המורכב scleral לעשות צד הרשתית למטה, ולקצץ את כל הרקמות שנותרו בצד scleral כולל שרירים, לחמית ועצב ראייה. שלב זה חשוב לעשות הרשתית / דמית העין / מורכב scleral שטוח כי כל רקמה שנותרה הופכת אחידה מורכב.
- דגירה מורכבת עם נוגדן ראשוני והמשני למטרות הספציפיות שלך המחקר (אופציונליות, ראה אזכור לשיטות מפורטות). שטוח הר הרשתית / דמית העין / מתחמי scleral בשקופית הזכוכית ולספוג את PBS עם ספוג סופג.
- הוסף 30 μl של פתרון הרכבה ולמקם את כיסוי השקופיות. שים לב לדוגמא ליעילות של משלוח וקטור תחת מיקרוסקופ והעמסת. שמור את הדגימות בהמקרר לתצפית נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את היעילות של הזרקת subretinal על התמרה גנטית נגיפית על ידי פרוטוקול זה, השתמשנו וקטורי LV זמינים מסחרי עם אמרגן CMV להביע שני GFP וRFP למדד. עיניים enucleated לאחר תקופת הזמן המתאימה בהתאם למטרת המחקר. לקבלת תוצאות הנציג, עיניים enucleated 10 שבועות ו -20 שבועות לאחר הזרקת subretinal. לאחר הסרת הרשתית תוך שימוש בשיטה שתוארה לעיל שלמה, ההר השטוח של מורכב / דמית העין / בלובן העין הרשתית הוערך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תוצאות הנציג היו מוצגות באיור 3 א (דוגמא טובה עם ההסרה של הרשתית מלאה) ואיור 3 (דוגמא גרועה עם רשתית שלמה). למרות קיומם של רשתית שריד עצבית (במיוחד קטע חיצוני קולטי האור) מעל שכבת הרשתית לא התערב כדי לנתח את האזור של מסירת הגן ברשתית, זה חסם את הקרינה של ה- GFP / RFP וvisua ישיר עכבות lization של שכבת הרשתית לניתוחים נוספים. לכן, ההסרה של רשתית עצבית מהמתחם / דמית העין / בלובן העין הרשתית מלאה תספק תוצאות טובות יותר.
איור 3. דוגמא של הרשתית / דמית העין / Scleral מורכב שטוח הר-פי ההסרה המלאה של רשתית. עשרים שבועות לאחר הזרקת subretinal של Lentivirus עם GFP / RFP ג'ין. (א) דוגמא טובה של הרשתית שטוחה הר עם ההסרה של הרשתית מלאה מראה ביטוי ברור ודיסקרטי של ה- GFP / RFP בתאי הרשתית. דוגמא גרועה של הרשתית (ב) שטוח הר בשל אין ההסרה של הרשתית מציגה את האזור של מסירת גן עם אותות RFP שאינה מספק כדי לנתח את הפתולוגיה הרשתית. הגדלה: 40X, בר סולם:. 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ילדה = "jove_content"> קשה לשפוט את היעילות על ידי הניתוח כמותי בגלל עוצמות אות של ה- GFP / RFP משתנות בתאי הרשתית של האזור המוזרק. בנוסף, באזור של התמרה הוא מוגבל לאזור של היווצרות בועה לאחר הזרקה. כך, זה יהיה אמין יותר לשפוט את היעילות על ידי הנוכחות של ה- GFP / ביטוי RFP לפי כייל הנגיף לאותו נפח מוזרק (כלומר 2 μl). זה עוזר להתאים כייל נגיף מתאים לניסוי.
תוצאות הנציג של הרשתית / דמית העין / הר scleral מורכב שטוח 10 שבועות לאחר הזרקת subretinal הוצגו בהגדלה שונות באיור 4 (40X) ואיור 5 (400X). התמונות עם הגדלה נמוכה מספיק כדי להעריך את השטח של ביטוי / RFP GFP. מצד השני, את התמונות עם הגדלה גבוהה הן הכרחיות לפתולוגיה אחרת הרשתית בנוגע למטרות הספציפיות של החוקרים. שנינות תמונות אלהההגדלה השונות h לעזור להבין את דפוס ביטוי ויראלי ברשתית (איור 4 ו -5). יש לנו גם בדקתי את הביטוי של ה- GFP / RFP עד 36 שבועות לאחר הזרקה. הביטוי של ה- GFP / RFP עדיין נצפה לאחר 36 שבועות לאחר הזרקה (מידע לא מוצג).
איור 4. דוגמא של הרשתית / דמית העין / Scleral הר שטוח קומפלקס 10 שבועות לאחר הזרקת subretinal של Lentivirus עם GFP / ין RFP (הגדלה: 40X). () מסלול ירוק לGFP (ב) המסלול אדום לRFP. בר סולם:. 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. דוגמא של הרשתית / דמית העין / Scleral מורכב שטוחה-mount 10 שבועות לאחר הזרקת subretinal של Lentivirus עם GFP / ין RFP (הגדלה: 400X). () מסלול ירוק לGFP (ב) המסלול אדום לRFP. בר סולם:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה וידאו, שתארנו את טכניקת הזרקת subretinal limbal-גישה בפירוט עם תוצאות נציג של הרשתית / דמית העין / שטוח הר scleral. זוהי טכניקה קלה ונוחה להזרקת subretinal של וקטורים ויראליים לרשתית. הדמיה ישירה של היווצרות בועה במהלך ההזרקה היא צעד חשוב למסירה מדויקת למתחילים. יש כמה טכניקות הזרקת subretinal הציגו בכתב העת של ניסויי Visualized 8-10. חלל subretinal הוא המרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית, ולכן יש שני מסלולים אפשריים להתקרב למרחב subretinal. אחת מהן הוא גישה בתוך למרחב subretinal באמצעות זגוגית ורשתית, והשני הוא גישה מחוץ באמצעות הרשתית ולובן עין. טכניקת הזרקת subretinal limbal-גישה זו היא אחד לשעבר באמצעות מרחב ורשתית זגוגית. טכניקה זו יש יתרון לספק יותר היווצרות בועה אחורית בהשוואה לזו האחרונה, כי זה האחרוןpproach עושה בועה מהצד ההיקפי באמצעות מנהור או חתך scleral, שאמורה להתבצע על פני הרשתית ההיקפית. בנוסף, לנקב limbal פשוט קל יותר מנהור scleral ללא חדירת רשתית. לעכברים בילוד, לעומת זאת, זה יהיה יותר מתאים לשימוש בגישה מחוץ 9. בגלל גלגל העין של העכבר בילוד הוא מאוד קטנה ומלא של העדשה, טכניקת limbal-גישה יכולה לגרום להיווצרות קטרקט לא רצויה או אפילו bulbi שחפת.
ישנם כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. קודם כל, לנקב ראשוני צריך להיות מקום מעט אחורי לימבוס כי לנקב קדמי מדי בקרנית הופכת כליאת איריס, או לנקב אחורי מדי עושה חור ישיר ברשתית ההיקפית. שנית, מומלץ להיות זהיר כדי להימנע מפגיעה בעדשה עם מחט בעת ביצוע הניקור הראשוני. עדיף לא להכניס את כל השיפוע של המחט, כדי למנוע ניקור עדשה. שלישית, בזווית גישת est של המחט היא כ -45 מעלות נגד מטוס איריס, והמחט הקהה יש דחף בדיעבד כלפי אזור peripapillary. לבסוף, המחט צריכה להיות ממוקמת בחלל subretinal במהלך ההזרקה, וכתוצאה מכך תצורות בועה אחידות, אחרת המחט נעקרה גורמת הזרקת זגוגית.
העין היא איבר קטן עם תכונות ייחודיות שהופכות אותו ליעד אטרקטיבי לריפוי גנטי 11. באופן ספציפי, זה תא-סגור קטן עם חיסון זכות המאפשר ריפוי גנטי עם רעילות נמוכה יחסית ותגובות חיסוניות בעיניים והשפעות מערכתיות לוואי. הדמיה קלה ונגישות מוכנה גישות כירורגיות יתרונות אחרים של העין לריפוי גנטי. יש רשתית מבנה מינרית מאוד מאורגן עם 10 שכבות נפרדות. לפיכך, משלוח גן המרחבית מדויק יכול להיות מושגת רק על ידי השיטות המתאימות של הזרקה תוך-עיני. שתי שיטות הנפוצות ביותר לIntrמשלוח aocular של וקטורים ויראליים הוא הזרקת זגוגית והזרקת subretinal 6. באופן כללי, הזרקת זגוגית היא הדרך המועדפת לרשתית פנימית מיקוד תאי הגנגליון ברשתית ותאי מולר. הזרקת subretinal היא הדרך המועדפת לרשתית חיצונית מיקוד תאי קולטי האור ותאי הרשתית. לתמרה יעילה ברשתית, יש צורך לספק וקטורים ויראליים subretinally למרות הפוטנציאל לנזק לרשתית.
במחקר זה, השתמשנו וקטורי LV עם GFP וRFP להדמיה. כי יש לי וקטורים ויראליים כמיהות לסוגי תאים מסוימים של הרשתית, יש לבחור וקטורים ויראליים לפי כמיהות של AAV, LV, ומודעות למקד תאים 5. לדוגמא, AAV2 / 2, AAV2 / 6 וAAV2 / 8 הם יעילות התמרה הגבוהה ביותר לתאי RGC ומולר. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 ו2/9 יעילות transduce תאי קולטי האור ורשתית עם AAV2 / 8 להיות סרוטיפ יעיל ביותר בעכברים 5,12 5. לוקטורי LV, יש רמה גבוהה של ביטוי בתאי הרשתית לאחר זריקות subretinal, אבל ביטוי קטן או לא לאחר זריקות זגוגית 13.
למסירת גן יעילה לרשתית, יזמים נגיפיים יש גם נחשבים. יזמי ויראלי, כגון ציטומגלווירוס אמרגן (CMV) וביתא-אקטין עוף chimeric / אמרגן משפר CMV הם יזמים חזקים ונמצאים בכל מקום, ובכך, הם משמשים ברוב מחקרי ריפוי גנטי. ברשתית, אמרגן CMV מוערך להביע פי עשרה פחות חלבון בהשוואה לאמרגן RPE65 14. חשיבות, השילוב האופטימלי של האמרגן ווקטורים ויראליים כוללים סרוטיפ צריך להיות מושגת לתוצאות טובות יותר כפי שהודגם על ידי ביטוי מעולה של RPE65 כאשר אמרגן RPE65 אדם ארוז בסרוטיפ רמת rAAV2 / 4 מרמת rAAV2 / 2 15. התמקדות באספקת גן לתאי הרשתית, הרשתית-spיזמי ecific כגון RPE65 או אמרגן VMD2 מפחיתים את הבטיחות מחוץ היעד מנפיקה 16.
AMD הוא מחלה מורכבת שיש לו שני שלבים עם שלב ניוונית המכונה AMD יבש ושלב המאופיין neovascularization choroidal מכונה AMD הרטוב. כמו כן, AMD היא מחלה שבה רגישויות גנטיות רבות, כולל H גורם משלים (דנ"א), משלימה C3, משלימות גורמי (CFI), רגישות הקשורות לגיל Maculopathy 2 (ARMS2) וApoE בשילוב עם גורמי סיכון סביבתי 17. בשל האופי המורכב של גורמי סיכון גנטיים בAMD, אין גן מועמד יחיד לריפוי הגנטי שלו. לפיכך, הטיפול הגנטי הנוכחי בAMD הוא על העברת גנים התמקד להביע חלבונים אנטי-angiogenic מיקוד neovascularization choroidal בAMD הרטוב 18. אין גן מועמד עדיין לטיפול ב- AMD היבש עם ריפוי גנטי. לאחרונה, הצענו שיכלה הצטברות עמילואיד ביתא תאיתלהיות קשור לייבוש תכונות AMD בעכברים הטרנסגניים 19. בנוסף, ביתא עמילואיד הזריק subretinally נלקח על ידי הרשתית בעכברים (נתונים לא פורסמו). אנחנו יכולים לדבוק ביתא עמילואיד תאיים עם פרוטאז הנגיפי 20. לפיכך, יש לנו למדנו עוד הטיפול הגנטי בAMD היבש עם יעדים פוטנציאליים.
לסיכום, טיפול גנטי במחלה עינית הוא מבטיח יותר מאשר בכל איבר אחר. בנוסף, הזרקת subretinal היא טכניקה בסיסית לטיפול גנטי במחלות רשתית, במיוחד ביחס לתאי קולטי האור ורשתית. לפיכך, אנו מקווים כי טכניקה זו הופכת שימוש נרחב יותר ויכולה לתרום לקידום הריפוי גנטי לא רק בmonogenic ירשה רטינופתיה אלא גם בניוון מקולרי הקשור לגיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי סיאול האוניברסיטה הלאומית מענק המחקר (800-20140542), תכנית פיוניר המחקר של NRF / MEST (2012-0009544), וניתוח הטכנולוגיה התכנית ביו-האיתותים החדשנות של NRF / MEST (2009-0090895), וגרנט של NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J.
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M.
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B.
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
