Introduction
I oftalmologi, har genterapi dukket opp som behandlingsform i monogene arvet retinopatier. Det er arvet retinopatier knyttet til gener i retinal pigment epitel (RPE) inkludert Leber medfødt amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3, og choroideremia 4. Forskningen innen genterapi er i vekst både i prekliniske studier og kliniske forsøk med virale vektorer som adeno -associated virus (AAV), lentivirus (LV) og adenovirus (Ad) 5. Forskjellige virale vektorer har forskjellig tropisme i retina. For en sikker og effektiv genterapi, bør virale vektorer være nøye valgt i henhold til målceller og mål gener.
Den rute for genavlevering er også viktig for effektiv genavlevering til målceller, derfor bør det være nøye valgt i tillegg. De to vanligste fremgangsmåter for intraokulær levering av virale vektorer er subretInal injeksjon og intravitreal injeksjon 6. Sistnevnte, intravitreal injeksjon, har vært mye brukt for levering av legemidler til behandling av koroidal neovaskularisering i våt aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og makulaødem i diabetisk retinopati 7. Intravitreal rute gir eksponering av virale vektorer til glasslegemet og indre retina, men diffusjonen av vektorene til ytre retina er begrenset. På den annen side gir den subretinal ruten direkte levering av virale vektorer til potensialet mellomrom mellom netthinnen og RPE, indusere en lokalisert bleb. Derfor er subretinal injeksjon antatt å være mer effektive ruten for målretting fotoreseptorcellene og RPE. I form av kirurgisk tilnærming, pars plana er valgt som et sikkert område for intravitreal injeksjon for å unngå retinal skade hos mennesker. Ved ganske enkelt å endre denne tilnærmingen til mus, kunne vi injisere virale vektorer subretinally eller intravireally via limbale tilnærming.
I denne videoenartikkelen viser vi en enkel og praktisk metode for subretinal injeksjon av virale vektorer i mus RPE. Etter én punktering på bakre til limbus med en 30 G 1/2 nål, er en 33 G butt nål utstyrt mikroliter sprøyte settes inn i subretinal plass via limbale stikkstedet. De virale vektorer av 1,5 til 2 mL volum injiseres til potensialet plass mellom netthinnen og RPE indusere subretinal blebs. Denne prosedyren kan utføres under direkte visualisering ved hjelp av kirurgisk mikroskop. Gjentatte praksis vil garantere kopier resultater selv uten direkte visualisering av bleb formasjonen. Dette vil hjelpe forskerne til å utføre nøyaktige og tidsbesparende eksperimenter for subretinal genavlevering i mus RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøk på dyr ble utført i henhold til Association for Research in Visjon og Ophthalmology Statement for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research, og de retningslinjer og bestemmelser fastsatt av Seoul National University Institutional Animal Care og bruk komité og Seoul National Universitetssykehuset biosikkerhet Committee.
1. Klar Injection Kit og virale vektorer
- Forbered mikroliter sprøyte utstyrt med en 33 G butt nål sterilisert med etylenoksid gass. Fortynn de virale vektorer i PBS for tilstrekkelig titer i mikrorøret (dvs. 1 x 10 6 TU / ul). Skyll sprøyten flere ganger med virale vektorer for å fjerne eventuelt dødrom i sprøyten.
2. subretinal Injeksjon av virale vektorer
- Bedøve voksne mus (dvs. 6 - 8 uker gamle) med en intraperitoneal injeksjon av blandingen av tiletamine og zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg kroppsvekt) og xylazin-hydroklorid (0,7 mg / kg kroppsvekt) eller et annet passende anestesi regime.
- Utvid elever med øyedråper av fenylefrin 0,5% og Tropicamide 0,5%.
- Forbered mikroliter sprøyten ved å laste med 1,5 til 2 mL av virale vektorer.
- Åpne øyelokket og stikke øyet å eksponere ekvator for enkel injeksjon og fokusere på under operasjonsmikroskop. Opprettholde den fremskutte stillingen til øyet endt injeksjon, eller forskyvning av nålen kan skje under injeksjonen. Å holde øyeeplet fast, plasserer fingrene utenfor orbitalranden.
- Påfør en dråpe oftalmisk viskoelastisk løsning hornhinneoverflaten.
- Plasser en liten runde dekkglass på toppen av hornhinnen for å visualisere netthinnen.
- Punktere et lite hull på svak posteriort for limbus ved hjelp av en steril 30 G 1/2 nål for den videre subretinal injeksjon. Lag hullet dårligere for høyre øye, og overlegen for venstre øye for det praktiske.
MERK: Hvis hullet er laget på timelig eller nasal, er det vanskelig å være dekket av øyelokket etter injeksjonen. Initial punktering bør gjøres noe posteriort for limbus å unngå limbale fartøy som går langs limbus og kan lett gjenkjennes. Vær nøye med å unngå å treffe objektivet med nål, samtidig som den første punktering. Ikke sett hele skrå av nålen for å unngå linse punktering. - Plasser 33 G butt nål av mikroliter sprøyte gjennom pre-punktert hull og nærmer nålen i subretinal plass til punktet når mild motstand.
MERK: For subretinal injeksjon, er den beste tilnærmingen vinkelen på nålen ca 45 grader mot iris flyet, og butt nål skal skyves baktil mot peripapillary området. Prikket torget indikerte foreslo nål sti over glasslegemekaviteten for subretinal injeksjonn i figur 1.
MERK: Det blir ingen motstand følte da piercing (eller bestått) netthinnens lag som de er veldig myk. Dermed blir første følelsen av mild motstand indikerer at nålen har allerede berørt RPE-laget og innsetting av nålen bør stoppes. Vær forsiktig med å trenge scleral vev med høyt trykk fordi nålen bør plasseres i den potensielle subretinal plass. Hvis nålen punkterer scleral vev av overdreven makt, går den inn i extraocular orbital områder uten motstand. (Dette trinnet er kritisk)
Figur 1. Skjematisk fremstilling av subretinal Injection. H & E farget tverrsnitt av musen øyet som viser strukturene med en nål vei for subretinal injeksjons merket (en stiplet firkant). Forstørrelse: 40X, Skala: 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Injisere de virale vektorer (dvs. 1 x 10 6 TU / mikroliter) forsiktig inn i subretinal plass uten tremor å unngå uønsket vevsskade og trekke nålen forsiktig. Hold øyeeplet fast under injeksjonen, som beskrevet i 2.4.
- Observere dannelsen av subretinal bleb etter injeksjon under drifts mikroskop for å sørge for at det ikke er noen retinal blødning.
Figur 2. subretinal Belb Formation uten Netthinne Blødning. Mikroskopisk visning av subretinal belb etter subretinal injeksjon under operasjonsmikroskop viser vellykket bleb formasjon uten retinal blødning.m / filer / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Lukke forsiktig øyelokket for å dekke for selvtettende injeksjonsstedet. Returnere musene til hjemmet buret og holde i live til evalueringen.
MERK: Etter at forskerne blir vant til prosedyrene, kan de få repeterbare resultater med raske prosedyrer ved å hoppe over disse trinnene (2,5, 6 og 10)
3. Evaluering av effekten av Gene Levering i retinal pigment epitelet
- Ofre musene i CO 2 kammer. Enucleate øynene med saks.
- Fest øynene i 4% paraformaldehydløsning ved 4 ° C i minst en time til noen dager.
- Ta tak i hornhinnen med fin pinsett og punktering hornhinnen med mikro-saks. Fjern hornhinnen etter klipping langs limbus. Fjern linsen med pinsett.
- Trim ciliarkropp med micro-saks slik netthinneavløsning. Trekke hele netthinnen fra RPE / årehinnen / sklera kompleks forsiktig. Kutt RPE / årehinnen / scleral kompleks radialt fra periferi til sentrum nær synsnerven flere ganger for å være 4-8 blader for flat montering.
- Vend RPE / årehinnen / scleral komplisert å lage RPE siden ned, og trimme alle de gjenværende vev på scleral side, inkludert muskler, konjunktiva og synsnerven. Dette trinnet er viktig å lage en flat RPE / årehinnen / scleral komplisert fordi eventuelle gjenværende vev gjør komplekset ujevn.
- Inkuber kompleks med primær og sekundær antistoff for dine spesifikke forskningsformål (valgfritt, se referansene for detaljerte metoder). Flat-mount RPE / choroid / scleral komplekser på glass-slide og absorbere PBS med en absorberende svamp.
- Legg 30 mL av monteringsløsning og plassere dekselet lysbilde. Observer prøven for effekten av vektor levering i henhold fluorescein mikroskop. Hold prøvene ikjøleskapet for videre observasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere effekten av den subretinal injeksjon på virale gen transduksjon av denne protokoll har vi brukt kommersielt tilgjengelige LV vektorer med CMV-promoter uttrykker både GFP og RFP for indikatoren. Øynene ble enucleated etter den aktuelle tidsperioden i henhold til forskningsformål. For de representative resultater, ble øynene enucleated 10 uker og 20 uker etter subretinal injeksjon. Etter fullstendig fjerning av netthinnen ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor, ble den flate montering av RPE / årehinne / sclera kompleks evaluert under fluorescens mikroskop. De representative Resultatene er vist i figur 3A (godt eksempel med fullstendig fjerning av netthinnen) og figur 3B (dårlig eksempel med intakt netthinnen). Selv om eksistensen av rest neurale netthinnen (særlig fotoreseptoren ytre segment) over RPE lag ikke interfererer for å analysere areal på genavlevering i RPE, det blokkerte fluorescensen av GFP / RFP og hemmet direkte visualization av RPE lag for videre analyser. Derfor ville fullstendig fjerning av nevrale retina fra RPE / choroid / sclera kompleks gi bedre resultater.
Figur 3. Eksempel på RPE / Choroid / Skleral Complex Flat-mount henhold til fullstendig fjerning av Retina. Tjue uker etter subretinal Injeksjon av Lentivirus med GFP / RFP Gene. (A) God eksempel på RPE flat feste med fullstendig fjerning av retina viser klart og diskret ekspresjon av GFP / RFP på RPE-celler. (B) dårlig eksempel på RPE flat montere på grunn av ingen fjerning av retina viser området genavlevering med RFP signaler som er utilstrekkelig til å analysere RPE patologi. Forstørrelse: 40X, Skala:. 500 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
(dvs. 2 ul). Dette bidrar til å justere passende viral titer for forsøket.
De representative resultatene av RPE / årehinnen / scleral kompleks flat mount 10 uker etter subretinal injeksjon ble vist i ulike forstørrelse i figur 4 (40X) og figur 5 (400X). Bildene med lav forstørrelse er nok til å vurdere det området av GFP / RFP uttrykk. På den annen side, bilder med høy forstørrelse er nødvendige for andre RPE patologi hensyn til forskernes bestemte formål. Disse bildene viddH forskjellige forstørrelser hjelpe til å forstå den virale ekspresjon mønster i RPE (figur 4 og 5). Vi har også sjekket uttrykket av GFP / RFP opptil 36 uker etter injeksjonen. Ekspresjon av GFP / RFP var fremdeles observert etter 36 uker etter injeksjon (data ikke vist).
Figur 4. Eksempel på RPE / Choroid / Skleral Complex Flat-mount 10 uker etter subretinal Injeksjon av Lentivirus med GFP / RFP Gene (Forstørrelse: 40X). (A) grønne kanalen for GFP (B) røde kanalen for RFP. Skala:. 500 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Eksempel på RPE / Choroid / Skleral Complex Flat-Mount 10 uker etter subretinal Injeksjon av Lentivirus med GFP / RFP Gene (Forstørrelse: 400X). (A) grønne kanalen for GFP (B) røde kanalen for RFP. Skala:. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne videoen artikkelen, vi beskrev limbale-tilnærming subretinal injeksjonsteknikk i detalj med representative resultatene av RPE / årehinnen / scleral flat-mount. Dette er en enkel og praktisk metode for subretinal injeksjon av virale vektorer i RPE. Direkte visualisering av bleb formasjon under injeksjonen er et viktig skritt for presis levering for nybegynnere. Det er noen subretinal injeksjonsteknikker introdusert i Journal of visualisert Experiments 8-10. Subretinal plass er potensialet plass mellom netthinnen og RPE, derfor er det to mulige ruter å nærme subretinal plass. Den ene er en innvendig tilnærming til subretinal plass via glasslegemet og retina og den andre er en utvendig tilnærming via RPE og sclera. Dette limbale-tilnærmingen subretinal injeksjonsteknikk er den tidligere via intravitreal plass og netthinnen. Denne teknikken har en fordel å tilveiebringe mer posterior bleb formasjon i forhold til sistnevnte, fordi den sistnevnte enpproach gjør en bleb fra den perifere side via skleral tunnele eller innsnitt, som skal gjøres i løpet av den perifere retina. I tillegg er enkel limbale punktering lettere enn skleral tunnele uten retinal penetrasjon. For de neonatale mus, derimot, ville det være mer hensiktsmessig å bruke utenfor tilnærming 9. Fordi neonatal musens øyeeplet er svært liten og full av objektivet, kan limbale-tilnærming teknikk forårsake uønskede katarakt eller phthisis bulbi.
Det er noen viktige skritt i denne protokollen. Først av alt, bør første punktering være plass litt posteriort for limbus fordi for anterior punktering på hornhinnen gjør iris fengsling, eller for posterior punktering gjør direkte hull i perifere retina. Dernest er det anbefalt å være forsiktig for å unngå å treffe objektivet med nål, samtidig som den første punktering. Det er bedre å ikke sette hele skrå av nålen for å unngå linse punktering. For det tredje, best tilnærming vinkelen på nålen er ca 45 grader mot iris flyet, og butt nål skal skyves baktil mot peripapillary området. Endelig bør kanylen plasseres i subretinal plass under injeksjonen, noe som resulterer i uniform bleb formasjoner, ellers den fortrengte nålen fører intravitreal injeksjon.
Øyet er et lite organ med unike funksjoner som gjør det til et attraktivt mål for genterapi 11. Nærmere bestemt er det et lite lukket kammer med immun-privilegier som muliggjør genterapi med forholdsvis lav giftighet og immunreaksjoner i øyet og uønskede systemiske effekter. Lett visualisering og klar tilgang til kirurgiske tilnærminger er andre fordeler i øyet for genterapi. Netthinnen har en svært organisert laminær struktur med 10 forskjellige lag. Således kan riktig romlig genavlevering bare oppnås ved egnede metoder for intraokulært injeksjon. De to vanligste metodene for intraocular levering av virale vektorer er intravitreal injeksjon og subretinal injeksjon 6. Generelt er intravitreal injeksjon den foretrukne rute for indre netthinne målretting retinal ganglion celler og Müller celler. Subretinal injeksjon er den foretrukne ruten for ytre retina målretting fotoreseptorcellene og RPE cellene. For en effektiv transduksjon i RPE, er det nødvendig å gi virale vektorer subretinally til tross for potensialet for skade på retina.
I denne studien brukte vi LV vektorer med GFP og RFP for visualisering. Fordi virale vektorer har tropisme for spesifikke celletyper i netthinnen, bør velges i virale vektorer ifølge tropismen av AAV, LV, og Ad til målceller 5. For eksempel AAV2 / 2, AAV2 / 6 og AAV2 / 8 er det høyeste transduksjon effektiviteten til RGC og Müller celler. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 og 2/9 effektivt transduce fotoreseptorcellene og RPE med AAV2 / 8 er den mest effektive serotype hos mus 5,12 5. For LV vektorer, er det et høyt nivå av ekspresjon i RPE-celler etter subretinal injeksjoner, men lite eller ingen ekspresjon etter intravitreal injeksjon 13.
For effektiv genet levering til RPE, bør viruspromotere skal også vurderes. Virale promotere, så som cytomegalovirus (CMV) promoter, og kimære kylling beta-actin / CMV-enhancer-promoter er sterke og allestedsnærværende promotorer, og dermed er de brukt i flertallet av genterapi studier. I RPE er CMV promoter beregnet til å uttrykke ti ganger så mye protein sammenlignet med RPE65 promoter 14. Av betydning, bør den optimale kombinasjonen av promoteren og virale vektorer inkludert serotype oppnås for bedre resultater, som demonstrert ved overlegen ekspresjon av RPE65 når mennesket RPE65 promoteren er pakket i serotype rAAV2 / 4 enn rAAV2 / 2 15. Med fokus på genet levering til RPE celler, RPE-specific arrangører som RPE65 eller VMD2 promoter reduserer off-target sikkerhetsspørsmål 16.
AMD er en kompleks sykdom som har to faser med en degenerative fase betegnes som tørr AMD og en fase kjennetegnet ved koroidal neovaskularisering referert til som våt AMD. Dessuten er AMD en sykdom hvor mange genetiske tilbøyeligheter inkludert komplement faktor H (CFH), utfyller C3, utfylle faktor I (CFI), er Aldersrelatert maculopathy mottakelighet 2 (ARMS2) og ApoE kombinert med miljørisikofaktorer 17. På grunn av den komplekse natur av genetiske risikofaktorer i AMD, er det ingen enkel kandidat-gen for sin genterapi. Således er den nåværende genterapi i AMD fokusert på genoverføring for å uttrykke anti angiogene proteiner rettet koroidal neovaskularisering i våt AMD 18. Det er ingen kandidat-gen ennå for behandling av tørr AMD med en genterapi. Nylig foreslo vi at intracellulær amyloid beta akkumulering kunnevære relatert til tørr AMD funksjoner i transgene mus 19. I tillegg ble subretinally injisert amyloid beta opptas av RPE i mus (data ikke publisert). Vi kan kløyve intracellulær amyloid beta med viral protease 20. Vi har derfor ytterligere studert genterapi i tørr AMD med potensielle mål.
I konklusjonen, er genterapi i okulær sykdom mer lovende enn i noe annet organ. I tillegg er subretinal injeksjons en grunnleggende teknikk for genterapi i retinale sykdommer, særlig i forhold til fotoreseptorcellene og RPE. Derfor håper vi at denne teknikken blir mer utbredt, og kan bidra til å fremme av genterapi ikke bare i monogenic arvelig retinopati, men også i aldersrelatert makuladegenerasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer Research Program av NRF / MEST (2012-0009544), og Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program for NRF / MEST (2009-0090895), og Grant av NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J.
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M.
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B.
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
