Introduction
In oftalmologia, la terapia genica è emerso come la modalità di trattamento di retinopatie ereditarie monogeniche. Ci sono retinopatie ereditarie associate a geni in epitelio pigmentato retinico (RPE) compresi Leber amurosis congenita 1,2, retinite pigmentosa 3, e Coroideremia 4. Il campo di ricerca della terapia genica si sta espandendo in entrambi gli studi preclinici e sperimentazioni cliniche utilizzando vettori virali come il virus adeno -associated (AAV), lentivirus (LV) e adenovirus (Ad) 5. Vettori virali differenti hanno tropismo differente nella retina. Per una terapia genica efficace e sicuro, vettori virali devono essere attentamente selezionati secondo le cellule bersaglio e geni bersaglio.
Il percorso di consegna del gene è importante anche per il trasferimento genico efficace per cellule bersaglio, quindi, deve essere scelta con attenzione pure. I due metodi più comuni per la consegna intraoculare di vettori virali sono subretiniezione inale e iniezione intravitreale 6. Quest'ultimo, iniezione intravitreale, è stato ampiamente utilizzato per la somministrazione di farmaci per il trattamento di neovascolarizzazione coroidale bagnato degenerazione maculare legata all'età (AMD) ed edema maculare nella retinopatia diabetica 7. Route intravitreale prevede l'esposizione di vettori virali per vitreo e retina interna, ma la diffusione dei vettori di retina esterna è limitata. D'altra parte, il percorso sottoretinico fornisce consegna diretta di vettori virali per lo spazio potenziale tra retina e RPE, inducendo una bozza localizzata. Pertanto, l'iniezione sottoretinica attualmente è considerato un percorso più efficiente per il targeting cellule visive e RPE. In termini di approccio chirurgico, pars plana viene scelto come una zona sicura per l'iniezione intravitreale per evitare danni alla retina in pazienti umani. Con la semplice modifica di questo approccio a topi, potremmo iniettare vettori virali subretinally o intravireally via approccio limbare.
In questo videoarticolo, abbiamo dimostrato un metodo facile e conveniente di iniezione sottoretinica di vettori virali in topi RPE. Dopo singola puntura di posteriormente al limbus con 30 G 1/2 ago, un 33 ago G smussato siringa microlitro attrezzato si inserisce nello spazio sottoretinico attraverso il sito di puntura limbare. I vettori virali di 1,5-2 volumi microlitri vengono iniettati nello spazio potenziale tra retina e RPE indurre blebs subretiniche. Questa procedura può essere eseguita sotto visualizzazione diretta con microscopio chirurgico. Pratica ripetuta garantirà risultati replicabili anche senza la visualizzazione diretta della formazione bozza. Questo aiuterà i ricercatori a condurre esperimenti accurati e risparmio di tempo per la consegna del gene nei topi sottoretinico RPE.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali dell'Università Istituzionale e Usa Comitato Nazionale di Seul e Seoul National University Hospital Comitato Biosicurezza.
1. Preparazione Kit iniezione e vettori virali
- Preparare la siringa microlitro dotata di un ago smussato 33 G sterilizzato con ossido di etilene. Diluire i vettori virali in PBS per il titolo adeguata nel tubicino (cioè, 1 x 10 6 TU / ml). Lavare la siringa più volte con vettori virali per rimuovere qualsiasi spazio morto nella siringa.
2. Iniezione sottoretinico di vettori virali
- Anestetizzare i topi adulti (cioè, 6 - 8 settimane) con una iniezione intraperitoneale di miscela di tiletamine e zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg di peso corporeo) e xilazina cloridrato (0,7 mg / kg di peso corporeo) o un regime di anestesia valida alternativa.
- Dilatare gli alunni con un collirio di fenilefrina 0,5% e tropicamide 0,5%.
- Preparare la siringa microlitro caricando con 1,5 - 2 ml di vettori virali.
- Aprire la palpebra e l'occhio sporgente per esporre l'equatore per l'iniezione comoda e mettere a fuoco sotto il microscopio operatorio. Mantenere la posizione dell'occhio sporgeva fino a terminare l'iniezione, o spostamento dell'ago può verificarsi durante l'iniezione. Per mantenere il bulbo oculare con fermezza, posizionare le dita al di fuori del cerchio orbitale.
- Applicare una goccia di soluzione viscoelastica oftalmica alla superficie corneale.
- Inserire un coperchietto scorrevole rotonda sulla parte superiore della cornea per visualizzare la retina.
- Puntura un piccolo foro in lieve posteriormente al limbus usando una sterile 30 G 1/2 ago per l'ulteriore iniezione sottoretinica. Effettuare il foro inferiore for l'occhio destro e superiore per l'occhio sinistro per la comodità.
NOTA: Se il foro viene effettuata a temporali o nasale, è difficile da coprire con la palpebra dopo l'iniezione. Foratura iniziale sia reso leggermente posteriormente al limbus per evitare i vasi limbal che corrono lungo il limbus e facilmente riconoscibili. Fare attenzione a non colpire l'obiettivo con ago rendendo la foratura iniziale. Non inserire l'intera smussatura dell'ago per evitare lente foratura. - Posizionare l'ago senza punta 33 G della siringa microlitro attraverso il foro pre-forata e avvicinare l'ago nello spazio sottoretinico fino al punto in cui la resistenza mite si fa sentire.
NOTA: Per l'iniezione sottoretinica, il miglior angolo di attacco dell'ago è di circa 45 gradi contro piano iris, e l'ago smussato deve essere inserito posteriormente verso zona peripapillare. Piazza tratteggiata indica il percorso dell'ago suggerito attraverso la cavità vitrea per la injectio sottoretinicon in figura 1.
NOTA: Non ci sarà alcuna resistenza provato quando penetrante (o scomparsa) degli strati retinici in quanto sono molto morbidi. Così, la prima sensazione di resistenza lieve indica che l'ago ha già accennato strato RPE e l'inserimento dell'ago deve essere fermato. Fare attenzione a non penetrare il tessuto sclerale con eccessiva pressione perché l'ago deve essere posto in potenziale spazio sottoretinico. Se l'ago perfora il tessuto sclerale dal potere eccessivo, entra negli spazi orbitali estrinseci senza caratteristiche di resistenza. (Questo passaggio è fondamentale)
Figura 1. Schema di iniezione sottoretinica. H & E sezione macchiato dell'occhio del mouse raffigurante le strutture con un percorso ago per l'iniezione sottoretinica marcato (un quadrato tratteggiato). Ingrandimento: 40X, bar Scala: 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Iniettare i vettori virali (ad esempio, 1 x 10 6 TU / mL) delicatamente nello spazio sottoretinico, senza tremori per evitare danni ai tessuti indesiderate e ritirare l'ago delicatamente. Tenere il bulbo oculare saldamente durante l'iniezione, come descritto al punto 2.4.
- Osservare la formazione di bozza sottoretinico dopo l'iniezione sotto microscopio operatorio per assicurarsi che non vi è alcun sanguinamento della retina.
Figura 2. sottoretinico Belb Formazione senza retina emorragia. Vista al microscopio di belb sottoretinico dopo l'iniezione sottoretinica al microscopio operatorio mostra formazione bozza successo senza emorragia retinica.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Chiudere delicatamente la palpebra per coprire il sito di iniezione per l'auto-sigillatura. Riportare i topi per gabbia a casa e mantenere viva fino alla valutazione.
Nota: Dopo che i ricercatori abituarsi alle procedure, si possono ottenere i risultati ripetibili con procedure rapide saltando questi passaggi (2,5, 6, e 10)
3. Valutazione della efficacia di consegna Gene in epitelio pigmentato retinico
- Sacrificare i topi nella camera di CO 2. Enucleate gli occhi con le forbici.
- Fissare gli occhi nella soluzione di paraformaldeide al 4% a 4 ° C per almeno 1 ora a qualche giorno.
- Afferra la cornea con una pinza sottile e forare la cornea con micro-forbici. Rimuovere la cornea dopo forbice lungo il limbus. Rimuovere l'obiettivo con una pinza.
- Tagliare il corpo ciliare con mICRO-forbici permettendo il distacco della retina. Tirare delicatamente tutta la retina dal / coroide complesso RPE / sclera. Tagliare il RPE / coroide / complesso sclerale radialmente dalla periferia al centro vicino ottica nervose diverse volte per assicurarsi 4-8 foglie per il montaggio piatto.
- Capovolgere il RPE / coroide / complesso sclerale per rendere lato RPE giù, e tagliare tutti gli altri tessuti a lato sclerale compresi i muscoli, congiuntiva e nervo ottico. Questo passaggio è importante fare un piano RPE / coroide / complesso sclerale perché qualsiasi tessuto rimanente rende il complesso irregolare.
- Incubare il complesso con l'anticorpo primario e secondario per gli scopi di ricerca specifici (optional, vedere i riferimenti per i dettagli sui metodi). Flat-montare le RPE / coroide / complessi sclerali sul vetrino e assorbire il PBS con una spugna assorbente.
- Aggiungere 30 ml di soluzione di montaggio e mettere il vetrino di copertura. Osservare il campione per l'efficacia della consegna vettore sotto il microscopio fluoresceina. Conservare i campioni infrigorifero per ulteriori osservazioni.
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Representative Results
Per valutare l'efficacia dell'iniezione sottoretinica sulla trasduzione genica virale da questo protocollo, abbiamo utilizzato in commercio vettori LV con CMV promoter esprime sia GFP e RFP per l'indicatore. Gli occhi sono stati enucleato dopo il periodo di tempo appropriato in base allo scopo di ricerca. Per i risultati rappresentativi, gli occhi sono stati enucleati 10 settimane e 20 settimane dopo l'iniezione sottoretinica. Dopo la rimozione completa della retina con il metodo sopra descritto, l'appartamento monte RPE complesso / coroide / sclera è stata valutata al microscopio a fluorescenza. I risultati rappresentativi sono stati mostrati nella Figura 3A (esempio con rimozione completa della retina) e Figura 3B (scarso esempio con retina intatto). Nonostante l'esistenza di retina neurale residuo (in particolare segmento esterno dei fotorecettori) su strato RPE non ha interferito per analizzare l'area di consegna del gene in RPE, ha bloccato la fluorescenza di GFP / RFP e inibito visua direttalizzazione dello strato RPE per ulteriori analisi. Pertanto, la rimozione completa della retina neurale dal complesso / coroide / sclera RPE fornirebbe risultati migliori.
Figura 3. L'esempio di RPE / coroide / sclerale Complesso Flat-montare secondo la rimozione completa di Retina. Venti settimane dopo l'iniezione sottoretinico di Lentivirus con GFP / RFP Gene. (A) buon esempio di RPE piatta montare con rimozione completa della retina mostra espressione chiara e discreto di GFP / RFP nelle cellule RPE. (B) Scarsa esempio di RPE piano di montaggio a causa di non rimozione della retina mostra la zona di consegna del gene con segnali di RFP che è insufficiente per analizzare la patologia RPE. Ingrandimento: 40X, Scala bar:. 500 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
(cioè 2 microlitri). Questo aiuta a regolare appropriata titolo virale per l'esperimento.
I risultati rappresentativi di RPE / coroide / sclerale complesso piano di montaggio 10 settimane dopo l'iniezione sottoretinica sono stati mostrati in diversi ingrandimenti in figura 4 (40X) e la figura 5 (400X). Le immagini con basso ingrandimento sono sufficienti per valutare l'area di GFP espressione / RFP. D'altra parte, sono necessarie per altra patologia RPE riguardo a finalità specifiche dei ricercatori le immagini con ingrandimento elevato. Queste immagini with vari ingrandimenti aiutano a comprendere il modello di espressione virale in RPE (figura 4 e 5). Abbiamo inoltre verificato l'espressione di GFP / RFP fino a 36 settimane dopo l'iniezione. L'espressione di GFP / RFP era ancora osservata dopo l'iniezione 36 settimane dopo (dati non riportati).
Figura 4. L'esempio di RPE / coroide / sclerale Complesso Flat-mount a 10 settimane dopo l'iniezione sottoretinico di Lentivirus con GFP / RFP Gene (ingrandimento: 40X). (A) canale verde per GFP (B) canale rosso per RFP. Scala bar:. 500 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. L'esempio di RPE / coroide / sclerale Complex Appartamento-mount 10 settimane dopo l'iniezione sottoretinico di Lentivirus con GFP / RFP Gene (Ingrandimento: 400X). (A) canale verde per GFP (B) canale rosso per RFP. Scala bar:. 50 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo il video, abbiamo descritto il limbare approccio tecnica di iniezione sottoretinica in dettaglio con risultati rappresentativi di RPE / coroide / sclerale flat-mount. Questa è una tecnica facile e conveniente per l'iniezione sottoretinica di vettori virali in RPE. La visualizzazione diretta della formazione di bozza durante l'iniezione è un passo importante per la consegna accurata per i principianti. Ci sono alcune tecniche di iniezione subretiniche introdotte nel Journal of Experiments Visualized 8-10. Spazio sottoretinico è lo spazio potenziale tra retina e RPE, quindi non ci sono due possibili percorsi di approccio spazio sottoretinico. Uno è un approccio all'interno dello spazio sottoretinico via vitreo e retina e l'altro è un approccio esterno attraverso RPE e sclera. Questo limbare approccio tecnica di iniezione sottoretinica è l'ex uno via intravitreale spazio e della retina. Questa tecnica ha il vantaggio di fornire più formazione posteriore vescichetta rispetto a quest'ultimo perché quest'ultimo unAPPROCCIO fa una bozza dal lato periferico tramite tunneling sclerale o l'incisione, che dovrebbe essere fatto oltre la retina periferica. Inoltre, semplice puntura limbare è più facile che il tunneling sclerale senza penetrazione della retina. Per i topi neonati, tuttavia, sarebbe più appropriato utilizzare il metodo esterno 9. Perché bulbo oculare neonatale del mouse è molto piccolo e completa della lente, tecnica limbare approccio può causare la formazione di cataratta indesiderati o addirittura tisi bulbare.
Ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo. Prima di tutto, foratura iniziale dovrebbe essere posto un po 'posteriormente al limbus perché foratura troppo anteriore alla cornea rende iris incarcerazione, o punture troppo posteriore rende buco diretto alla retina periferica. In secondo luogo, si consiglia di fare attenzione per evitare di colpire l'obiettivo con ago rendendo la foratura iniziale. E 'meglio non inserire l'intero smussatura dell'ago per evitare lente foratura. In terzo luogo, la best angolo di attacco dell'ago è di circa 45 gradi contro piano iris, e l'ago smussato deve essere inserito posteriormente verso zona peripapillare. Infine, l'ago deve essere posizionato nello spazio sottoretinico durante l'iniezione, con conseguente formazioni vescichetta uniformi, altrimenti l'ago spostato provoca iniezione intravitreale.
L'occhio è un piccolo organo con le caratteristiche uniche che lo rendono un bersaglio attraente per la terapia genica 11. In particolare, è un piccolo vano chiuso con immuno-privilegio che consente la terapia genica con relativamente bassa tossicità e reazioni immunitarie nell'occhio e effetti sistemici negativi. Visualizzazione facile e pronta accessibilità agli approcci chirurgici sono altri vantaggi dell'occhio per la terapia genica. La retina ha una struttura laminare altamente organizzata con 10 strati distinti. Così, la consegna del gene spaziale accurata può essere raggiunto solo con i metodi appropriati di iniezione intraoculare. I due metodi più comuni per intrconsegna aocular di vettori virali sono iniezione intravitreale e l'iniezione sottoretinica 6. In generale, l'iniezione intravitreale è l'itinerario preferito per la retina interna il targeting cellule gangliari della retina e le cellule Müller. Iniezione sottoretinico è la via preferita per retina esterna il targeting fotorecettori e le cellule RPE. Per una trasduzione efficiente RPE, è necessario fornire vettori virali subretinally nonostante la possibilità di danni alla retina.
In questo studio, abbiamo utilizzato vettori LV con GFP e RFP per la visualizzazione. Perché vettori virali hanno tropismo per specifici tipi di cellule della retina, vettori virali devono essere scelti in base al tropismo di AAV, LV, e Ad di cellule 5 bersaglio. Ad esempio, AAV2 / 2, AAV2 / 6 e AAV2 / 8 sono la massima efficienza di trasduzione di cellule RGC e Muller. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 e 2/9 efficiente trasducono fotorecettori e RPE con AAV2 / 8 è il sierotipo più efficace nei topi 5,12 5. Per vettori LV, vi è un alto livello di espressione in cellule RPE dopo le iniezioni sottoretiniche, ma poca o nessuna espressione dopo iniezioni intravitreali 13.
Per la consegna del gene efficace per RPE, promotori virali devono essere considerati anche. Promotori virali, come il citomegalovirus (CMV) e pollo chimerico beta-actina / CMV promoter enhancer sono promotori forti e onnipresenti, pertanto, essi sono utilizzati in maggior parte degli studi di terapia genica. In RPE, il promotore CMV è stimato a esprimere dieci volte tanto di proteine rispetto al promotore RPE65 14. Di importanza, la combinazione ottimale di promotore e vettori virali come sierotipo deve essere raggiunto per ottenere risultati migliori, come dimostrato dall'espressione superiore RPE65 quando il promotore umano RPE65 sono confezionati in sierotipo rAAV2 / 4 rispetto rAAV2 / 2 15. Concentrandosi sulla consegna del gene alle cellule RPE, RPE-sppromotori ecific come l'RPE65 o il promotore VMD2 riduce rilascia la sicurezza fuori bersaglio 16.
AMD è una malattia complessa che ha due fasi con una fase degenerativa denominata AMD secca ed una fase caratterizzata da neovascolarizzazione coroideale denominato AMD bagnata. Inoltre, AMD è una malattia in cui numerose predisposizioni genetiche, tra cui fattore complemento H (CFH), completano C3, complemento fattore I (CFI), legata all'età maculopatia suscettibilità 2 (ARMS2) e ApoE sono combinati con fattori di rischio per l'ambiente 17. A causa della natura complessa dei fattori di rischio genetici in AMD, non esiste un unico gene candidato per la terapia genica. Così, la terapia genica attuale AMD è focalizzata sulla trasferimento genico per esprimere le proteine anti-angiogeniche rivolti neovascolarizzazione coroidale in AMD umida 18. Non vi è ancora nessun gene candidato per il trattamento di AMD secca con una terapia genica. Recentemente, abbiamo suggerito che amiloide beta intracellulare accumulo puòessere correlato ad asciugare funzionalità AMD in topi transgenici 19. Inoltre, subretinally iniettato beta-amiloide è stato ripreso dalla RPE nei topi (dati non pubblicati). Siamo in grado di fendere intracellulare beta-amiloide con proteasi virale 20. Così, abbiamo ulteriormente studiato la terapia genica in AMD secca con potenziali bersagli.
In conclusione, la terapia genica nella malattia oculare è più promettente che in qualsiasi altro organo. Inoltre, l'iniezione sottoretinica è una tecnica fondamentale per la terapia genica in patologie retiniche, soprattutto in relazione ai fotorecettori e RPE. Pertanto, ci auguriamo che questa tecnica diventa più ampiamente usato e può contribuire al progresso della terapia genica non solo in monogenic ereditato retinopatia, ma anche nella degenerazione maculare legata all'età.
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Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Seoul National University Research di Grant (800-20140542), il Programma Pioneer Research di NRF / MEST (2012-0009544), e la Bio-Signal Analysis Tecnologia Programma Innovazione NRF / MEST (2009-0090895), e la concessione di NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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