En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

Abstract

I dette arbejde beskriver vi en ny tilgang, der kombinerer ex vivo narkotika følsomhed assays og digital billedanalyse at estimere kemosensitivitet og heterogenitet patient-afledte myelomatose (MM) celler. Denne tilgang består i såning primære MM celler frisk udvundet knoglemarvsaspirater i mikrofluide kamre implementeret i flere brønde, der hver består af en rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø, herunder ekstracellulære matrix (kollagen eller basalmembran matrix) og stroma (patient- afledte mesenchymal-stamceller) eller human-afledte endotelceller (HUVEC'er). Kamrene er bedøvet med forskellige midler og koncentrationer, og afbildes sekventielt i 96 timer gennem lysfeltmikroskopi, i en motoriseret mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Digital billedanalyse softwaren registrerer levende og døde celler fra tilstedeværelsen eller fraværet af membran bevægelse og frembringer kurver for ændringer i levedygtighed som funktion of lægemiddelkoncentration og eksponeringstid. Vi bruger en computermodel til at bestemme parametrene for kemosensitivitet af tumoren befolkningen hvert medikament, såvel som antallet af sub-populationer til stede som et mål for tumor heterogenitet. Disse patient skræddersyet modeller kan derefter anvendes til at simulere terapeutiske regimener og estimere kliniske respons.

Introduction

Målet med denne fremgangsmåde er at karakterisere lægemiddelfølsomhed af myelomatose (MM) primære celler til et panel af agenter ex vivo, så tæt som muligt på fysiologiske betingelser, og med tilstrækkelig præcision at disse resultater kan anvendes til at identificere kemoterapi sub- befolkninger i tumorbyrde og i sidste ende, at parametrisere beregningsmodeller designet til at estimere klinisk respons.

Beregningsmodeller er stærke værktøjer til at analysere komplekse systemer, såsom vekselvirkninger cancer-host-terapi. Men modeller er kun så god som de data, der anvendes til at parametrisere dem. Desværre kan de fleste data i litteraturen ikke anvendes i sin nuværende form til at parametrisere sådanne modeller, da de ofte er fremstillet i gensidigt udelukkende eksperimentelle betingelser. Således er nye eksperimenter ofte påkrævet med det mål at opnå sæt af eksperimentelle parametre, der er nødvendige. De fleste levedygtighed analyser, dog er destruktive og thos begrænset til et lille antal tidspunkter, ofte kun en. Dette i høj grad handicap brugen af ​​kemosensitivitet analyser til parametrisere beregningsmodeller, da sådanne forsøg ikke at give oplysninger om de tidsmæssige dynamik i systemet. Dette er især tilfældet med primære kræftceller, der ofte er begrænset til et par millioner pr prøve, og har en kort levetid efter biopsi, hvilket begrænser antallet af eksperimentelle betingelser til rådighed. Desuden fleste rentabilitet analyser kræver adskillelse af kræft fra de ikke-cancer (stroma) celler på tidspunktet for kvantificering, som tilføjer ekstra arbejde til protokollen, yderligere forstyrrer cellerne, og begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres .

40 år siden, laks og samarbejdspartnere ¹ foreslås deres berømte in vitro kolonidannelse assay til vurdering af kemosensitivitet af tumorceller. Desværre er dette assay fundet blandet succes på grund af det lille antal multiple myeLoma (MM) patientprøver som var i stand til at danne kolonier under kontrolbetingelser: Det blev anslået, at kun en lille undergruppe af 0,001% til 0,1% af MM-celler var i stand til replikation, at de kan betegnes som multipel myelom stamceller ^2. Dette væsentligt begrænset succesraten for analysen, og antallet af lægemidler, der kunne testes på én gang, selv i nyere modeller ^3. Dette spørgsmål er meget vigtigere nu, hvor MM agenter (standard eller eksperimentelle) er mere talrige end fire årtier siden.

En væsentlig begrænsning af disse tidlige assays er deres dikotomiseret udgang: enten en patient er "følsomme" eller "resistent" til et bestemt lægemiddel. Ingen oplysninger gives om graden af ​​følsomhed og heterogenitet af tumor befolkning. Således ville patienter med små sub-populationer af hurtigt voksende resistente celler klassificeres som "følsomme" til terapi, men ville tilbagefald kort tid, og derfor ikke benstemt ydelse fra behandling. Betragtning af betydningen af varigheden af respons i samlet overlevelse (OS) i kræftpatienter ^4,5, er det klart, hvordan disse analyser ikke var i stand til korrekt estimere OS konsekvent.

For at omgå disse begrænsninger, og for at kunne generere patientspecifikke beregningsmodeller, der ville estimere personlig klinisk respons på et panel af stoffer, har vi udviklet en metode til ikke-destruktivt test narkotika følsomhed af myelomatose (MM) cellelinjer og primære MM celler i en ex vivo rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø, herunder ekstracellulære matrix og stroma ^6. Denne analyse havde imidlertid begrænsningen for at stole på en bestemt kommerciel microfluidic dias, hvis dimensioner og omkostninger begrænset antallet af forsøg eller lægemidler, der kan udføres på én gang i en given stykke udstyr.

Den her beskrevne system udvider denne originale assay i en høj-throughput organotypisk dosis-respons-platform, til in vitro screening af lægemidler baseret på en digital billedanalyse algoritme til ikke-destruktivt kvantificere cellelevedygtighed. Hver brønd i 384 eller 1.536 brønde er en 3D-rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø, herunder primære MM celler, ekstracellulære matrix, og patient-afledt stroma og vækstfaktorer. Levende mikroskopi og digital billedanalyse anvendes til at opdage celledød begivenheder i forskellige lægemiddelkoncentrationer, som anvendes til at generere dosis-respons overflader. Fra in vitro-data, en matematisk model identificerer størrelsen og kemosensitivitet af subpopulationer i patientens tumorbyrde, og kan anvendes til at simulere hvordan tumoren ville reagere på lægemidlet (r) i fysiologiske betingelser i en klinisk regime ⁶ ( figur 1).

De vigtigste nyskabelser i denne platform er: (a) lille antal af kræftceller, der kræves (1.000-10.000 pr narkotika concentration); (B) vurdering af lægemiddel virkningsfuldhed i fysiologiske betingelser (ekstracellulær matrix, stroma, patient-vækstfaktorer); (C) Ingen toksicitet fra levedygtighed markører ⁷ da kun lyse felt billedbehandling bruges, derfor ingen grund til at transficere celler med fluorescens ⁸ eller bioluminescens ^9; (D) kontinuerlig billedbehandling giver stof effekt som funktion af koncentration og eksponeringstid (farmakodynamik); og (e) integration mellem in vitro og beregningsmæssige evolutionære modeller til at estimere kliniske resultat ⁶ (Silva et al., under forberedelse).

Den vigtigste faktor, der tillader den digitale billedanalyse algoritme til at skelne kræft fra stromale celler er deres forskellige affinitet til bunden af ​​brønden: MM celler klæber ikke og forbliver i suspension i matrixen, mens stromale celler klæber til bunden af godt og derefter strække.

Denne adskillelse sker selvom MM og stroma enre podet på samme tid, og forekommer under O / N-processen inkubation. Spinding ned i centrifugen efter podning af pladen yderligere fremskynder denne proces. Som følge heraf synes MM celler i billedet som runde lyse diske omgivet af en mørk ring, mens stroma opretholder en lav profil og en mørkere nuance (figur 2). Således assayet i sin nuværende form er bedst egnet til ikke-adhærente cancerceller, selv justeringer i algoritmen kunne gøres til separat kræft og stroma baseret på andre morfologiske træk, såsom størrelse og form. I denne protokol beskriver vi to typer ekstracellulære matrix (kollagen og basalmembranmatrix) samt to typer co-kulturer, med (knoglemarv afledte mesenchymal-stamceller) BMSC og HUVECS, repræsenterer de interstitielle og perivaskulære nicher af knoglemarven henholdsvis.

Ved hjælp af en 384-brønds plade, 5 koncentrationer pr narkotika og to gentagelser, kunne vi test op til 31 forskellige lægemidler med prøven af ​​en enkelt patient. I 1.536 brønde dette nummer er 127. Figur 3 viser layoutet for øjeblikket anvendes til manuel cellepodning, mens Supplemental Figur 1 viser den optimale fordeling ved hjælp af en robot pipette. I udformningen af figur 3, kan hver 384-brønds plade bære 3 patientprøver med 7 forskellige lægemidler, eller en patientprøve testet med 21 lægemidler. Hvert lægemiddel er repræsenteret ved 5 koncentrationer, og hver betingelse er podet i dubletter. 4 kontrolbrønde (ingen medikament tilsat) podes for hvert sæt 7 lægemidler (f.eks, brønde 36-39, 126-129 og 200-203). At sikre styrken af de lægemidler, der anvendes, en human myelomcellelinje (fx H929 eller MM1.S) også podet, og bedøvet i dubletter ved den højeste koncentration af hver af de lægemidler, der anvendes (brønde 76-89). Den positive cellelinie sikrer at de anvendte medikamenter har tilstrækkelig styrke, da deres dosisresponskurver er sammenlignelige across forsøg. To brønde podes med en myelomcellelinje som kontrol for de miljømæssige forhold, med andre ord, for at opdage eventuelle problemer i bordpladen inkubator under billedbehandling (brønde 75 og 90). Opregningen af ​​brøndene følger en zigzag-mønster for at reducere den afstand, det motoriserede trin i mikroskopet, hvilket reducerer erhvervelse tid og reducerer slid på udstyret.

Protocol

Anvendelse af menneskelige celler fra biopsier som beskrevet nedenfor blev godkendt af Moffitt s Institutional Review Board og udført under det kliniske forsøg MCC # 14745 udført på H. Lee Moffitt Cancer Center og Research Institute.

1. Sortering af MM Celler fra knoglemarvsaspirater

1. Indsamle knoglemarvsaspirater (20 ml) fra patienter i natriumheparin sprøjte.
2. Isolere mononukleære celler ved centrifugering fortyndet marv (1: 1 med sterilt PBS) over en sterilt vandigt medium centrifugering gradient ved 400 xg i 30 minutter ved omgivelsestemperatur.
3. Saml grænsefladen, som indeholder mononukleare celler. Vask cellerne med kold PBS og tælle anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller, under anvendelse trypanblåt til bestemmelse af levedygtighed.
4. Forbered et tyndt lag cellepræparation slide ¹⁰ og pletten med Wright-Giemsa farve for at vurdere plasma celle procentdel ^11.
5. Beregnmængden af ​​CD138 perler, der skal anvendes baseret på antallet af celler og plasma celleprocenten. Hvis man starter prøven er mindre end 20% plasmaceller, derefter re-suspendere celler ved hjælp 90 ul adskillelse buffer og 10 pi CD138 perler pr 5 x 10 ⁶ celler. Hvis man starter prøven er mere end 20% plasmaceller, resuspenderet under anvendelse 80 pi adskillelse puffer og 20 pi CD138 perler pr 1 x 10 ⁷ celler.
6. Cellerne inkuberes med perler ved 4 ° C i 15 min.
7. Pass celler gennem en 35 um si tilføjet til at pre-fugtet separation (LS) søjler placeret i magnetfeltet separator (se liste over materialer).
8. Fjern kolonne fra magneten. Indsamle CD138-udvalgte celler ved vask af søjlen 3 gange med 1 ml separation puffer.
9. Vurdere CD138 berigelse med en anden farvet tyndt lag cellepræparat slide ^10.
10. Filter plasma opnået fra knoglemarvsbiopsi fra hver patient med et 0,22 um sprøjtefilter. Brug frisk plasmafra den samme patient som CD138 + celler.
11. Forbered medier til eksperiment ved at supplere RPMI-1640 med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 10% patient plasma og 1% penicillin-streptomycin.
12. Opsaml gennemløbet af markeringen (CD138-) og følger den klassiske vedhæftning metode ¹² at selektere for knoglemarv mesenkymale celler (BMSCs). Da denne proces kræver uger før BMSCs er klar til at blive brugt, er det nødvendigt at have BMSCs klar fra tidligere patienter eller raske donorer.

2. Seeding Celler i Plader (Brug af en manuel Multikanal Pipettor)

1. Brug en multi-brønds plade (384 eller 1.536) med sorte vægge og en transparent flad bund, fortrinsvis én optimeret til optiske anvendelser og cellekultur.
2. Co-kultur BMSCs med MM-celler i enten collagen type I eller basalmembranmatrix imidlertid HUVEC'er kræver basalmembranmatrix.
3. Hold endelige tætheder af hver celletype ifor følgende område: 3 x 10 ⁵ celler / ml for MM-cellelinjer, 2 x 10 ⁵ celler / ml for HUVEC'er eller BMSCs, og 2 x 10 ⁶ celler / ml for patient-afledte MM-celler.
   Bemærk: Disse tætheder er resultatet af eksperimentel optimering at muliggøre den højest mulige billedkvalitet og længst mulig afbildningstiden samtidig opretholde biologiske relevans i assayene. MM-cellelinjer udsås ved lavere densiteter end primære MM celler på grund af deres hurtigere replikation sats og større størrelse.
4. Co-kultur af primære MM celler med BMSCs:
   1. Fremstilling af 100 pi alikvoter af forblandet medier bestående af 20 pi 10x MEM, 20 pi deioniseret _H2O, 10 pi 7,5% natriumhydrogencarbonatopløsning, og 50 pi 1x RPMI 1.640 og opbevares ved 4 ° C.
   2. På tidspunktet for såning pladerne med MM-celler, blandes portioner af forblandet medier med 150 pi 3,1 mg / ml bovint kollagen type I til et endeligt volumen på 250 pi.
   3. Re-suspende 50 pi celler i RPMI 1.640 til seks gange den endelige ønskede densitet.
   4. Bland til cellesuspension med kollagen mix for at skabe et endeligt volumen på 300 pi under anvendelse af en P200 pipette.
   5. Ved hjælp af en manuel eller repeater pipette deponere en 8 pi dråbe endelige celle / matrix mix i midten af ​​hver brønd i 384-brønds plader, eller 2 pi i hver brønd af 1.536 brønde (Se trin 2.6 for et eksempel på rumlige arrangement brønde).
   6. Centrifuge plade i 2 minutter ved 500 xg for at koncentrere alle celler til det samme fokale plan under billedbehandling.
   7. Efterlad plade i en inkubator (5% _CO2, 37 ° C) i 1 time, for gel polymerisation.
   8. Tilføje 80 pi suppleret vækstmedier (RPMI-1640, 10% FBS HI, 10% patient-afledt plasma, 1% P / S) til hver brønd i 384-brønds plader, eller 8 pi i 1.536-brønds plader.
   9. Efterlad plade O / N i inkubator (5% _CO2, 37 ° C) til klæbning af stroma til bunden af pladen.
5. Co-culture af primære MM celler med HUVEC'er:
   1. Overførsel basalmembranmatrix fra -80 ° C til en spand med is til at tø.
   2. Tælle og re-suspendere primære celler og HUVEC'er i RPMI-1640-medier ved 4 gange den endelige densitet, hver i et separat rør.
   3. Bland patientens celler og HUVEC'er volumener ved et 1: 1 forhold.
   4. Når basalmembranmatrix optøs, men stadig ikke polymeriseret, blandes 1: 1 med celleblanding fra foregående trin.
   5. Seed dråber med tilstrækkelig volumen af ​​celle-matrix mix i midten af ​​hver brønd (8 pi til 384-brønds plader og 2 pi til 1.536 brønde, se trin 2.6 for et eksempel på rumlige arrangement af brønde).
   6. Centrifuge plade ved 500 x g i 10 min.
   7. Sted plade i inkubator (5% _CO2, 37 ^° C) i 1 time for matrix polymerisation.
   8. Læg vækstmedier (RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 10% patient plasma og 1% P / S) til hver brønd (80 pi til 384-brønds plader, 8 pi for 1,536-brønds plader).
   9. Efterlad plade O / N i inkubator (5% _CO2, 37 ° C) i adhæsion af HUVEC'er til bunden af pladen.
6. Seed en 384-brønds plade. Figur 3 viser en typisk rumlige fordeling af podning.
   1. Starter på godt B2, frø så mange kolonner som lægemidler, der skal testes. I eksemplet i figur 3, anvendes syv lægemidler.
   2. Gentag såning så mange gange som koncentrationer, der skal anvendes. I eksemplet i figur 3, anvendes fem koncentrationer.
   3. Frø fire flere brønde til kontrol betingelser.
   4. Gentag trin 2.6.1 og 2.6.2 for den anden replikat.
   5. Gentag trin 2.6.1 til 2.6.4 for hver patientprøve, der skal testes i pladen.
   6. Seed en MM-cellelinje i to linjer af brønde, hver med så mange brønde som lægemidler, der skal testes (i to eksemplarer). Hver af disse brønde vil blive behandlet med den højeste koncentration af hvert lægemiddel, for at sikre, at materiel havde tilstrækkelig potency (se figur 3 for eksempel).
   7. Seed to brønde med en MM-cellelinje til at tjene som kontrol af de eksperimentelle betingelser, såsom velfungerende bænk top inkubator, vækstmedier, osv.

3. Seeding Celler i plader (Ved hjælp af en robot Pipettor)

Bemærk: Denne serie af trin frø en 384-brønds plade under anvendelse af en robot pipette. Udformningen af pladen er afbildet i Supplemental Figur 1, hvor primære MM celler testet mod et panel af 31 forskellige lægemidler på fem forskellige koncentrationer i to replikater, plus negativ kontrol. En cellelinie også podet som positiv kontrol til vurdering af lægemiddel effekt og testet mod alle 31 stoffer ved den højeste koncentration, i to replikater. Filerne forudsat er for et mærke og model (se Materialer tabellen), men algoritmen kan tilpasses eventuelle robot pipetter.

1. Co-dyrkning af primært MM celles med BMSCs:
   1. Der fremstilles en 15 ml rør, bestående af 240 pi 10x MEM, 240 pi deioniseret _H2O, 120 pi 7,5% natriumhydrogencarbonatopløsning, 600 pi 1x RPMI 1.640 og 1,8 ml 3,1 mg / ml bovint kollagen type I. Label rør som "pre-mix til CD138 +". Anbring på is indtil brug.
   2. Der fremstilles en 1,5 ml rør, bestående af 50 pi 10x MEM, 50 pi deioniseret _H2O, 25 pi 7,5% natriumhydrogencarbonatopløsning, 125 pi 1x RPMI 1.640 og 375 pi 3,1 mg / ml bovint kollagen type I. Label rør som "pre-mix til Cell Line". Anbring på is indtil brug.
   3. Resuspender 300 pi CD138 + celler i RPMI 1.640 til seks gange den endelige ønskede densitet. Resuspender 300 pi BMSC celler i RPMI 1640 ved seks gange den endelige ønskede densitet. Bland begge bind sammen i et 1,5 ml rør og label "CD138 +". Placer i inkubator indtil brug.
   4. Re-suspendere 60 ulcellelinie i RPMI 1640 ved seks gange den endelige ønskede densitet. Resuspender 60 pi BMSC celler i RPMI 1640 ved seks gange den endelige ønskede densitet. Bland begge bind sammen i et 1,5 ml rør og label "Cell Line". Placer i inkubator indtil brug.
   5. Brug af software, der leveres med den robot pipette, indlæse den første script filen "cell_seedingPt47.PGM". Placer en 200 pi pipettespids boks, en mikrotiterplade, og en steril 384 brønds plade på stationerne A, B og E henholdsvis af robotten.
   6. Bland indholdet af rør "pre-mix til CD138 +" og "CD138 +". Overfør 1,5 ml af dens indhold til brønden # 1 af mikrotiterpladen. Glasset anbringes med resterende volumen på is. Starte programmet. Robotten vil frø de første 176 brønde (11 venstre-de fleste kolonner) i 384 brønde og derefter pause. Overfør det resterende af røret på is til godt # 2 i mikrotiterplade. Genoptage programmet. DenRobotten vil pode de resterende 144 brønde i 384-brønds plade og pause.
   7. Blande indholdet af rør "pre-mix for cellelinie" og "cellelinie" og overføre indholdet til godt # 3 af mikrotiterplade. Genoptag program. Robotten vil pode de resterende 64 brønde i 384-brønds plade.
   8. Placer 384-brønds plade i centrifuge i 10 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Overførsel plade til inkubator (5% _CO2, 37 ° C) i 1 time for kollagen polymerisation.
   9. Indlæse anden script-fil, "media_layer.PGM". Placer 120 pi pipettespids boks, en reagens reservoir med 31 ml RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 10% patient plasma og 1% P / S og 384-brønds plade med celler i stationer A, B og E, henholdsvis. Køre programmet. Robotten vil overføre 81 ul medier til hver brønd. Når færdig, overføre 384-brønds plade til inkubatoren og tillade stroma at klæbe til substrat O / N.
4. Drug Forberedelse og medicinering af plader (Ved hjælp af en manuel Multikanal Pipettor)
1. Forberede en skabelon svarende til fig 3 for at lette processen med at tilføje lægemiddel til brønde og mindske risikoen for forveksling.
2. Udarbejde, i en 96-brønds plade, til en seriel fortynding af hvert af lægemidlerne skal testes i pladen, for eksempel til fem koncentrationer under anvendelse af en 3-gange fortynding:
   1. Tilføj 120 pi lægemiddel ved 10x den ønskede koncentration i den højeste koncentration godt. Brug f.eks 500 pM melphalan, hvis den højeste koncentration af cellerne vil blive udsat i pladen vil være 50 uM.
   2. Tilføje 80 pi vækstmedium (RPMI suppleret med 10% FBS, 10% patient-afledt plasma og 1% penicillin / streptomycin (P / S)) til de efterfølgende fire brønde.
   3. Overførsel 40 pi fra den første brønd til den anden og blandes, til et samlet volumen på 120 pi på 1/3 af den første brønd drug koncentration, eller 167 uM.
   4. Gentag trin 4.2.3 til de resterende brønde (f.eks overføres 40 pi fra anden til tredje, mix, derefter overføre 40 pi fra tredje til fjerde, etc.).
3. Overfør 8 pi fra hver lægemiddelholdige godt til den tilsvarende brønd i cellepladen. Hvert lægemiddel indeholdende brønd bør have nok volumen til 10 brønde i cellepladen. I eksemplet i figur 3 er hver lægemiddelkoncentration sat til 6 forskellige brønde, bortset fra det højeste koncentration, som sættes til 8 brønde.
4. Tilføje 8 pi vækstmedium (RPMI suppleret med 10% FBS, 10% patient-afledt plasma og 1% P / S) til kontrolbrøndene.
5. Placer celler i mikroskop, så snart klar og slå på bænken toppen inkubation.

5. Drug Forberedelse og medicinering af plader (Ved hjælp af en robot Pipettor)

1. Hent script-filer til robot pipette fra http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
2. Indlæse script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" i robot pipettor brugergrænseflade. Placer en 120 pi pipettespids boksen reservoir med 21 ml RPMI-1.640 suppleret med 10% FBS, 10% patient plasma og 1% P / S og en tom 384-brønds plade i stationer A, B og E henholdsvis. Kør programmet, vil robot pipettor tilsættes 30 pi medier til alle brønde i 384 brønde.
3. Efter skabelonen fra Supplemental Figur 2 tilsættes 200 pi lægemiddel ved 20x maksimal koncentration til hver brønd i en mikrotiterplade. Denne opsætning kan rumme op til 31 lægemidler. Til kontrollen godt (CTRL), der tilsættes RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 10% patient plasma og 1% P / S.
4. Placer en 120 ul pipettespids boksen mikrotiterplade med narkotika på 20X koncentration, og 384-godt med medier (fra trin 5.1) i stationerne A, B og C, hhv. Indlæs programmet "drug_plate.PGM". Den robot pipettor vil skabe en seriel fortyndingpå 1: 3 efter den rumlige fordeling i Supplemental Figur 1.
5. Placer en 120 ul pipettespids boksen de 384 brønde med lægemiddel fortynding (fra trin 5.3) og 384 brønde med celler (fra trin 3.1.9) til stationer A, B og C, hhv. Belastning og køre programmet "drug_add.PGM". Robotic pipette overfører 8 pi lægemiddel fra hver brønd i lægemidlet pladen til sin modpart i cellen plade. Når færdig, overføre cellepladen til inkubatoren af ​​den digitale mikroskop hurtigst muligt.

6. Imaging Celler i Plate

Bemærk: Proceduren nedenfor gælder for Evos Auto FL mikroskop, men let kan tilpasses til andre motoriserede stage mikroskoper med bænk top inkubation eller inkubator-embedded mikroskoper.

1. Rengør det indvendige af bænk top inkubator med en ethanol-vådserviet og fjern forsigtigt låget af pladen samtidig lægge låget på incubator.
2. Følg software trin for at tilføje beacons. Dette er det udtryk bruges til at henvise til vartegn for regioner af interesse, der skal afbildes successivt under forsøget (se software brugervejledning for detaljer).
3. Brug en 5X eller 10X forstørrelse mål. Sørg for, at fokus er ligner figur 2: MM celler vises som lyse diske omgivet af en mørk ring og BMSCs eller HUVEC'er er knap synlige. Nogle primære MM celler er meget små, og dermed en finjustering kan være forpligtet til at finde den optimale fokus.
4. Juster købet intervallet mellem 10-30 min og for varighed på mindst 96 timer. Mens længere intervaller mellem akkvisitioner er acceptable, kan intervaller på 45 min eller mere væsentligt reducere præcisionen af ​​målingen af ​​levedygtighed.
5. Konfigurere softwaren, således at billeder af hver brønd opbevares i separate filer navngivet Beacon-1, Beacon-2, etc. Hvis robotic pipette blev anvendt, indstille beacons i afbildet i rækkefølgeSupplerende figur 3.
6. Sørg for, at der er nok vand i inkubatoren luftfugter og gas, således at celler vil være i optimale betingelser.
7. Ved afslutningen af ​​forsøget, kopiere mapper, der indeholder billederne til computeren, der vil køre analysen.

7. Kvantificering af Drug Følsomhed

Bemærk: Følgende instruktionsguide brugen af ​​billedanalyse under anvendelse af en computer klynge, eftersom analysen af ​​en multi-brønds plade i en personlig computer er yderst tidskrævende.

1. Hent ImageJ software fra NIH hjemmeside: http://imagej.nih.gov/ij/
2. Hent script og plugins på http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
3. Følg instruktionerne i http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf at køre digitalt billede analyse software. Resultatet bør være et regneark med navnet Results.csv indeholder levedygtighedsmålinger med jævne mellemrum for each brønd i pladen under hele forsøget (dvs. 96 timer).
4. Hvis du bruger en manuel multi-kanal pipette, udføre følgende trin.
   1. Download filen http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt og ændre det til at matche layoutet af pladen defineret i trin 3.1 (fx figur 3).
   2. Download softwaren http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar og køre det ved hjælp af filer oprettet i trin 5.3 og 5.4 som input parameter. Resultatet vil være et mappenavn rapport indeholder flere regneark, hver gruppering resultaterne for et bestemt lægemiddel.
   3. Kopiere og indsætte indhold i regnearksskabelon http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Bemærk: Resultatet bør være grafer som den er afbildet i figur 4, der repræsenterer kemosensitivitet af prøven til forskellige lægemidler som en funktion af lægemiddelkoncentrationen og eksponeringstid.
   </ Ol>
   4. Hvis du bruger en robot pipette, udføre følgende trin.
      1. Hent skabelon filer fra download script filer til robot pipette fra http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Skabelon Files.zip og udtrække filer i en mappe.
      2. Ændre filen DrugList.csv henhold til listen over stoffer og højeste koncentration lægemiddel i pladen med celler. Følg layoutet af Supplemental figur 2.
      3. Kør programmet BuildExperimentalDesign.java passerer som parameter mappen med de udpakkede i trin 7.5.1 filer og de filer, Results.csv fra trin 7.3. Resultatet bør være to mapper navn MM1_S og PtSample. Den første indeholder en beskrivelse af brøndene (narkotika og koncentrationer) for cellelinie positive kontrol. Den anden indeholder samme information, men om den del af pladen podet med patientens celler.
      4. Kopier filen Results.csv ind i hver af de mapper, der er oprettet i trin 7.5.3. Hentsoftwaren http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar og køre det ved hjælp af filer oprettet i trin 7.5.3 for begge mapper. Resultatet vil være et mappenavn rapport i hver af de mapper, der er oprettet i 7.5.3. Rapporten mappe indeholder flere regneark, hver gruppering resultaterne for et bestemt lægemiddel.
      5. Kør programmet BuildGraphPadFile.java og passere som parameter mappen med de filer, udtrukket i trin 7.5.1 og filerne Results.csv fra trin 7.3. Resultatet vil være en GraphPad fil, der indeholder dosisresponskurver for hver af de 31 lægemidler, og normaliseret af styringen. Hver diagram vil indeholde 5 lægemiddelkoncentrationer for de primære MM celler og én koncentration for den positive cellelinie kontrol.

Representative Results

Strømmen af eksperimentet er kort beskrevet i figur 1 Hvis alle trin er fuldført, billederne opnået ved mikroskopet skal svare til figur 2:. Leve MM celler bør klart ses som lyse diske og BMSCs eller HUVEC'er bør være knap synlige og godt fordelt i baggrunden. Som det ses i figur 2A, MM celler varierer i størrelse fra den ene patient til den anden, men generelt er de mindre end cellelinier. Da de praktisk talt ikke replikere ex vivo under intervallet af forsøget (96 timer) kan de podes ved højere koncentrationer (1-3 million celler / ml). Stroma bør være knapt påviselig, som BMSC holde sig til bunden af ​​brønden og stræk, der udgør en lav profil. Den humane myelomcellelinje H929 er betydeligt større end patient-afledte MM-celler (figur 2B), og replikerer inden 24 timer. At forhindre fortrængning af billedet, er MM-cellelinjer seded en lavere densiteter, 0.300.000 / ml. Figurerne 2C og 2D repræsenterer patient-afledte MM-celler og humane myelomacellelinier H929 henholdsvis co-dyrket med HUVECS. HUVECS først holde sig til bunden af ​​brønden og derefter begynde at kontakte hinanden og danner netværk, der senere bliver tykkere og med lumen.

Figur 4 et eksempel på hvad der kan forventes fra de bearbejdede videoer genereret af billedanalyse algoritme, der viser detekterede levende MM celler pseudo-farvet i grøn (figur 4A) med ingen eller meget lidt grønne signal i BMSCs og HUVEC'er i slutningen af eksperimentet i den højeste medikamentkoncentration, når alle MM celler er døde (figur 4B). Softwaren skal aggregere resultaterne fra forskellige brønde og bygge et diagram afbilder gradvise tab af levedygtighed med tiden for eksponering ved forskellige lægemiddelkoncentrationer (figur 4C). Kurven for dosis-respons afkontrol cellelinie (f.eks H929 eller MM1.S) bør være den samme som for tidligere forsøg; væsentlige afvigelser kan indikere problemer med stamopløsning af stof, der anvendes i eksperimentet.

Det er vigtigt nøje at overholde alle brøndene seedede, før du starter den billeddannende proces, som artefakter kan vildlede billedanalyse software og føre til falske resultater. For eksempel, figur 5A viser resultatet af en for stor tæthed af BMSCs i brønden eller for meget tid der er forløbet mellem trypsinbehandling og såning, hvilket fører til disse celler danner klumper. Figur 5B viser "kolonier" af MM-celler. Hvis cellelinjer podes ved høje densiteter, vil de danne kolonier, når de replikere og dette reducerer nøjagtigheden af det digitale billede analyse algoritme, som det bliver stadig sværere at skelne en celle fra den anden. Figur 5C er et eksempel på det modsatte, hvor for få MM-celler blev podet. Thans optræder ofte, når antallet af MM celler opnået fra knoglemarvsaspirat er under 500.000, og det "døde volumen" til venstre i røret før resuspension bliver sammenlignelig med volumenet af mediet kræves for at resuspendere MM celler i høje tætheder . For at løse dette problem, fastlægge døde volumen for røret bliver brugt og medtage den i fortynding beregningerne. Figur 5D er et eksempel på skævt fokalplan. Bemærk hvordan MM celler på øverste venstre er lyse og dem i nederste højre er mørke. Dette skyldes am ujævnt placeret plade eller forkert placeret mål. Dette vil medføre MM celler i forskellige afsnit af billedet, der skal tælles forskelligt. Scale barer (nederst til højre på hvert billede) repræsenterer 500 um.

Figur 1. Protokol overordnet beskrivelse. (A) Under en knogle Marrow biopsi en ekstra tube aspirat opnås for protokollen. (B) Myelomatose (MM) celler er magnetisk separeret fra andre celler i aspirat. (C) Tre rør indeholdende MM-celler (MM), ikke-MM-celler og plasma henholdsvis opnås fra separationsprocessen. (D) Knoglemarvsskader afledte mesenkymale stamceller (BMSCs) fra tidligere aspirater dyrkes sammen med frisk fremstillet MM-celler og resuspenderes i ekstracellulær matrix (collagen eller basalmembran matrix). (E) Pladen centrifugeres for at sikre, at så mange som muligt MM er i samme fokusplan og BMSC er klar til at klæbe til bunden af brønden. Pladen placeres i inkubator indtil matrix polymeriserer. (F) Hver brønd fyldes med en blanding af dyrkningsmedier og patient-afledt plasma. Pladen anbringes i en inkubator O / N. (G) Lægemidler tilsættes til hver brønd, og pladen anbringes i et mikroskopudstyret med et digitalt kamera, motoriseret trin og bænk top inkubator, og afbildes med jævne mellemrum i en periode på 96 timer. (H) De billedfiler til hver brønd analyseres under anvendelse af en algoritme, segmenter lever MM celler baseret på membran bevægelse (levende celler er pseudo farvet i grøn) og skaber et regneark med ændringer i cellularitet for hver brønd for hvert tidspunkt. Scale bar (nederst til højre) repræsenterer 500 um. (I) En software programgrupper brøndene ved narkotika og koncentrationer og skaber et regneark med kurver af dosis-respons normaliseret, således at de første foranstaltninger er 100%. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Pre-drug forventede udseende af brønde. (A) MM-celler co-dyrket med stroma. (B) Det humane myelomcellelinje H929 samdyrket med stroma. (C) Patient-afledte MM-celler i co-kultur med HUVECS. (D) human myelomcellelinje H929 i co-kultur med HUVECS. Scale barer (nederst til højre på hver figur) repræsenterer 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Anbefalet rumlige fordeling af brønde i en plade med 384 brønde. Hver 384-brønds plade kan bære 3 patientprøver med 7 forskellige lægemidler, eller en patientprøve testet med 21 lægemidler. Brønde i lysegrøn, lyseblå og tan, indeholder MM celler fra tre forskellige patienter. RX1, Rx2, etc., repræsenterer forskellige stoffer, hver ved fem forskellige concentrationer og i to eksemplarer. Fire brønde anvendes som kontroller for hver patient (36-39 for patient 1, 126-129 for patient 2 og 200-203 for patient 3). Brønde i appelsin indeholder cellelinjer på højeste koncentration stof hvert lægemiddel i to eksemplarer. Brønde i gult er cellelinje kontroller (ingen narkotika). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Eksempel på digital billedanalyse og dosis-respons diagrammer. (A) MM-celler i co-kultur med BMSCs, indlejret i kollagen I, udsat for en koncentration på 50 nM carfilzomib. Billedanalyse algoritme registrerer levende celler og pseudo-farver dem med grønt. (B) billeder erhverves med regelmæssige intervaller under hele eksperimentet. I denne Concentratipå af lægemiddel, næsten alle celler er døde i slutningen af ​​96 timer. (C) Grafen viser ændringer i antallet af levedygtige celler i fem forskellige koncentrationer af carfilzomib langs et interval på 96 timer, normaliseret for tiden = 0 timer til 100%. Den humane myelomcellelinje MM1.S blev anvendt som kontrol for lægemiddeleffektivitet. Scale barer (nederst til højre i A og B) repræsenterer 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Fælles fejl, mens såning eller imaging plade. (A) stromaceller "sammenfiltrede". (B) "Kolonier" af MM celler. (C) For få MM-celler. (D) Skæve brændplan. Scale barer (nederst til højre på hvert billede) repræsenterer 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 1. Optimal rumlige fordeling af brønde i 384-brønds plade under anvendelse af en robot pipette. I denne konfiguration 31 forskellige lægemidler kan testes ved 5 forskellige koncentrationer og 2 replikater (grøn). Desuden kan positive kontroller med en cellelinie bruges til at sikre narkotika potens (lyserød). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 2. Rumlig fordeling af drug "master plade". Den robot pipette vil bruge denne plade, hvor hver brønd indeholder en af de 31 stoffer på 20x koncentration, for at skabe stoffet fortynding pladen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 3. Nummerering af brønde, der skal bruges ved udarbejdelsen af en plade med en robot pipette. Beskrevet i protokollen software kræver denne nummerering af brøndene for at tilstrækkeligt kortlægge brøndene til narkotika og koncentrationer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
Supplerende Figur 4. Sammenligning mellem mikrofluid glider (Khin et al., 2014) og den aktuelle protokol. Dosisrespons af H929 multipel myelomcellelinje målt i 24 timer i det tidligere system (øverste venstre bortezomib, midterste venstre melphalan) og i nuværende system ( øverste højre bortezomib og midterste højre melphalan). Til sammenligning, LD50 ved 24 timer for begge platforme var 3,9 nM og 4,1 nM for bortezomib, og 6,4 uM og 14,65 pM for melphalan. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Sammenfattende er dette er en kraftfuld og high throughput metode til at kvantificere kemosensitivitet af primære MM celler og ex vivo farmakodynamik lægemidler på en rekonstruktion af knoglemarven. De kritiske trin i denne protokol er korrekt podning af brøndene og passende fokusering (se figur 2 for forventede resultater): sikre, at MM og stromaceller ensartet fordelt, at stromale celler er adhærerende til bunden af brønden, at alle MM cellerne er i den samme fokale plan, og at MM celler har det aspekt af en lys skive omgivet af en mørk ring.

I tilfælde af uretmæssig såning (se figur 5), ikke fortsætte med forsøget, men snarere frø en anden plade. Hvis problemet opdaget var lav eller høj MM eller stroma celletæthed, tjek cellekoncentrationen i røret før såning og resuspender med jævne mellemrum under såning for at sikre homogen fordeling af celleri medierne. Anvendelsen af ​​en multi-kanal pipette med repeater funktion eller robot dispenser kan reducere dette problem. Andelen af ​​celle / matrix til medierne (1:10), der anvendes i dette assay søgt at maksimere antallet af brønde, der kunne podes og dermed betingelser undersøgt. Men for at studere opløselige faktorer produceret eller forbruges af cancerceller eller stroma, anbefales det, at en andel af celle / matrix til medier være 1: 1.

Som øjeblikket gennemføres, kvantificerer dette system kun ikke-klæbende celler. For at kvantificere ændringer i cellularitet af stroma skulle den software, der skal ændres og tilpasses til de morfologiske karakteristika stroma. Dette ville være en nyttig funktion til at undersøge virkningen af ​​cancerceller eller narkotika i stroma rum. Den her beskrevne system er også i stand til at kvantificere cellularitet af adhærente cancerceller, især hvis de kombineres med vedhængende stroma. Den løsning ville være ændringer i den digitale image analyse algoritme til at adskille kræft fra stroma baseret på morfologiske træk, eller at pre-inkuberes enten population med et fluorescerende farvestof, der kan anvendes til at identificere celler fra nogen af ​​populationerne.

Betydningen af denne protokol i forhold til tidligere fremgangsmåder er evnen til at vurdere lægemiddelreaktion af primære kræftceller i en ex vivo rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø på en ikke-destruktiv måde, således at sekventielle målinger kan udføres, hvilket således tilvejebringer meget mere detaljeret information af farmakodynamik, snarere end på faste tidspunkter. En af begrænsningerne ved vores forudgående assay ⁶ var den lineære gradient genereret af lægemiddeldiffusion, som kun tillod vurdering af lægemiddel følsomhed inden for en lineær vindue af koncentrationer. Den nuværende analysen muliggør vurdering af levedygtigheden tværs enhver række lægemiddelkoncentrationer, idet hver brønd er en særskilt enhed. Begge assays imidlertid generere tilsvarende resultater (

Blandt de mange fremtidige anvendelser af denne fremgangsmåde, er vores gruppe fokuseret i at bruge matematiske modeller til at ekstrapolere de farmakodynamik oplysninger fra disse analyser til klinisk respons. For at nå dette mål foreslår vi at passe datapunkterne opnået (figur 4C) for hvert lægemiddel til et system af differentialligninger, der beskriver dynamikken i lægemiddelinduceret celledød. Derefter, ved at anvende disse matematiske modeller de kendte farmakokinetiske egenskaber af hvert lægemiddel i en klinisk regime, ville det være muligt at estimere den faktiske respons på patientens ^6. Ved at automatisere såning og medicinering under anvendelse af et robotsystem, ville det være muligt at teste ikke blot standard af pleje narkotika, men også over hundrede eksperimentelle lægemidler per prøve (i en 1.536 brønds plade). Dette ville åbne mulighed for i silico kliniske forsøg, hvor hundredvis af eksperimentelle lægemidler kunne testes ikohorter af patienter prøver, således at der skabes overlevelseskurver til virtuelle kliniske forsøg ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system