Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

Abstract

In questo lavoro descriviamo un nuovo approccio che unisce ex vivo test di sensibilità di droga e l'analisi di immagini digitali per stimare chemiosensibilità ed eterogeneità di mieloma multiplo (MM), le cellule derivate da pazienti. Questo approccio consiste nel seminare cellule di MM primarie appena estratti da aspirati midollari nelle camere di microfluidica attuate in piastre multi-così, ognuno composto da una ricostruzione del microambiente midollare, tra cui matrice extracellulare (collagene o membrana basale matrice) e stroma (paziente- le cellule staminali mesenchimali derivate) o cellule endoteliali umane di derivazione (HUVECs). Le camere sono drogati con diversi agenti e concentrazioni, e vengono esposte in sequenza per 96 ore attraverso il microscopio a campo luminoso, in un microscopio motorizzato dotato di una fotocamera digitale. Software di analisi dell'immagine digitale rileva le cellule vive e morte dalla presenza o assenza di movimento della membrana, e genera le curve di cambiamento della redditività in funzione of concentrazione di farmaco e il tempo di esposizione. Usiamo un modello computazionale per determinare i parametri di chemiosensibilità della popolazione tumorale per ciascun farmaco, così come il numero di sub-popolazioni presenti come misura di eterogeneità tumorale. Questi modelli su misura del paziente possono poi essere utilizzati per simulare regimi terapeutici e valutare la risposta clinica.

Introduction

L'obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare la sensibilità ai farmaci del mieloma multiplo (MM) cellule primarie ad un pannello di agenti ex vivo, il più vicino possibile alle condizioni fisiologiche, e con sufficiente precisione che questi risultati possono essere utilizzati per identificare chemioresistente sub popolazioni nel carico tumorale e, in ultima analisi, di parametrizzare modelli computazionali studiati per valutare la risposta clinica.

Modelli di calcolo sono strumenti potenti per analizzare sistemi complessi, quali le interazioni tumore-ospite-terapia. Tuttavia, i modelli sono solo buono come i dati utilizzati per parametrizzare loro. Sfortunatamente, la maggior parte dei dati disponibili in letteratura non possono essere utilizzati nella forma attuale di parametrizzare tali modelli, in quanto spesso vengono ottenuti in condizioni sperimentali reciprocamente esclusivi. Così, nuovi esperimenti sono spesso richiesti con l'obiettivo di ottenere il set di parametri sperimentali necessari. La maggior parte dei saggi di vitalità, tuttavia, sono distruttive e thCi limitati a un piccolo numero di punti di tempo, spesso solo uno. Questo ostacola notevolmente l'utilizzo di test di chemiosensibilità a parametrizzare modelli computazionali, dal momento che tali esperimenti non riescono a fornire informazioni sulla dinamica temporale del sistema. Ciò è particolarmente vero con le cellule tumorali primari, che sono spesso limitati a pochi milioni per campione, e hanno una vita breve dopo la biopsia, limitando così il numero di condizioni sperimentali. Inoltre, la maggior parte dei saggi di vitalità richiedono la separazione del cancro dai non-cancro (stroma) cellule al momento della quantificazione, che aggiunge lavoro extra al protocollo, perturba ulteriormente le cellule, e limita il numero di esperimenti che possono essere eseguite .

40 anni fa, salmone e collaboratori ¹ hanno proposto il loro famoso in vitro colonie formazione per la valutazione di chemiosensibilità delle cellule tumorali. Purtroppo questo test trovate alterne fortune a causa del piccolo numero di mye multiplaloma (MM) campioni di pazienti che erano in grado di formare colonie in condizioni di controllo: è stato stimato che solo un piccolo sottogruppo di 0.001% al 0,1% di cellule di MM sono stati in grado di riprodursi, di essere definiti come le cellule staminali mieloma multiplo ^2. Questo limita significativamente il tasso di successo del saggio e il numero di farmaci che possono essere testati in una sola volta, anche in modelli più recenti ^3. La questione è molto più importante ora, quando gli agenti mm (standard o sperimentali) sono più numerose di quattro decenni fa.

Una limitazione importante di questi primi saggi è la loro uscita dicotomizzate: o un paziente è "sensibili" o "resistenti" ad un particolare farmaco. Non vengono fornite informazioni relative al grado di sensibilità ed eterogeneità della popolazione tumorale. Pertanto, i pazienti con piccole sottopopolazioni di cellule resistenti rapida crescita sarebbero classificate come "sensibili" per la terapia, ma sarebbe ricaduta a breve, e quindi non benEFIT dal trattamento. Data l'importanza della durata della risposta in termini di sopravvivenza globale (OS) dei pazienti oncologici ^4,5, è chiaro come questi test non sono stati in grado di stimare correttamente OS coerente.

Per aggirare queste limitazioni, e di essere in grado di generare modelli computazionali specifici del paziente che stimare la risposta clinica personalizzato ad un pannello di farmaci, abbiamo sviluppato un metodo per la sensibilità ai farmaci test non distruttivo di mieloma multiplo (MM) linee cellulari e cellule di MM primarie in un ex vivo ricostruzione del midollo microambiente osseo, tra cui matrice extracellulare e stroma ^6. Questa analisi, tuttavia, aveva la limitazione di basarsi su un particolare diapositiva microfluidico commerciale, le cui dimensioni e costo limitato il numero di esperimenti o farmaci che potrebbero essere effettuata una volta in un determinato materiale.

Il sistema qui descritto estende questo saggio originale in un alto-throughput organotipica piattaforma dose-risposta, per lo screening in vitro di farmaci, basato su un algoritmo di analisi di immagine digitale non distruttivo quantificare la vitalità cellulare. Ogni bene in 384 e 1.536 pozzetti piastre è una ricostruzione in 3D del midollo microambiente osseo, incluse le cellule primarie di MM, matrice extracellulare, e stroma e fattori di crescita di derivazione del paziente. Microscopia diretta e analisi digitale sono utilizzati per rilevare eventi morte cellulare a concentrazioni del farmaco diversi, che vengono utilizzati per generare superfici dose-risposta. Dai dati in vitro, un modello matematico identifica la dimensione e la chemiosensibilità delle sub-popolazioni all'interno carico tumorale del paziente, e può essere utilizzato per simulare il tumore risponderà al farmaco (s) in condizioni fisiologiche in un regime clinica ⁶ ( Figura 1).

Le principali innovazioni di questa piattaforma sono: (a) piccolo numero di cellule tumorali richiesti (1.000-10.000 per concent drogarazione); (B) la valutazione di efficacia dei farmaci in condizioni fisiologiche (matrice extracellulare, stroma, i fattori di crescita di derivazione del paziente); (C) Nessuna tossicità da vitalità marcatori ⁷ dal momento che solo l'imaging in campo chiaro è usato, quindi non c'è bisogno di trasfettare cellule con fluorescenza ⁸ o bioluminescenza ^9; (D) l'imaging continuo fornisce effetto del farmaco in funzione della concentrazione e tempo di esposizione (farmacodinamica); e (e) l'integrazione tra modelli in vitro e computazionali evolutivi, stimare esito clinico ⁶ (Silva et al., in preparazione).

Il fattore chiave che permette l'algoritmo di analisi di immagine digitale di discernere cancro da cellule stromali è la differente affinità al fondo del pozzo: cellule di MM non aderiscono, e rimangono in sospensione nella matrice, mentre le cellule stromali aderire al fondo del bene e poi allungare.

Questa separazione si verifica anche se MM e stroma unre seminate allo stesso tempo, e si verifica durante il processo / N O di incubazione. La fase di arresto nella centrifuga seguente semina della piastra accelera ulteriormente questo processo. Di conseguenza, le cellule MM appaiono nell'immagine come dischi luminosi rotonda circondata da un anello scuro, mentre lo stroma mantiene un profilo basso e più scura (Figura 2). Così, il test nella sua forma attuale è la più adatta per le cellule tumorali non aderenti, anche se adeguamenti dell'algoritmo potrebbe essere fatto al cancro e stroma separata sulla base di altre caratteristiche morfologiche, come la dimensione e la forma. In questo protocollo descriviamo due tipi di matrice extracellulare (collagene e matrice di membrana basale) e due tipi di co-culture, con (midollo derivate cellule staminali mesenchimali ossee) BMSC e HUVEC, rappresenta le nicchie interstiziali e perivascolari del midollo osseo rispettivamente.

Utilizzando una piastra a 384 pozzetti, 5 concentrazioni per droga e due repliche, siamo stati in grado di TESt fino a 31 diversi farmaci con il campione di un singolo paziente. In piastre 1.536 pozzetti questo numero è 127. Figura 3 illustra lo schema attualmente utilizzata per la semina delle cellule manuale, mentre supplementare figura 1 rappresenta la distribuzione ottimale utilizzando una pipetta robotica. Nel disegno di figura 3, ogni piatto 384 pozzetti può trasportare 3 campioni di pazienti con 7 diversi farmaci, o un campione paziente testato con 21 farmaci. Ogni farmaco è rappresentato da 5 concentrazioni, e ciascuna condizione è seminato in duplicato. 4 pozzetti di controllo (nessun farmaco è mio) vengono seminate per ogni set di 7 farmaci (ad esempio, pozzi 36-39, 126-129 e 200-203). Per garantire l'efficacia dei farmaci utilizzati, una linea cellulare di mieloma umano (ad esempio, H929 o MM1.S) è anche inseminate, drogato in duplicato alla più alta concentrazione di ciascuno dei farmaci utilizzati (pozzi 76-89). Il controllo linea cellulare positiva assicura che i farmaci utilizzati hanno sufficiente potenza, dal momento che le loro curve dose-risposta sono ac comparabiliEsperimenti Ross. Due pozzi sono seminati con una linea cellulare di mieloma come controllo per le condizioni ambientali, in altre parole, per rilevare possibili problemi nel banco superiore incubatore durante l'imaging (pozzi 75 e 90). L'enumerazione dei pozzetti segue un andamento a zig-zag in modo da ridurre la distanza coperta dalla fase motorizzato del microscopio, che riduce il tempo di acquisizione e riduce l'usura dell'apparecchiatura.

Protocol

L'uso di cellule umane derivate da biopsie è stato approvato dal Comitato Etico del Moffitt e condotta sotto la sperimentazione clinica MCC # 14745 condotto presso l'H. Lee Moffitt Cancer Center e Istituto di ricerca come descritto di seguito.

1. Selezione di MM cellule da midollo osseo aspirati

1. Raccogliere aspirati di midollo osseo (20 ml) di pazienti in siringa eparina sodica.
2. Isolare le cellule mononucleate mediante centrifugazione osseo diluito (1: 1 con PBS sterile) su un gradiente di mezzo sterile acquosa centrifugazione a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente.
3. Raccogliere l'interfaccia, che contiene le cellule mononucleari. Lavare le cellule con PBS freddo e contare con un emocitometro o contatore di cellule automatizzata, utilizzando trypan blu per la determinazione della redditività.
4. Preparare un strato sottile preparazione cellulare slide ¹⁰ e macchia con macchia Wright-Giemsa per valutare la percentuale delle plasmacellule ^11.
5. Calcolarela quantità di perline CD138 da utilizzare in base al numero di cellule e la percentuale delle cellule di plasma. Se si parte da campione è inferiore a 20% cellule del plasma, quindi risospendere cellule utilizzando 90 ml di tampone di separazione e 10 ml di CD138 perle per 5 x 10 ⁶ cellule. Se l'avvio del campione è superiore al 20% delle cellule plasmatiche, risospeso utilizzando 80 ml ​​di tampone di separazione e 20 ml di CD138 perle per 1 x 10 ⁷ cellule.
6. Incubare le cellule con perline a 4 ° C per 15 min.
7. Far passare cellule attraverso un colino 35 micron aggiunti separazione di pre-bagnato (LS) colonne posizionati nel separatore di campo magnetico (vedi elenco dei materiali).
8. Rimuovere colonna dal magnete. Raccogliere cellule CD138-selezionato lavando la colonna 3 volte con 1 ml di tampone di separazione.
9. Valutare CD138 arricchimento con un'altra preparazione cellulare sottile strato colorato scorrere ^10.
10. Filtro plasma ottenuto da biopsia del midollo osseo da ciascun paziente con un filtro a siringa da 0,22 micron. Utilizzare plasma frescodallo stesso paziente come le cellule CD138 +.
11. Preparare il supporto per l'esperimento, completandola RPMI-1640 con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino, il 10% del plasma del paziente e l'1% di penicillina-streptomicina.
12. Raccogliere il flusso continuo della selezione (CD138-) e seguire il metodo di adesione classica ¹² per selezionare le cellule mesenchimali del midollo osseo (BMSCs). Poiché questo processo richiede settimane prima BMSCs sono pronti per essere utilizzati, è necessario avere BMSCs pronti da pazienti precedenti o donatori sani.

2. Le cellule semina Piastre (utilizzando un manuale Pipetta multicanale)

1. Utilizzare una piastra multi-pozzo (384 o 1.536), con pareti nere e un fondo piatto trasparente, preferibilmente uno ottimizzato per applicazioni ottiche e colture cellulari.
2. Co-coltura con cellule di MM BMSCs in entrambe collagene di tipo I o matrice membrana basale, tuttavia, richiedono HUVECs matrice membrana basale.
3. Mantenere le densità finali di ogni tipo di cellula inla seguente gamma: 3 x 10 ⁵ cellule / ml per linee cellulari di MM, 2 x 10 ⁵ cellule / ml per HUVECs o BMSCs, e 2 x 10 ⁶ cellule / ml per cellule di MM derivati ​​da pazienti.
   Nota: queste densità sono il risultato di ottimizzazione sperimentale per consentire la massima qualità dell'immagine possibile e più lungo tempo di imaging possibile mantenendo rilevanza biologica nei saggi. Linee cellulari di MM vengono seminate a densità più basse rispetto alle cellule di MM primarie a causa della loro velocità di replicazione più veloce e più grande formato.
4. Co-coltura di cellule di MM primarie con BMSCs:
   1. Preparare aliquote di 100 microlitri di media premiscelato composto da 20 ml di 10x MEM, 20 l di H ₂ O deionizzata, 10 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio e 50 ml di 1x RPMI 1.640 e conservare a 4 ° C.
   2. Al momento della semina delle piastre con cellule di MM, mescolare aliquote di supporto pre-miscelato con 150 ml di 3,1 mg / ml bovino collagene di tipo I in un volume finale di 250 microlitri.
   3. Re-suspestremità 50 ml di cellule in RPMI 1.640 a sei volte la densità finale desiderato.
   4. Mescolare per sospensione cellulare con miscela di collagene per creare un volume finale di 300 ml con una pipetta P200.
   5. Utilizzando una pipetta manuale o ripetitore, depositare una goccia 8 ml di cellulare finale mix / matrice al centro di ogni bene in piastre da 384 pozzetti, o 2 ml in ciascun pozzetto di 1.536 pozzetti (Vedere il punto 2.6 per un esempio di disposizione spaziale di pozzi).
   6. Piatto di centrifuga per 2 min a 500 xg per concentrare tutte le celle sullo stesso piano focale durante l'imaging.
   7. Lasciare piastra in un incubatore (5% CO _2, 37 ° C) per 1 ora, per polimerizzazione del gel.
   8. Aggiungere 80 ml di terreni di crescita integrato (RPMI-1640, 10% FBS, 10% HI derivati ​​dal plasma del paziente, 1% P / S) a ciascun pozzetto in 384 pozzetti piastre o 8 ml in piastre 1.536 pozzetti.
   9. Lasciare piastra O / N in incubatore (5% CO _2, 37 ° C) per l'adesione di stroma al fondo della piastra.
5. Co-culture di cellule di MM primarie con HUVECs:
   1. Trasferimento matrice membrana basale da -80 ° C per un secchio con ghiaccio per scongelare.
   2. Contare e risospendere le cellule primarie e HUVEC in mezzi RPMI-1640 a 4 volte la densità finale, ciascuna in un tubo separato.
   3. Mescolare le cellule del paziente e volumi HUVECs alla proporzione 1: 1.
   4. Una volta matrice membrana basale è scongelato, ma ancora non polimerizzato, mescolare 1: 1 con la miscela delle cellule dal passaggio precedente.
   5. Gocce di semi con un adeguato volume di mix cellula-matrice al centro di ogni bene (8 ml per 384 pozzetti e 2 ml per piastre 1.536 pozzetti, vedere il punto 2.6 per un esempio di disposizione spaziale dei pozzi).
   6. Piatto di centrifuga a 500 xg per 10 min.
   7. Posizionare la piastra in incubatrice (5% di CO _2, ³⁷ ° C) per 1 ora per la polimerizzazione della matrice.
   8. Aggiungere terreni di coltura (RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% di plasma del paziente e 1% P / S) a ciascun pozzetto (80 microlitri per 384 pozzetti, 8 microlitri per 1,5Piastre 36 pozzetti).
   9. Lasciare piastra O / N in incubatore (5% CO _2, 37 ° C) per l'adesione del HUVECs al fondo della piastra.
6. Seed una piastra a 384 pozzetti. La figura 3 illustra una tipica distribuzione spaziale di semina.
   1. A partire dal B2 bene, sementi tante colonne come farmaci da testare. Nell'esempio di figura 3, utilizzare sette farmaci.
   2. Ripetere semina le volte concentrazioni da utilizzare. Nell'esempio in figura 3, utilizzare cinque concentrazioni.
   3. Seed altri quattro pozzi per condizioni di controllo.
   4. Ripetere i punti 2.6.1 e 2.6.2 per la seconda replica.
   5. Ripetere i passaggi da 2.6.1 a 2.6.4 per ogni campione del paziente da testare nel piatto.
   6. Seed una linea cellulare MM in due linee di pozzetti, ciascuno con altrettanti pozzetti come farmaci da testare (in duplicato). Ognuno di questi pozzetti saranno trattati con la più alta concentrazione di ogni farmaco per garantire che il supporto utilizzato aveva adeguata potency (vedi figura 3, per esempio).
   7. Seme due pozzetti con una linea cellulare MM per servire come controllo delle condizioni sperimentali, quali il corretto funzionamento del top incubatore panchina, terreni di coltura, ecc.

3. Semina Cellule Piatti (usando un Robotic Pipettor)

Nota: Questa serie di passi semi una piastra da 384 pozzetti con una pipetta robotica. Il disegno della piastra è raffigurato in figura 1 supplementare, in cui le cellule MM primarie vengono provati su un pannello di 31 farmaci diversi in cinque diverse concentrazioni in due repliche, più controllo negativo. Una linea cellulare è anche seminata come controllo positivo per la valutazione della efficacia dei farmaci e testato contro tutti i 31 farmaci a più alta concentrazione, in due repliche. I file forniti sono per una particolare marca e modello (vedi tabella Materials) ma l'algoritmo possono essere adattati a qualsiasi pipettatori robotici.

1. Co-coltura di cellule primarie MMs con BMSCs:
   1. Preparare una provetta da 15 ml composta da 240 ml di 10x MEM, 240 ml di H ₂ O deionizzata, 120 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio, 600 l di 1x RPMI 1.640 e 1,8 ml di 3,1 mg / ml di collagene di tipo bovino I. Label tubo come "pre-mix per CD138 +". Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   2. Preparare una provetta da 1,5 ml composto da 50 ml di 10x MEM, 50 ml di H ₂ O deionizzata, 25 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio, 125 l di 1x RPMI 1.640 e 375 microlitri di 3.1 mg / ml collagene di tipo bovino I. Label tubo come "pre-mix per Cell Line". Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   3. Risospendere 300 ml di cellule CD138 + in RPMI 1.640 a sei volte la densità finale desiderato. Risospendere 300 ml di cellule BMSC in RPMI 1640 a sei volte la densità finale desiderato. Mescolare i due volumi insieme in una provetta da 1,5 ml e l'etichetta "CD138 +". Mettere in incubatrice fino al momento dell'uso.
   4. Risospendere 60 ml dilinea cellulare in RPMI 1640 a sei volte la densità finale desiderato. Risospendere 60 ml di cellule BMSC in RPMI 1640 a sei volte la densità finale desiderato. Mescolare i due volumi insieme in una provetta da 1,5 ml e l'etichetta "Cell Line". Mettere in incubatrice fino al momento dell'uso.
   5. Utilizzando il software fornito con la pipetta robotica, caricare il primo file di script, "cell_seedingPt47.PGM". Posizionare una casella 200 microlitri punta della pipetta, una piastra di microtitolazione e sterile 384 pozzetti nelle stazioni A, B ed E, rispettivamente, del robot.
   6. Mescolare il contenuto dei tubi "pre-mix per CD138 +" e "CD138 +". Trasferire 1,5 ml del suo contenuto al pozzo # 1 della micropiastra. Posizionare il tubo con volume restante sul ghiaccio. Avviare il programma. Il robot seme i primi 176 pozzi (11 colonne più a sinistra) della piastra a 384 pozzetti e poi pausa. Trasferire il residuo del tubo sul ghiaccio per ben # 2 di micropiastra. Riprendere il programma. Ilrobot seminare i restanti 144 pozzetti della piastra a 384 pozzetti e la pausa.
   7. Mescolare il contenuto dei tubi "pre-mix per Cell Line" e "Cell Line" e trasferire il contenuto di ben n.3 micropiastra. Riprendere programma. Il robot seme restanti 64 pozzetti della piastra da 384 pozzetti.
   8. Posizionare piastra a 384 pozzetti in centrifuga per 10 minuti a 500 xg e 4 ° C. Piastra di trasferimento di incubatrice (5% CO _2, 37 ° C) per 1 ora per il collagene polimerizzazione.
   9. Caricare il secondo file di script, "media_layer.PGM". Mettere 120 ml di dialogo puntale, un serbatoio di reagente con 31 ml di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% del plasma del paziente e l'1% P / S, e la piastra 384 pozzetti con cellule in stazioni A, B ed E, rispettivamente. Eseguire il programma. Il robot trasferirà 81 ml di media per ogni bene. Una volta terminato, il trasferimento piastra a 384 pozzetti per incubatrice e consentire stroma di aderire al substrato O / N.
Preparazione 4. Droga e somministrazione di psicofarmaci Piastre (utilizzo di un manuale Pipetta multicanale)
1. Preparare un modello simile alla figura 3, al fine di facilitare il processo di aggiunta di farmaco per pozzi e ridurre la possibilità di confusione.
2. Preparare, in una piastra a 96 pozzetti, una diluizione seriale di ciascuno dei farmaci da testare nella piastra, per esempio, per cinque concentrazioni utilizzando una diluizione di 3 volte:
   1. Aggiungere 120 ml di droga a 10 volte la concentrazione desiderata nella più alta concentrazione di bene. Ad esempio, utilizzare 500 pM melfalan se la più alta concentrazione le cellule saranno esposte nella piastra sarà di 50 pM.
   2. Aggiungere 80 ml di terreni di crescita (RPMI supplementato con 10% FBS, 10% derivato dal plasma paziente e 1% di penicillina / streptomicina (P / S)) a quattro pozzetti successivi.
   3. Trasferimento 40 microlitri dal primo pozzo alla seconda e mescolare, fino ad un volume totale di 120 microlitri a 1/3 della concentrazione del farmaco prima del pozzo, o 167 mM.
   4. Ripetere il punto 4.2.3 ai rimanenti pozzetti (per esempio, trasferire 40 microlitri dal secondo al terzo, mescolare, poi trasferire 40 microlitri dalla terza alla quarta, ecc.);
3. Trasferire 8 microlitri di ciascun farmaco contenente bene al corrispondente pozzetto nella piastra di cella. Ogni farmaco contenente bene dovrebbe avere un volume sufficiente per 10 pozzi nella piastra di cella. Nell'esempio di figura 3, ciascuna concentrazione di farmaco viene aggiunto a 6 differenti pozzetti, eccetto la più alta concentrazione, che si aggiunge a 8 pozzetti.
4. Aggiungere 8 ml di terreni di crescita (RPMI supplementato con 10% FBS, 10% derivato dal plasma paziente e 1% P / S) ai pozzetti di controllo.
5. Cellule posto in microscopio appena pronto e accendere l'incubazione da banco.

Preparazione 5. Droga e somministrazione di psicofarmaci Piastre (utilizzo di un robot Pipettor)

1. Scaricare file di script per pipettatore robotica da http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
2. Caricare lo script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" nell'interfaccia utente pipetta robotica. Posizionare una casella di punta della pipetta 120 microlitri, serbatoio con 21 ml di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% del plasma del paziente e l'1% P / S e una piastra a 384 pozzetti vuoto nelle stazioni A, B ed E, rispettivamente. Eseguire il programma, la pipetta robotico aggiungerà 30 ml di mezzi di comunicazione per tutti i pozzetti nella piastra da 384 pozzetti.
3. Seguendo il modello dal Supplemental figura 2 aggiungere 200 ml di droga a 20x concentrazione massima per ciascun pozzetto di una micropiastra. Questa configurazione può ospitare fino a 31 farmaci. Per il pozzetto di controllo (CTRL), aggiungere RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% del plasma del paziente e l'1% P / S.
4. Posizionare una casella di punta della pipetta 120 microlitri, micropiastra con farmaci a 20X concentrazione e 384 pozzetti con i media (dal punto 5.1) nelle stazioni di A, B e C, rispettivamente. Caricare il programma "drug_plate.PGM". La pipetta robotica creerà una diluizione serialedi 1: 3, a seguito della distribuzione spaziale in riferimento figura 1.
5. Posizionare una casella di punta della pipetta 120 microlitri, la piastra a 384 pozzetti con diluizione droga (dal punto 5.3) e la piastra di 384 pozzetti con le cellule (dal punto 3.1.9) in stazioni A, B e C, rispettivamente. Carico ed eseguire il programma "drug_add.PGM". Il pipettatore robotico trasferirà 8 ml di farmaco da ciascun pozzetto nella piastra farmaco sua controparte nel piastra di cella. Una volta terminato, trasferire piastra di cella per l'incubatore del microscopio digitale non appena possibile.

6. Imaging di celle a Piatto

Nota: La seguente procedura si applica al microscopio Evo Auto FL, ma può essere facilmente adattato ad altri microscopi stadi motorizzati con panca superiore incubazione o microscopi incubatore-embedded.

1. Pulire l'interno della parte superiore incubatore panchina con etanolammina-wipe e rimuovere con attenzione il coperchio della piastra mentre si posiziona il coperchio del incubator.
2. Seguire i passaggi di software per aggiungere i fari. Questo è il termine usato per riferirsi a punti di riferimento per le regioni di interesse, per essere ripreso successivamente durante l'esperimento (vedere il manuale utente del software per i dettagli).
3. Utilizzare un obiettivo di ingrandimento 5X e 10X. Assicurarsi che l'obiettivo è simile alla figura 2: cellule di MM appaiono i dischi come luminosi, circondati da un anello scuro e BMSCs o HUVECs sono appena visibili. Alcune cellule di MM primarie sono molto piccole e quindi una messa a punto potrebbe essere necessario per trovare la messa a fuoco ottimale.
4. Regolare l'intervallo di acquisizione tra i 10-30 minuti e per la durata di almeno 96 ore. Mentre intervalli più lunghi tra le acquisizioni sono accettabili, intervalli di 45 minuti o più possono ridurre in modo significativo la precisione della misura della vitalità.
5. Configurare il software in modo che le immagini di ogni bene sono memorizzati in file separati chiamati Beacon-1, Beacon-2, ecc Se è stata utilizzata la pipetta robotica, impostare i fari nell'ordine rappresentato inSupplemental Figura 3.
6. Assicurarsi che ci sia abbastanza acqua nel umidificatore incubatore e il gas, in modo che le cellule saranno in condizioni ottimali.
7. Al termine dell'esperimento, copiare le cartelle contenenti le immagini al computer che eseguirà l'analisi.

7. Quantificazione del Drug Sensitivity

Nota: Le seguenti istruzioni l'uso dell'analisi immagine utilizzando un cluster di computer, poiché l'analisi di una piastra multi-pozzo in un personal computer è estremamente lungo.

1. Scarica il software ImageJ dal sito di NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
2. Scaricare lo script e plugin a http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
3. Seguire le istruzioni in http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf per eseguire il software di analisi di immagine digitale. Il risultato dovrebbe essere un foglio di calcolo denominato Results.csv contenente le misure di vitalità ad intervalli regolari per each pozzetto nella piastra per tutta la durata dell'esperimento (cioè, 96 ore).
4. Se si utilizza un manuale pipetta multicanale, effettuare le seguenti operazioni.
   1. Scaricare il file http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt e modificarlo in base al layout del piatto definito nel punto 3.1 (ad esempio, figura 3).
   2. Scaricare il software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar ed eseguirlo utilizzando i file creati in passi 5.3 e 5.4 come parametro di ingresso. Il risultato sarà un Rapporto nome di una cartella contenente più fogli di calcolo, ogni raggruppamento i risultati di un particolare farmaco.
   3. Copiare e incollare il contenuto in modello di foglio di http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Nota: Il risultato dovrebbe essere grafici come quello illustrato in figura 4, che rappresenta la chemiosensibilità del campione diversi farmaci in funzione della concentrazione del farmaco e del tempo di esposizione.
   </ Ol>
   4. Se si utilizza una pipetta robotica, effettuare le seguenti operazioni.
      1. Scaricare file di modello da Scaricare file di script per pipettatore robotica da http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip ed estrarre i file in una directory.
      2. Modificare il file DrugList.csv secondo l'elenco dei farmaci e la concentrazione più alta di droga nel piatto con le cellule. Seguire il layout del Supplemental figura 2.
      3. Eseguire il programma BuildExperimentalDesign.java passando come parametro la cartella contenente i file estratti nel passaggio 7.5.1 ei file Results.csv dal punto 7.3. Il risultato dovrebbe essere due cartelle citarne MM1_S e PtSample. La prima contiene una descrizione dei pozzi (farmaci e concentrazioni) per il controllo positivo linea cellulare. La seconda contiene le stesse informazioni, ma per quanto riguarda la parte della piastra seminati con cellule di pazienti.
      4. Copiare il file Results.csv in ognuna delle directory create nella fase 7.5.3. Scaricail software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar ed eseguirlo utilizzando i file creati nei passaggi 7.5.3 per entrambe le cartelle. Il risultato sarà un nome di cartella report in ciascuna delle cartelle create in 7.5.3. La cartella Rapporto contiene più fogli di calcolo, di ciascuna classe i risultati per un particolare farmaco.
      5. Eseguire il programma BuildGraphPadFile.java e passare come parametro la cartella contenente i file estratti nel passaggio 7.5.1 ei file Results.csv dal punto 7.3. Il risultato sarà un file GraphPad contenente le curve dose-risposta per ciascuno dei 31 farmaci, e normalizzati dal controllo. Ogni grafico conterrà 5 concentrazioni del farmaco per le cellule di MM primarie e una concentrazione per il controllo della linea cellulare positiva.

Representative Results

Il flusso di questo esperimento è brevemente descritto nella Figura 1 Se tutti i passaggi sono stati completati con successo, le immagini ottenute con il microscopio dovrebbe essere equivalente alla Figura 2:. Vivono cellule di MM devono essere chiaramente visibili come dischi luminosi e BMSCs o HUVECs dovrebbero essere appena visibile e ben distribuita in background. Come si vede nella figura 2A, cellule di MM variano nel formato da un paziente all'altro, ma in generale sono più piccole di quelle linee cellulari. Dal momento che praticamente non si replicano ex vivo durante l'intervallo dell'esperimento (96 ore) possono essere seminati a concentrazioni più elevate (1-3 milioni di cellule / ml). Stroma dovrebbe essere appena rilevabile, come BMSC aderire al fondo del pozzo e stirata, presentando un profilo basso. La linea cellulare di mieloma umano H929 è significativamente maggiore di cellule di MM derivati ​​da pazienti (Figura 2B), e replica entro 24 ore. Per evitare affollamento dell'immagine, linee cellulari MM si vedonoded una densità inferiore, 0,3 milioni / ml. Figure 2C e 2D rappresentano cellule di MM derivati ​​da pazienti e linee cellulari di mieloma umane H929, rispettivamente co-coltura con HUVECs. HUVECs prima aderire al fondo del pozzo e poi iniziano a contatto tra di loro e formano reti, che in seguito diventano più spesse e con lumen.

Figura 4 esemplifica ciò che c'è da aspettarsi dai video elaborati generati dall'algoritmo analisi di immagine, mostrando rilevato cellule MM vivi pseudo-colorate in verde (Figura 4A) con nulla o molto poco segnale verde in BMSCs e HUVECs alla fine dell'esperimento nella concentrazione del farmaco più alto, quando tutte le cellule di MM sono morti (Figura 4B). Il software dovrebbe aggregare i risultati provenienti da diversi pozzi e costruire un grafico raffigurante graduale perdita di vitalità con il tempo di esposizione a diverse concentrazioni del farmaco (Figura 4C). La curva di risposta alla dose dellinea cellulare di controllo (ad esempio, H929 o MM1.S) dovrebbe essere lo stesso per esperimenti precedenti; scostamenti significativi potrebbero indicare problemi con la soluzione di riserva di farmaco utilizzato per l'esperimento.

E 'importante osservare attentamente tutti i pozzi seminato prima di iniziare il processo di imaging, come artefatti possono indurre in errore il software di analisi dell'immagine e portare a risultati falsi. Per esempio, la Figura 5A mostra il risultato di una densità eccessiva BMSCs nel tempo ben o troppa trascorso tra tripsinizzazione e semina, portando a queste cellule formano grumi. Figura 5B mostra "colonie" di cellule di MM. Se le linee di cellule vengono seminate ad alte densità, essi formano colonie che si replicano e questo riduce la precisione dell'algoritmo di analisi di immagine digitale diventa sempre più difficile distinguere una cella dall'altra. Figura 5C è un esempio del contrario, dove troppo poche cellule di MM sono stati seminati. Tsuo spesso si verifica quando il numero di cellule di MM ottenute dalla midollare è inferiore a 500.000, e il "volume morto" sinistra nel tubo prima risospensione diventa paragonabile al volume di supporto richiesto per risospendere le cellule MM entro densità . Per risolvere questo problema, determinare il volume morto per il tubo utilizzato per inserirli nei calcoli diluizione. Figura 5D è un esempio di piano focale inclinata. Si noti come le cellule di MM in alto a sinistra sono luminose e quelle in basso a destra sono scuri. Questo è causato da am piastra irregolarmente posto o obiettivo posizionato in modo errato. Ciò causerà cellule di MM in diverse sezioni dell'immagine da contare diverso. Barre di scala (in basso a destra di ogni immagine) rappresentano 500 micron.

Figura 1. Protocollo descrizione generale. (A) Durante una Marro ossow biopsia è ottenuto un tubo supplementare di aspirazione per il protocollo. (B) affetti da mieloma multiplo (MM), le cellule sono magneticamente separati dalle altre cellule del aspirato. (C) Tre provette, contenenti cellule MM (MM), cellule non-MM, e plasma, rispettivamente, sono ottenuti dal processo di separazione. (D) derivate dal midollo osseo cellule staminali mesenchimali (BMSCs) da aspirati precedenti sono co-coltura con cellule di MM appena ottenute, e ri-sospesi in matrice extracellulare (collagene o membrana basale matrice). (E) La piastra viene centrifugata per garantire che il maggior numero possibile MM sono nello stesso piano focale e la BMSC sono pronti ad aderire al fondo del pozzo. La piastra è posta in incubatrice fino matrice polimerizza. (F) Ciascun pozzetto è riempito con una miscela di terreni di coltura e derivato dal plasma del paziente. La piastra è posta in un incubatore O / N. (G) Drugs vengono aggiunti a ciascun pozzetto e la piastra è posta in un microscopiodotato di una macchina fotografica digitale, palco motorizzato e da banco incubatore, e ripreso a intervalli regolari per un periodo di 96 ore. (H) I file di immagine per ciascun pozzetto vengono analizzati utilizzando un algoritmo che segmenti vivono cellule di MM in base al movimento della membrana (cellule vive sono pseudo colorati in verde) e crea un foglio di calcolo con i cambiamenti in cellularità per ogni bene per ogni punto. Barra di scala (in basso a destra) rappresenta 500 micron. (I) gruppi Un programma software i pozzi di farmaci e concentrazioni e crea un foglio di calcolo con le curve di risposta alla dose normalizzato in modo che le misure iniziali sono al 100%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Pre-droga previsto aspetto dei pozzi. (A) cellule di MM co-coltura con stroma. (B) La linea cellulare di mieloma umano H929 co-coltura con stroma. (C) Il paziente-derivato cellule di MM in co-coltura con HUVECs. Mieloma (D) umano linea di cellule H929 in co-coltura con HUVECs. Barre di scala (in basso a destra di ogni figura) rappresentano 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Consigliato distribuzione spaziale dei pozzetti in una piastra da 384 pozzetti. Ogni piatto 384 pozzetti può trasportare 3 campioni di pazienti con 7 diversi farmaci, o un campione paziente testato con 21 farmaci. Wells in verde chiaro, azzurro e marrone chiaro, contengono cellule di MM provenienti da tre diversi pazienti. Rx1, Rx2, ecc, rappresentano diversi farmaci, ciascuno a cinque con diversocentrazioni e in duplice copia. Quattro pozzi vengono utilizzati come controlli per ogni paziente (36-39 per il paziente 1, 126-129 per il paziente 2 e 200-203 per il paziente 3). Wells in arancione contengono linee cellulari a più alta concentrazione di droga di ogni farmaco, in duplice copia. Wells in giallo sono controlli di linea cellulare (senza droga). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Esempio di analisi di immagine digitale e grafici dose-risposta. (A) cellule di MM in co-coltura con BMSCs, incorporato in collagene I, esposto a una concentrazione di 50 nM carfilzomib. Algoritmo di analisi Immagine rileva cellule vive e li pseudo-colori in verde. (B) Le immagini sono acquisite ad intervalli regolari per tutta la durata dell'esperimento. In questo Concentratisu di farmaco, quasi tutte le cellule sono morti alla fine del 96 hr. (C) Il grafico mostra la movimentazione numero di cellule vitali per cinque differenti concentrazioni di carfilzomib lungo un intervallo di 96 ore, normalizzato tempo = 0 hr come 100%. La linea cellulare di mieloma umano MM1.S stato utilizzato come controllo per l'efficacia del farmaco. Barre di scala (in basso a destra di A e B) rappresentano 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Errori comuni durante la semina o l'imaging piastra. (A), le cellule Stroma "Tangled". (B) "colonie" di cellule di MM. (C) Troppo poche cellule di MM. (D) obliqua piano focale. Barre di scala (in basso a destra di ogni immagine) rappresentano 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura di riferimento 1. ottimale distribuzione spaziale di pozzi in lamiera 384 pozzetti utilizzando una pipetta robotico. In questa configurazione 31 diversi farmaci può essere testato in 5 diverse concentrazioni e 2 repliche (verde). Inoltre, i controlli positivi con una linea di cellule possono essere utilizzati per garantire la potenza del farmaco (rosa). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Supplemental Figura 2. Distribuzione spaziale di droga "piatto principale". La pipetta robotico utilizzerà questo piatto in cui ognuno di essi contiene bene uno dei 31 farmaci a 20x di concentrazione, per creare la piastra di diluizione droga. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 3. Numerazione dei pozzi da utilizzare nella preparazione di un piatto con una pipetta robot. Il software descritto nel protocollo richiede questa numerazione dei pozzi, al fine di mappare adeguatamente i pozzi ai farmaci e concentrazioni. Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.

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Supplemental Figura 4. Confronto tra slitta microfluidica (Khin et al., 2014) e il protocollo attuale. Risposta dose di H929 su più righe di cellule di mieloma misurato per 24 ore nel sistema precedente (bortezomib in alto a sinistra, al centro melfalan sinistra) e nel sistema attualmente ( in alto a destra bortezomib e mezzo melfalan a destra). A scopo di confronto, DL50 a 24 ore per entrambe le piattaforme è stato del 3,9 nM e 4,1 nM per bortezomib, e 6,4 micron e 14,65 micron di melfalan. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In sintesi, questo è un metodo di throughput potente e alta quantificare chemiosensibilità delle cellule MM primarie ed ex vivo farmacodinamica dei farmaci in una ricostruzione del midollo osseo. I passaggi critici all'interno questo protocollo sono il corretto semina dei pozzi e focalizzazione adeguata (vedi Figura 2 per i risultati attesi): assicurare che le cellule stromali MM e sono uniformemente distribuiti, che le cellule stromali sono aderenti al fondo del pozzo, che tutti MM cellule sono nello stesso piano focale, e che le cellule MM hanno l'aspetto di un disco luminoso circondato da un anello scuro.

In caso di semina improprio (vedere Figura 5), non continuare con l'esperimento, ma piuttosto inizializzare una seconda piastra. Se il problema rilevato è stato basso o alto MM o densità cellulare stroma, controllare la concentrazione di cellule nel tubo prima della semina e risospendere a intervalli regolari durante il processo di semina per garantire una distribuzione omogenea delle cellulein media. L'uso di una pipetta multicanale con funzione di ripetitore o dispenser robotizzato può ridurre significativamente il problema. La proporzione di cellule / matrice per supporti (1:10) usati in questa analisi ha cercato di massimizzare il numero di pozzetti che possono essere seminate e quindi condizioni studiati. Tuttavia, per studiare fattori solubili prodotti o consumate cellule tumorali o stroma, si raccomanda una proporzione di cellula / matrice di supporto sia 1: 1.

Come attualmente implementato, questo sistema quantifica solo le cellule non aderenti. Per quantificare variazioni cellularità stroma software dovrebbe essere modificato e adattato alle caratteristiche morfologiche del stroma. Questo sarebbe una funzione utile per studiare l'effetto delle cellule tumorali o farmaci nel vano stroma. Il sistema qui descritto è anche in grado di quantificare cellularità delle cellule tumorali aderenti, soprattutto se essi sono combinati con stroma aderente. La soluzione sarebbe modifiche nella imag digitalialgoritmo di analisi e per separare il cancro stroma sulla base di caratteristiche morfologiche, o pre-incubare o popolazione con un colorante fluorescente che potrebbero essere utilizzate per identificare le cellule da entrambi popolazione.

Il significato di questo protocollo rispetto agli approcci precedenti è la capacità di valutare la risposta farmacologica delle cellule tumorali primarie in un ex vivo ricostruzione del microambiente del midollo osseo in maniera non distruttiva, in modo che le misurazioni sequenziali possono essere effettuate, fornendo in tal modo molto più dettagliato informazioni della farmacodinamica, piuttosto che a punti fissi di tempo. Uno dei limiti del nostro previo dosaggio ⁶ era il gradiente lineare generato dalla diffusione del farmaco, che solo permesso valutazione della sensibilità al farmaco all'interno di una finestra lineare di concentrazioni. Il test attuale consente la valutazione della redditività attraverso tutta la gamma di concentrazioni di farmaco, in quanto ogni bene è un'entità separata. Entrambi i saggi, tuttavia, generano risultati equivalenti (

Tra le molteplici applicazioni future di questo approccio, il nostro gruppo è focalizzato in utilizzando modelli matematici per estrapolare le informazioni farmacodinamica fornite da questi saggi in risposta clinica. Per raggiungere questo obiettivo si propone di soddisfare i punti di dati ottenuti (Figura 4C) per ogni farmaco ad un sistema di equazioni differenziali, che descrive la dinamica della morte cellulare indotta da farmaci. Poi, applicando a questi modelli matematici noti proprietà farmacocinetiche di ciascun farmaco in un regime clinica, sarebbe possibile stimare la risposta reale del paziente ^6. Automatizzando semina e drogare utilizzando un sistema robotizzato, sarebbe possibile testare non solo livello di farmaci per la cura, ma anche più di cento farmaci sperimentali per campione (in una piastra ben 1.536). Ciò aprirebbe la possibilità di in silico studi clinici, in cui centinaia di farmaci sperimentali possono essere testati incoorti di campioni di pazienti, creando curve di sopravvivenza per le sperimentazioni cliniche virtuali ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system