Abstract
본 연구에서 우리는 환자 유래 다발성 골수종 (MM) 세포의 감수성 및 이질성을 추정 생체 약물 민감성 분석 및 디지털 이미지 분석을 결합한 새로운 접근법을 설명한다. 이 방법은 환자 - 갓 외 기질 (콜라겐 또는 기저막 매트릭스)과 간질 (각각 포함하는 골수 미세 환경의 재구성 구성된 멀티 웰 플레이트에서 구현 미세 유체 챔버 내로 골수 흡 인물에서 추출 일차 MM 세포를 시드로 이루어져 유래 중간 엽 줄기 세포) 또는 인간 유래 혈관 내피 세포 (HUVEC를). 챔버는 다른 에이전트 및 농도로 마취하고, 디지털 카메라가 장착 된 전동식 현미경, 명 시야 현미경을 통해 96 시간 동안 순차적으로 촬상된다. 디지털 영상 분석 소프트웨어가 존재 또는 멤브레인의 움직임의 유무를 라이브 및 사균을 검출하고, 함수 O로 생존의 변화 곡선을 생성F 약물 농도와 노출 시간. 우리가 각각의 약물에 대한 종양의 감수성 인구의 파라미터뿐만 아니라 종양 이종 척도로서 본 하위 집단의 수를 결정하는 연산 모델을 사용한다. 이러한 환자 맞춤형 모델은 치료법을 시뮬레이트 및 임상 응답을 추정하는데 사용될 수있다.
Introduction
이 방법의 목적은 이들 결과 chemoresistant 서브 식별 할 수있는 충분한 정밀도로, 생리 학적 조건에 가능한 한 가깝게, 생체 에이전트 패널 일차 전지를 다발성 골수종 (MM)의 약물 감수성을 특성화하는 것이다 종양 부담하고, 집단 내의 궁극적 임상 응답을 추정하기위한 계산 모델 파라미터 화.
전산 모델은 암 호스트 치료의 상호 작용과 같은 복잡한 시스템을 분석 할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나 모델은 데이터를 매개 변수화하는 데 사용되는만큼 좋다. 불행하게도, 문헌에서 사용할 수있는 대부분의 데이터는 종종 상호 배타적 실험 조건에서 수득 된 바와 같은 모델을 파라미터 화하는 현재의 형태로 사용될 수 없다. 따라서, 새로운 실험은 종종 필요한 실험 파라미터 세트를 얻는 것을 목표로해야한다. 대부분의 생존 분석은, 그러나, 파괴적이고 일이다우리는 시간 지점 소수 종종 단지 하나에 제한. 이것은 크게 이러한 실험은 시스템의 시간적 동역학에 관한 정보를 제공하지 못한다 감수성 때문에 분석의 사용은, 계산 모델을 매개 변수화 장애. 이것은 종종 따라서 가능한 실험 조건의 수를 제한하는, 샘플 당 몇 백만에 한정 생검 후 짧은 수명을 갖는다 일차 암세포, 특히 사실이다. 또한 대부분의 생존력 분석법은 상기 세포를 교란하고 행할 수 실험의 수를 제한하는, 프로토콜의 추가 작업을 추가 정량의 시간에 비 - 암 (기질) 세포에서 암의 분리를 필요 .
전에 40 년, 연어와 공동 작업자 1은 종양 세포의 감수성의 평가에 대한 시험 관내 콜로니 형성 분석에서 그 유명을 제안했다. 불행하게도,이 분석은 여러 MYE 인해 소수로 혼합 성공을제어 조건에서 콜로니를 형성 할 수 있었다 로마 (MM) 환자 샘플 : 그것은, MM 세포의 0.1 %로 0.001 %의 작은 서브 그룹은 복제 할 수 있다고 추정은 다발성 골수종 줄기 세포를 2로 지칭된다. 이로 인해, 심지어 더 최근의 모델 3에서, 분석의 성공률과 동시에 시험 할 수있는 약물의 수를 제한. (표준 또는 실험) MM 에이전트 사 년 전보다 더 많은 경우이 문제가 훨씬 더 중요하다.
두 환자는 특정 약물에 대한 "민감한"또는 "내성"이다 : 이러한 초기 분석의 주요 한계는 이분법 출력된다. 어떤 정보는 종양 인구의 감도와 이질성의 정도에 대한 제공되지 않습니다. 따라서, 빠르게 성장하는 내성 세포의 작은 하위 집단 환자가 치료에 "민감한"로 분류 될 수 있지만, 곧 재발 것입니다, 따라서하지 벤치료의 혜택을 받고 있습니다. 암 환자의 생존율 4,5- (OS)에서의 응답 시간의 중요성을 감안할 때, 이러한 분석이 올바르게 일관 OS를 추정 할 수 없었다 얼마나 명확하다.
순서 이러한 한계를 회피하고, 약물의 패널 맞춤 임상 응답을 추정 할 환자 별 계산 모델을 생성 할 수 있도록, 우리는 다발성 골수종 (MM) 세포 라인의 비파괴 시험 약물 민감성 방법을 개발 및 세포 외 기질과 기질 6 포함한 골수 미세 환경의 생체 재건 일차 MM 세포. 이 분석은, 그러나, 그 크기 및 비용 장비의 특정 부분에서 한 번에 수행 될 수있는 실험이나 약물의 수를 제한 특히 상업용 마이크로 유체 슬라이드에 의존하는 한계가 있었다.
여기에 설명 된 시스템은 높은으로이 원래의 분석을 확장비파괴 세포 생존율을 정량화하는 디지털 이미지 분석 알고리즘에 기초하여 약물의 시험 관내 스크리닝의 Organotypic 용량 반응 플랫폼, -throughput. 도 384 또는 1536 웰 플레이트의 각 차 MM 세포 외 기질 및 간질 환자 유래 성장 인자를 포함하여 골수 미세 환경의 3D 재구성이다. 라이브 현미경과 디지털 영상 분석은 용량 - 반응 표면을 생성하는 데 사용되는 다른 약물 농도에서 세포 사멸 이벤트를 검출하기 위해 사용된다. 시험 관내 데이터로부터 수학적 모델은 환자의 종양 부담 내의 크기 및 하위 집단의 감수성을 식별하고, 종양 (임상 처방 6에서 생리 학적 조건에 약물 (들)에 반응하는 방법을 시뮬레이션하기 위해 사용될 수있다 그림 1).
이 플랫폼의 주요 혁신은 다음과 같습니다 약물 승낙 당 필요한 암 세포의 () 작은 수 (1,000 ~ 10,000배급); (b) 약물 효능의 생리적 조건 (세포 외 매트릭스, 간질 환자 유래 성장 인자)의 평가; (c) 만 명 시야 촬상 보낸 생존 마커 (7)로부터는 독성, 생물 발광 형광 8 또는 9 세포를 형질 감염시키는 것이 필요도 사용되지 않는다; (d)는 연속 화상 농도 및 노출 시간 (약물 동력학)의 함수로서 약물의 효과를 제공한다; 및 (e) 시험 관내 및 전산 진화 모델과의 통합, 임상 적 결과 (6) (실바 외., 준비)를 추정한다.
디지털 이미지 분석 알고리즘이 간질 세포에서 암을 분별할 수 있도록 핵심 요소 중 바닥에 서로 다른 친 화성이다 웰 : MM 세포 부착, 및 간질 세포의 바닥에 부착하면서, 매트릭스에 현탁 유지하지 잘하고 스트레칭.
이러한 분리는 MM 및 심지어 기질에도 발생동시에 접종 및 배양 O / N 프로세스 중에 발생 재. 플레이트의 원심 분리기에서 스핀 다운 시딩 다음은이 과정을 더욱 가속. 기질이 낮은 프로파일과 어두운 그늘 (그림 2)을 유지하면서 결과적으로, MM 세포는 어두운 링으로 둘러싸인 원형 밝은 디스크와 같은 이미지에 나타납니다. 알고리즘의 조정 등의 크기 및 형상과 같은 다른 형태 적 특징에 기초하여 별도의 암과 기질로 할 수 있지만 이와 같이, 현재의 형태에서의 분석은, 비 - 부착 암세포에 가장 적합하다. 이 프로토콜에서 우리는 (골수 유래 중간 엽 줄기 세포) BMSC와 HUVEC를, 골수 간질 및 혈관 주위의 틈새를 대표로, 세포 외 기질 (콜라겐 및 기저막 매트릭스)의 두 종류뿐만 아니라 공동 배양 두 가지 유형을 서술 각각.
384- 웰 플레이트를 사용하여 약물 농도 및 당 5 개의 복제, 우리는 TES 수 있었다단일 환자의 샘플 (31) 다른 약물에 T 최대. 기업도 1은 로봇을 이용한 피펫 최적 분포를 나타낸다 1536 웰 플레이트에서이 수는, 3은 수동 세포 시딩 사용되는 레이아웃 (127)을 도시도이다. 그림 3에서 디자인, 각 384 웰 플레이트 (21) 약물 테스트 (7) 다른 약물, 또는 한 환자 샘플 3 환자 샘플을 수행 할 수 있습니다. 각각의 약물 농도는 5로 표시되고, 각각의 상태는 중복 접종된다. 4 제어 우물은 (어떤 약물이 추가되지 않습니다) (7) 약물 (예, 우물 36-39, 126-129 및 200-203)의 각 세트에 대한 씨앗을 품고있다. 사용되는 약물의 효능을 확인하기 위해 인간 골수종 세포주 (예, H929 또는 MM1.S)도 시딩하고 (웰 76-89)를 사용 약제의 각각의 가장 높은 농도에서 중복 마취이다. 양 세포주 제어는 투여 량 반응 곡선을 비교 AC 때문에 사용 약물, 충분한 효능을 가질 수 있습니다로스 실험. 두 개의 웰 (75 웰, 90) 촬상시 벤치 탑 인큐베이터에서 발생할 수있는 문제를 검출하는, 즉, 환경 조건에 대한 제어와 같은 골수종 세포주로 접종된다. 웰 열거 획득 시간을 감소시키고, 장비의 마모를 감소 현미경 동력 스테이지에 의해 덮여 거리를 감소시키기 위하여 지그재그 패턴을 따른다.
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Protocol
아래에 설명 된 모 피트의 임상 시험 심사위원회의 승인과 H. 리 모 피트 암 센터 및 연구소에서 실시한 임상 시험 고객 센터 # 14745에서 수행되었을 때 조직 검사에서 파생 된 인간 세포의 사용.
골수 흡인 액에서 MM 세포의 1. 정렬
- 나트륨 헤파린 주사기 환자 골수 흡인 (20 ml)에 수집.
- 주위 온도에서 30 분 동안 400 XG에서 멸균 수성 매질 구배 원심 분리를 통해 (멸균 PBS로 1 일)로 희석 골을 원심 분리하여 단핵 세포를 분리.
- 단핵 세포를 포함하는 인터페이스를 수집. 생존의 결정에 트리 판 블루를 사용하여 차가운 PBS로 세포를 씻으과 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 계산합니다.
- 형질 세포의 비율 (11)을 평가하기 위해 라이트 - 김사 얼룩과 박막 전지 준비 슬라이드 (10)와 얼룩을 준비합니다.
- 계산CD138 비드의 양이 계 세포와 플라즈마 세포의 백분율 숫자를 사용한다. 샘플을 시작하는 20 % 미만의 플라즈마 셀의 경우, 분리 완충액 90 μL, 5 × 106 세포 당 CD138 비드의 10 μL를 사용하여 세포를 다시 일시. 샘플을 시작하는 20 % 이상의 혈장 세포의 경우, 분리 완충액 80 μL 및 1 × 10 7 세포 당 CD138 비드의 20 μL를 사용하여 재현 탁.
- 15 분 동안 4 ° C에서 구슬과 세포를 품어.
- 35 μm의 스트레이너를 통해 세포에 미리 적셔 분리를 추가 합격 (LS) 열 (물질의 목록 참조) 자기장 분리기에 위치.
- 자석에서 열을 제거합니다. 분리 완충액 1 ml의 컬럼을 3 회 세척하여 CD138 선택된 세포를 수집.
- (10)를 밀어 다른 스테인드 박막 전지 준비와 CD138 농축을 평가합니다.
- 필터 플라즈마는 0.22 μm의 주사기 필터로 각 환자로부터 골수 생검에서 얻은. 신선한 플라즈마를 사용하여CD138 + 세포와 같은 환자에서.
- 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청, 10 %의 환자 혈장과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 RPMI-1640을 보완하여 실험을 위해 미디어를 준비합니다.
- 선택 (CD138-)의 흐름을 통해 수집 및 골수 중간 엽 세포 (BMSCs)에 대한 선택 고전 접착 방법 (12)을 따릅니다. BMSCs가 사용할 준비가되기 전에이 과정이 주를 필요로하기 때문에, 이전의 환자 또는 건강한 기증자로부터 BMSCs를 준비 할 필요가있다.
(수동 멀티 채널 피펫 사용) 플레이트 2. 시드 세포
- 우선적으로 한 광학 용도 및 세포 배양을 위해 최적화 검은 벽 멀티 웰 플레이트 (384 또는 1536)와 투명 평평한 바닥을 사용한다.
- 콜라겐 타입 I 또는 기저막 매트릭스 중의 공존 배양 BMSCs와 MM 세포 그러나 된 HUVEC는 기저막 매트릭스를 필요로한다.
- 각 세포 유형의 최종 농도를 유지다음의 범위 : MM 세포주 3 × 105 세포 / ㎖, HUVECs를 또는 BMSCs 2 × 105 세포 / ㎖, 환자 유래 MM 세포를 2 × 106 세포 / ml.
주 : 이들 밀도 분석에서의 생물학적 관련성을 유지하면서 고품질의 이미지 및 최장 촬상 시간을 허용하기 위해 최적화 실험의 결과이다. MM 세포주는 빠른 복제 속도와 더 큰 크기로 인해 기본 MM 세포보다 낮은 밀도로 시딩 하였다. - BMSCs와 차 MM 세포의 공동 문화 :
- 4 ° C에서 10 배 MEM 20 μL, 탈 H 2 O 20 μL, 7.5 % 탄산 수소 나트륨 용액 10 μL 및 1X RPMI 1640 50 μL 저장 이루어진 예비 혼합 미디어 100 ㎕ 분취 량을 준비한다.
- MM 세포 플레이트 시딩 때, 250 μL의 최종 부피로 3.1 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐 타입 I의 150 μL로 미리 혼합 미디어의 분취 액을 혼합한다.
- 다시 SUSP여섯 번 최종 원하는 농도로 RPMI 1640 세포의 50 μl를 끝낸다.
- P200 피펫을 사용하여 300 μL의 최종 볼륨을 생성하는 콜라겐 믹스와 세포 현탁액을 섞는다.
- 수동 또는 리피터 피펫을 사용하여, 잘 1536 웰 플레이트 (공간 구성의 예를 들어 단계 2.6를 참조의 각 웰에 384 웰 플레이트, 또는 2 μL의 각의 중심에 / 매트릭스 믹스 최종 전지의 8 μL 드롭을 입금 우물).
- 500 XG에 2 분 동안 원심 분리 판은 이미징 동안 동일한 초점면 모든 세포를 집중한다.
- 겔 중합, 1 시간 동안 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C)에서 접시를 남겨주세요.
- 1,536 웰 플레이트에 보충 성장 미디어의 80 μL (RPMI-1640, 10 % FBS HI, 10 %의 환자에서 파생 된 플라즈마, 1 % P / S) 각 잘 384 잘 접시, 8 μl를 추가합니다.
- 판 O / N 기질의 접착을위한 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C)에서 판의 바닥에 둡니다.
- 공동 CUHUVECs를 가진 차 MM 세포의 lture :
- 얼음 양동이에 -80 ° C에서 전송 기저막 행렬은 해동합니다.
- 카운트 별도의 튜브에 4 회 최종 밀도, 각각 RPMI-1640 미디어 일차 전지 및 HUVECs를 다시 일시 중지합니다.
- 1 비율 : 1 환자 세포와 HUVEC를 볼륨을 섞는다.
- 이전 단계에서 세포 혼합액으로 1 : 기저막 매트릭스 해동, 여전히 중합되지되면 1을 섞는다.
- 물론 각각의 중앙에 세포 - 매트릭스 믹스의 적절한 볼륨 씨앗 방울 (384 웰 플레이트 8 μL 및 1,536 웰 플레이트 2 μL는 우물의 공간 배열의 예 단계 2.6 참조).
- 10 분 동안 500 XG에 원심 분리기 판.
- 인큐베이터에 넣어 판 매트릭스 중합 1 시간 동안 (5 % CO 2, 37 O를 C).
- 성장 매체를 추가, 384 웰 플레이트 (각 웰에 80 μl를 (RPMI-1640 10 % FBS, 10 %의 환자 혈장과 1 % P / S 보충) 1,5 8 μL36 웰 플레이트).
- 판의 아래로 된 HUVEC의 접착을위한 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C)에서 판 O / N를 남겨주세요.
- . 384 웰 플레이트 종자 (3) 파종의 전형적인 공간 분포를 보여주고있다.
- 약물 테스트 할로 잘 B2에 시작, 많은 열을 씨앗. 도 3의 예에서, 일곱 약물을 사용한다.
- 농도만큼 시드 반복 사용된다. 도 3의 예에서, 오 농도를 사용한다.
- 제어 조건에 네 개 우물을 시드.
- 반복 2.6.1 두 번째 복제에 대 한 2.6.2 단계를 반복합니다.
- 반복 모든 환자 샘플 플레이트에서 테스트하기 위해서는 2.6.4에 2.6.1 단계를 반복합니다.
- 약물 (중복) 테스트 할만큼의 웰과 웰의 두 줄의 각각의 MM 세포주 종자. 이 우물 각각 사용 된 재고가 충분한 poten을 가지고 있는지 확인하기 위해 각 약물의 높은 농도로 처리됩니다CY (예를 들어 그림 3 참조).
- MM 세포주와 씨앗이 우물은 등 벤치 탑 인큐베이터의 적절한 기능, 성장 미디어, 같은 실험 조건의 제어 역할을합니다.
3. 접시에 셀 시드 (로봇 피펫 사용)
참고 : 단계 씨앗이 시리즈 로봇 피펫을 사용하여 384 웰 플레이트. 플레이트의 설계는 기본 MM 세포 복제에 다섯 개의 상이한 농도로 31 가지 약물의 패널에 대하여 시험된다 기업도 1, 플러스, 마이너스의 제어에 도시된다. 세포주는 또한 약물의 효능 평가를위한 양성 대조군으로 시딩 두 복제에서, 가장 높은 농도에서 31 개 모든 약물에 대해 테스트된다. 제공된 파일은 특정 상표 및 모델에 대해 아르 (재료 표 참조) 그러나 알고리즘은 임의 피펫 로봇에도 적용 할 수있다.
- 차 MM 셀의 공동 문화BMSCs와 S :
- 배 MEM 240 μL, 탈 H 2 O의 240 μL, 7.5 % 탄산 수소 나트륨 용액 120 μL, 600 1X RPMI 1640 ㎕의 1.8 ml의 3.1의 Mg / ㎖ 소의 콜라겐 타입 I. 라벨 이루어진 15ml의 튜브를 준비 "CD138 +에 대한 사전 혼합"으로 관. 얼음에 사용할 때까지 놓습니다.
- 배 MEM 50 μL, 탈 H 2 O 50 μL, 7.5 % 중탄산 나트륨 용액 25 μL, 1X RPMI 1640 125 μL 및 3.1 mg을 375 μL 이루어진 1.5 ㎖의 튜브를 준비 / ㎖ 소의 콜라겐 타입 I. 레이블 "세포주에 대한 사전 혼합"으로 관. 얼음에 사용할 때까지 놓습니다.
- 6 배 최종 원하는 농도에 RPMI 1640에서 CD138 + 세포 300 μl를 다시 일시 중지합니다. 여섯 번 최종 원하는 농도로 RPMI 1640 BMSC 세포 300 μl를 다시 일시. 1.5 ML 튜브 및 레이블 "CD138 +"에서 함께 두 볼륨을 섞는다. 인큐베이터에서 사용할 때까지 넣습니다.
- 60 μl를 다시하는 것은 일시 중지6 배 최종 원하는 밀도에서 RPMI 1640 세포주. 여섯 번 최종 원하는 농도로 RPMI 1640 BMSC 세포의 60 μL를 다시 일시. 1.5 ML 튜브 및 레이블 "세포주"함께 모두 볼륨을 섞는다. 인큐베이터에서 사용할 때까지 넣습니다.
- 로봇 식 피펫 터를 구비 소프트웨어를 사용하여, 제 스크립트 파일 "cell_seedingPt47.PGM을"로드. 로봇의 각각 스테이션 A, B와 E에 200 μL 피펫 팁 상자, 마이크로 타이 터 플레이트, 및 멸균 384 웰 플레이트를 놓습니다.
- 튜브의 내용과 "CD138 +" "CD138 +에 대한 사전 혼합"을 섞는다. 마이크로 타이 터 플레이트의 잘 # 1에 그 내용을 1.5 mL로 전송합니다. 얼음에 볼륨을 나머지와 튜브를 놓습니다. 프로그램을 시작합니다. 로봇은 384- 웰 플레이트의 웰 (176) 제 (11 가장 왼쪽의 열) 종자 후 정지한다. 마이크로 타이 터 플레이트 잘 # 2 얼음에 튜브의 나머지를 전송합니다. 프로그램을 다시 시작합니다.로봇은 384 웰 플레이트 및 일시 정지의 나머지 144 우물을 배정합니다.
- 튜브의 내용 "세포주에 대한 사전 믹스"와 "세포주를"혼합 및 마이크로 타이 터 플레이트 잘 # 3에 내용을 전송합니다. 프로그램을 다시 시작합니다. 로봇은 384- 웰 플레이트의 웰 (64)의 나머지를 시드한다.
- 500 XG에 10 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기에서 384 웰 플레이트를 놓습니다. 전달 판은 콜라겐 중합을 1 시간 동안 (5 % CO 2, 37 ℃에서)를 인큐베이터.
- 두 번째 스크립트 파일 "media_layer.PGM"를 넣습니다. 120 μL 피펫 팁 박스, 10 % FBS, 10 %의 환자 혈장 및 1 % P / S가 보충 된 RPMI-1640 31 ml를 가진 시약 저장조 및 무선국 A, B 및 E로 세포 384- 웰 플레이트를 놓고 각각. 프로그램을 실행하십시오. 로봇은 물론 각 미디어의 81 μl를 전송합니다. 일단 완성, / N을 O를 기판에 부착 기질을 인큐베이터 허용하는 384 웰 플레이트를 전송합니다.
4. 의약품의 제조 및 판의 약물 중독자 (수동 멀티 채널 피펫 사용) - 웰에 약물을 추가하는 프로세스를 촉진하고 혼동의 가능성을 줄이기 위해도 3과 유사한 템플릿을 준비한다.
- 96- 웰 플레이트에서, 각각의 약물의 일련의 희석이 3 배 희석액을 사용하여 다섯 가지 농도에 대해, 예를 들어, 플레이트에서 시험하기 위해, 준비 :
- 물론 10 배의 높은 농도에서 원하는 농도를 약 120 μl를 추가합니다. 세포가 플레이트에 노출되는 최고 농도가 50 μM 될 경우 예를 들어, 500 μM 멜 팔란을 사용한다.
- 성장 배지의 80 μL를 추가 네 후속 웰 (RPMI 10 % FBS, 10 %의 환자 유래의 플라즈마와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된).
- 이전에 제 1 웰에서 40 ㎕를 상기 제 1 웰의 약물 농도의 1/3, 또는 1에서 120 μL의 총 부피로 혼합67 μm의.
- 나머지 우물에 단계를 반복 4.2.3 (예, 제 3 혼합하는 제 40 μl를 전송 한 후 3 분 네 번째 등에서 40 μl를 전송).
- 셀 플레이트에 잘 대응에 잘 포함하는 각 약물에서 8 μl를 전송합니다. 잘 포함하는 각각의 약물은 세포 판 10 우물에 충분한 볼륨이 있어야합니다. 도 3의 예에서, 각각의 약물 농도는 8 웰에 첨가되어 높은 농도를 제외하고, 6 개의 웰에 첨가 하였다.
- 성장 배지 8 μL를 추가 대조군 웰 (RPMI 10 % FBS, 10 %의 환자 유래의 플라즈마 및 1 % P / S가 보충 된).
- 현미경에 넣어 세포를 빨리 준비로와 벤치 위에 배양을 켭니다.
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS 인터넷에서 로봇 피펫을위한 스크립트 파일을 다운로드les.zip
- 로봇 피펫 사용자 인터페이스의 스크립트 "media_layer_DRUGPLATE.PGM"를 넣습니다. 120 μL 피펫 팁 상자, 10 % FBS, 10 %의 환자 혈장과 1 % P / S 및 방송국 각각 A, B와 E,에 빈 384 웰 플레이트로 보충 RPMI-1640의 21 mL를 저수지를 놓습니다. 프로그램을 실행, 로봇 피펫은 384 웰 플레이트의 모든 우물에 미디어의 30 μl를 추가합니다.
- 기업도 2에서 템플릿에 따라 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 20 배 최대 농도 약 200 μL를 추가한다. 이 설정은 31 약물까지 수용. 제어도 (CTRL)에, 10 % FBS, 10 %의 환자 혈장과 1 % P / S 보충 RPMI-1640을 추가합니다.
- 방송국 각각 A, B 및 C에 (단계 5.1에서) 미디어 384도 20 배 농도로 약물과 120 μL 피펫 팁 상자, 마이크로 타이 터 플레이트를 배치하고. 프로그램 "drug_plate.PGM"를 넣습니다. 로봇 피펫은 일련의 희석을 만듭니다보충 그림 1의 공간 분포 다음의 3 : 1.
- 120 μL 피펫 팁 상자, 방송국 각각 A, B 및 C에 약물 (단계 5.3에서) 희석 (단계 3.1.9에서) 세포와 384 웰 플레이트에 384 웰 플레이트를 놓습니다. 로드 및 실행 프로그램 "drug_add.PGM". 로봇 피펫은 셀 플레이트의 대응에 약물 플레이트에 각 웰에서 약물의 8 μl를 전송합니다. 일단 완성, 가능한 한 빨리 디지털 현미경의 인큐베이터로 세포 판을 전송합니다.
- 함께 벤치 탑 인큐베이터의 내부를 청소 에탄올 젖은 닦아 조심스럽게 Inc.의 뚜껑을 배치하는 동안 접시의 뚜껑을 제거ubator.
- 비콘을 추가 할 수있는 소프트웨어의 단계를 따릅니다. 이 관심 지역에 대한 랜드 마크를 참조하는 데 사용되는 용어입니다, 실험 (자세한 내용은 소프트웨어 사용자 설명서를 참조하십시오) 동안 연속적으로 이미지화한다.
- 5 배 또는 10 배 확대 목표를 사용합니다. 초점이에게 그림과 유사한 있는지 확인 : MM 세포는 어두운 링과 BMSCs 또는 HUVECs를 거의 볼 수 있습니다에 둘러싸여 밝은 디스크를 나타납니다. 일부 주 MM 세포는 매우 작고, 따라서 미세 조정이 최적의 초점을 찾을해야 할 수도 있습니다.
- 10 ~ 30 분 사이에 적어도 96 시간의 기간 동안 획득 간격을 조정합니다. 수집 간의 간격이 더 이상 허용하면서, 45 분 이상의 간격이 크게 생존력 측정의 정밀도를 감소시킬 수있다.
- 각 웰의 이미지가 비컨 1 비콘 -2- 등 로봇 피펫을 사용한 경우라는 별도의 파일에 저장되도록에 도시 된 순서대로 비컨을 설정 한 소프트웨어 구성보충 그림 3.
- 세포가 최적의 조건에서 될 수 있도록 인큐베이터 가습기와 가스에 충분한 물이,이 있는지 확인합니다.
- 실험 종료 후, 분석을 실행하는 컴퓨터에 이미지를 포함하는 폴더에 복사한다.
- NIH의 웹 사이트에서 ImageJ에 소프트웨어를 다운로드 : http://imagej.nih.gov/ij/
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/에서 스크립트와 플러그인을 다운로드
- 디지털 이미지 분석 소프트웨어를 실행하는 데 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf의 지시 사항을 따르십시오. 결과는 EAC를위한 일정한 간격 생존력 측정을 함유 Results.csv라는 스프레드되어야실험 (즉, 96 시간)의 기간 동안 접시에 시간 잘.
- 수동 멀티 채널 피펫을 사용하는 경우, 다음 단계를 수행하십시오.
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt 파일을 다운로드하여 단계 3.1에 정의 된 플레이트의 레이아웃과 일치하도록 수정 (예를 들어,도 3).
- 소프트웨어 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar 다운로드 및 단계 입력 매개 변수로 5.3 및 5.4에서 만든 파일을 사용하여 실행합니다. 결과는 여러 스프레드 시트를 포함하는 폴더 이름 리포트 각각 특정 약물에 대한 결과를 그룹화 할 것이다.
- 스프레드 시트 템플릿 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx에서 복사 및 붙여 넣기 내용
주 : 이러한 결과는 약물 농도 및 노출 시간의 함수로서 다른 약물 샘플의 감수성을 나타내는도 4에 도시 한 바와 같이 그래프를해야한다. </ OL>
- 로봇 피펫을 사용하는 경우, 다음 단계를 수행하십시오.
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic 템플릿 Files.zip에서 로봇 피펫에 대한 다운로드 스크립트 파일에서 템플릿 파일을 다운로드하여 디렉토리에있는 파일의 압축을 풉니 다.
- 세포와 함께 접시에 약물의 목록과 가장 높은 약물 농도에 따라 DrugList.csv 파일을 수정합니다. 보충 그림 2의 레이아웃을 따르십시오.
- 매개 변수로 단계 7.3에서 7.5.1 단계에서 추출 된 파일과 파일 Results.csv이 들어있는 폴더를 전달하는 프로그램 BuildExperimentalDesign.java을 실행합니다. 결과는 두 개의 폴더가 MM1_S과 PtSample을 이름이어야합니다. 첫째는 세포주에 대한 양성 대조군 웰 (약물 및 농도)에 대한 설명이 포함되어 있습니다. 두 번째는 환자의 세포와 시드 판의 부분에 대한 동일한 정보 만 포함되어 있습니다.
- 단계 7.5.3에서 만든 각 디렉토리에 파일 Results.csv를 복사합니다. 다운로드소프트웨어 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar 모두 폴더에 대한 단계 7.5.3에서 만든 파일을 사용하여 실행합니다. 결과는 7.5.3에서 만든 각 폴더의 폴더 이름을보고있을 것이다. 보고서 폴더는 각 특정 약물에 대한 결과를 그룹화, 여러 스프레드 시트가 포함되어 있습니다.
- 프로그램 BuildGraphPadFile.java을 실행하고 매개 변수로 단계 7.5.1에서 추출 된 파일이 들어있는 폴더를 전달하고 파일을 단계 7.3에서 Results.csv. 결과는 제어에 의해 그래프 패드 (31)의 각각에 대한 약물의 투여 량 반응 곡선을 포함하는 파일, 및 정규화 될 것이다. 각 차트는 기본 MM 세포 5 약물 농도 및 양 세포주 제어 한 농도를 포함 할 것이다.
플레이트 5. 의약품 제조 및 약물 중독자 (로봇 피펫 사용)
접시에 세포의 6 이미징
참고 : 아래의 절차는 Evos 자동 플로리다 현미경에 적용되지만 쉽게 벤치 탑 배양 또는 인큐베이터 내장 현미경 다른 전동 무대 현미경에 적용 할 수 있습니다.
약물 감도 7. 정량
주 : 다음의 설명은 퍼스널 컴퓨터의 멀티 웰 플레이트 분석하기 때문에, 컴퓨터 클러스터를 사용하여 이미지 분석의 이용을 안내하는 것은 매우 시간 소모적이다.
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Representative Results
실험의 흐름은 간단히도 1에서 설명하는 모든 단계가 성공적으로 완료되는 경우, 현미경에 의해 얻어지는 화상이도 2와 동등해야한다 :. MM 세포 명확 밝은 디스크 및 BMSCs 또는 HUVEC를 거의 볼 수 있어야 보지되어야 라이브 잘 배경 분포. 도 2a에 도시 된 바와 같이, MM 세포는 한 환자로부터 다른 크기가 다양하지만, 일반적으로 그들은 세포주보다 작다. 그들이 실질적 실험 간격 동안 생체 외에서 복제하지 않기 때문에 (96 시간)은 그들이 더 높은 농도 (1-3000000 세포 / ml)에 접종 할 수있다. BMSC가 낮은 프로파일을 제시, 잘 스트레치의 바닥에 부착 기질로는 거의 감지 할 수 있어야합니다. 인간 골수종 세포주 H929 환자 유래 MM 세포 (도 2B)보다 상당히 크고, 24 시간 내에 복제. 화상의 군집을 방지하기 위해, MM 세포주 참조되고낮은 밀도, 0,300,000 / ㎖를 공격 한. 2C 및 2D는 MM 환자 유래 세포 및 인간 골수종 세포주 H929를 나타내는도, 각각의 공동과 HUVEC를 배양. HUVEC를 먼저 웰의 바닥에 부착하고 나중에 두껍고와 루멘가 서로 형태 네트워크를 접촉하기 시작한다.
도 4는 실험의 끝에 BMSCs와 HUVEC를 없음 또는 거의 녹색 신호 녹색 (도 4A)에서 의사 - 컬러 라이브 MM 세포를 검출 나타내는, 이미지 분석 알고리즘에 의해 생성 된 처리 된 영상에서 예상 할 수있는 무엇인지 예시 가장 높은 약물 농도, 모든 MM 세포 (그림 4B) 죽은있다. 소프트웨어는 서로 다른 웰로부터의 결과를 집계하고 상이한 약물 농도 (도 4c)에서의 노광 시간과 생존의 점진적인 감소를 나타내는 그래프를 구축한다. 투여 량 반응 곡선제어 세포주 (예, H929 또는 MM1.S)은 이전의 실험과 동일해야; 상당한 편차는 실험에 사용 된 약물의 원액의 문제를 나타낼 수도있다.
아티팩트는 이미지 분석 소프트웨어를 오도 거짓 결과를 초래할 수 있으므로이 신중 이미징 프로세스를 시작하기 전에 시드 모든 웰을 관찰하는 것이 중요하다. 예를 들어,도 5a는 덩어리 형성이 세포 선도.도 5b는 MM 세포 "콜로니"를 나타내고, 트립신 및 시드 사이에 경과 잘 또는 너무 많은 시간 BMSCs의 과도한 밀도의 결과를 나타낸다. 세포주는 고밀도로 시딩하는 경우는 서로로부터 하나의 셀을 분별하기가 점점 어려워지고, 그들은 복제로서 그들이 콜로니를 형성하며 이는 디지털 이미지 분석 알고리즘의 정확도를 감소시킨다.도 5C는 반대의 예 너무 적은 MM 세포를 시딩 하였다. 티골수 흡 인물로부터 수득 MM 세포의 수가 아래 500,000이고, 다시 현탁액 전에 튜브에 남아 "데드 볼륨이"높은 밀도에서 MM 세포를 다시 중단 필요한 미디어의 체적과 비교 될 때 자신이 자주 발생 . 이러한 문제를 해결하기 위하여 사용되는 튜브 데드 볼륨을 결정하고이를 희석 계산에 포함한다.도 5d는 기울어 초점면의 일례이다. 왼쪽 상단에 MM 세포는 밝은과 오른쪽 아래에있는 사람은 어두운 얼마나합니다. 이것은 오전 고르지 배치 판 또는 잘못 배치 목적에 의해 발생합니다. 이것은 이미지의 다른 부분에서 MM 세포가 다르게 계산되게된다. 스케일 바 (각 이미지의 오른쪽 아래)는 500 μm의를 나타냅니다.
뼈 marro 동안 그림 1. 프로토콜 전반적인 설명. (A)생검 w 흡 하나 추가 튜브는 프로토콜에 대해 얻어진다. (B) 다발성 골수종 (MM) 세포는 자기 흡인 다른 세포로부터 분리된다. MM 세포 (MM), 비 MM 세포 및 혈장을 포함하는 (C) 세 관은, 각각의 분리 공정으로부터 얻어진다. 흡인 이전부터 (D) 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (BMSCs)은 갓 얻어진 MM 세포와 공 배양하고, 세포 외 기질 (콜라겐 또는 기저막 매트릭스)에 재현 탁. (E) 플레이트가 가능한 동일한 초점 평면에 있고 BMSC가 웰의 바닥에 부착되도록 준비로 그만큼 MM을 보장하기 위해 아래로 회전시킨다. 매트릭스는 중합까지 판은 인큐베이터에 배치됩니다. (F) 각 웰은 배지와 환자 유래의 혼합 플라즈마로 채워진다. 플레이트를 인큐베이터 O / N에 배치됩니다. (G) 약을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 현미경에 배치디지털 카메라, 모터 구동 스테이지와 벤치 탑 인큐베이터를 구비하고, 96 시간의 기간 동안 일정 간격으로 묘화. (H) 각 웰에 대한 이미지 파일 세그먼트 막 움직임에 기초 MM 세포 사는 알고리즘을 이용하여 분석 하였다 (생균은 의사 녹색으로 착색된다)와 각 시점에 대한 각각의 웰에 대한 세포 수의 변화와 스프레드 시트를 생성한다. 스케일 바 (오른쪽 아래)는 500 μm의를 나타냅니다. (I) 소프트웨어 프로그램은 약물과 농도에 의해 그룹 우물을 초기 조치가 100 % 있음. 그래서 정규화 용량 반응 곡선과 스프레드 시트를 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우물 2. 사전 약물 예상 모습을 그림. () 기질와 공동 배양 MM 세포. (B) 인간 골수종 세포주 H929의 공 배양 기질과. (C) HUVEC를 가진 공동 문화 MM 세포를 환자 유래. (라) 인간의 세포 라인 H929은 HUVEC를 가진 공동 문화 골수종. 스케일 바 (각 그림의 오른쪽 아래)는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 384 웰 플레이트에 웰의 공간 분포를 추천합니다. 각 384 웰 플레이트 (21) 약물 테스트 (7) 다른 약물, 또는 한 환자 샘플로 3 환자 샘플을 수행 할 수 있습니다. 밝은 녹색의 웰스, 파란색과 황갈색 빛, 세 가지 다른 환자의 MM 세포가 포함되어 있습니다. RX1, Rx2에, 등, 다섯 가지 사기꾼에 각각 다른 약물을 나타냅니다centrations 중복에. 네 우물은 각 환자에 대한 컨트롤 (환자 2 환자 1 36 ~ 39, 126-129 및 200-203 환자 3)로 사용된다. 오렌지 웰스 중복, 각 약물의 가장 높은 약물 농도에서 세포 라인이 포함되어 있습니다. 노란색 웰스 셀 라인 컨트롤 (NO 약물)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 디지털 영상 분석 및 용량 반응 차트 4. 예. (A), 콜라겐 I에 포함 된 BMSCs와 공동 - 배양에서 MM 세포, 50 나노 carfilzomib의 농도에 노출. 이미지 분석 알고리즘은 녹색 생균과 의사 컬러들을 검출한다. (B) 이미지는 실험 기간 동안 정기적으로 취득한다. 이 concentrati에서약물에, 거의 모든 세포는 96 시간의 끝에 죽었다. (C) 차트 96 시간의 간격을 따라 carfilzomib의 다섯 가지 농도에 대한 생존 세포 수의 변화, 시간에 대한 표준화 = 100 %로 0 시간을 보여줍니다. 인간 골수종 세포주 MM1.S는 약효에 대한 대조군으로 이용 하였다. 스케일 바 (하단 오른쪽 B)는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 일반적인 오류는 파종 또는 영상 판. (A) 기질 세포는 "얽힌"한다. MM 세포 (B) "콜로니". (C) 너무 몇 MM 세포. (D) 기울어 져 초점면. 스케일 바 (각 이미지의 오른쪽 아래) 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 로봇 피펫을 사용하여 384 웰 플레이트에 웰 1. 최적의 공간 분포.이 구성 (31) 다른 약물에서 5 서로 다른 농도와 2 복제 (녹색)에서 테스트 할 수 있습니다. 또한, 셀 라인과 양성 대조군은 약물의 효능 (핑크)를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2의 공간 분포 약물 "마스터 판". 약물 희석 판을 만들려면 각이 잘 20 배 농도에서 31 약물 중 하나를 포함이 판을 사용합니다 로봇 피펫. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
로봇 피펫으로 접시를 준비 할 때 우물의 보충 그림 3. 번호를 사용합니다. 프로토콜에서 설명하는 소프트웨어는 적절하게 약물과 농도에 우물을지도하기 위해 우물이 번호가 필요합니다에게. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
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미세 유체 슬라이드 사이의 보충 그림 4. 비교 (킨 등. 2014)과 현재의 프로토콜입니다. 이전 시스템에서 24 시간 (왼쪽 상단 볼테 조미 브, 중간 왼쪽 멜 팔란)과 현재의 시스템에서 측정 H929 다발성 골수종 세포주의 용량 반응 ( 오른쪽 상단 보르테 조미 브 중간 오른쪽 멜 팔란). 비교를 위해 두 플랫폼에 대한 24 시간의 LD50은 3.9 nM 내지 볼테 조미 브 4.1 nm의, 6.4 μm의 멜 팔란에 대한 14.65 μM이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
요약하면, 이것은 골수 재건 차 MM 세포 및 약물의 생체 약력학의 감수성을 정량화하는 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 우물의 적절한 파종하고 적절한 (예상 결과에 대한 그림 2 참조) 초점 : MM과 기질 세포가 균일하게 분포되어 있는지 확인, 그 기질 세포는 우물의 바닥에 부착되어 MM 모든 세포는 MM 세포 어두운 링으로 둘러싸인 밝은 디스크의 형태가 동일한 초점 평면에서, 그이다.
시딩 부적절한 경우 실험을 계속하지 않는다 (도 5 참조)이 아니라 제 2 플레이트를 시드. 문제는 낮거나 높은 MM 또는 기질 세포 밀도, 세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 시드 과정 시드 및 정기적으로 재현 탁 전에 튜브에 세포 농도를 확인 하였다 감지되면미디어. 리피터 기능 또는 로봇 디스펜서를 멀티 채널 피펫을 사용하면이 문제를 현저히 감소시킬 수있다. 이 분석에 사용되는 미디어 (1시 10분)에 셀 / 매트릭스의 비율은 시드 따라서 조건이 연구 될 수있는 웰의 수를 최대화하기 위해 노력했다. 그러나, 생산 또는 암 세포 또는 기질에 의해 소비 수용성 요인을 연구하기 위해,이 매체에 셀 / 매트릭스의 비율이 1이 될 것이 좋습니다 : 1.
현재 구현 된 바와 같이,이 시스템은 비 - 부착 성 세포를 정량화한다. 기질의 세포 수의 변화를 정량화하기 위해 소프트웨어는 기질의 형태 학적 특성에 수정되고 조절 될 필요가있다. 이것은 기질 구획 암세포 또는 약물의 효과를 연구하기위한 유용한 특징이 될 것이다. 여기에 설명 된 시스템은 이들이 부착 기질과 결합되는, 특히, 같은 부착 암세포의 세포 수를 정량화 할 수 없다. 용액 디지털 IMAG에서 변형 될E 분석 알고리즘은 형태 적 특징에 기초하여 기질로부터 암을 분리, 또는 어느 집단으로부터 세포를 식별하기 위해 사용될 수있는 형광 염료와 인구를 미리 배양.
그 순차 측정 따라서 더 상세한 제공 할 수 있도록 이전의 접근법에 비해이 프로토콜의 의미는, 비파괴 방식으로 골수 미세 환경의 생체 재건 차 암세포의 약물 반응을 평가할 수있는 능력이다 약력학의보다는 고정 된 시점에서 정보. 우리의 분석에 앞서 6의 한계 중 하나는 단지 농도의 선형 윈도우 내에 약물 감도 평가를 허용 약물 확산에 의해 생성되는 선형 구배였다. 각 웰은 별도의 법인이기 때문에 현재의 분석은, 약물 농도의 범위에 걸쳐 생존 능력의 평가를 할 수 있습니다. 두 분석은, 그러나, (동등한 결과를 생성 이 방법의 여러 미래 애플리케이션 중에서, 우리 그룹은 임상 반응에 의해 제공되는 상기 분석 약력학 정보를 추정하는 수학 모델을 사용하여 집중된다. 우리는 약물 - 유도 된 세포 사멸의 동력학을 기술하는, 미분 방정식들의 시스템에 대한 각각의 약물 얻어진 데이터 포인트 (도 4C)을 맞추어 제안이 목표를 달성하기 위해. 그리고, 이러한 수학적 모델 임상 요법에서 각 약물의 약동학 특성 공지인가함으로써, 환자 (6)의 실제 응답을 추정하는 것이 가능하다. 파종을 자동화 및 로봇 시스템을 사용 약물 중독자함으로써, 치료 약물뿐만 아니라 표준을 테스트 할 수있을뿐만 아니라, 백 이상 실험 약물 샘플 당 (1,536 웰 플레이트에서) 것이다. 이 실험 약물의 수백에서 테스트 할 수있는 실리에 임상 시험에 대한 가능성을 열 것환자 샘플의 코호트, 따라서 가상의 임상 시험 (13) 생존 곡선을 작성.
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Acknowledgments
이 연구는 플로리다의 BANKHEAD - 콜리 팀 과학 그랜트 (2BT03), 건강 / 국립 암 연구소 (1R21CA164322-01) 및 모 피트 암 센터의 팀 과학 부여의 국립 연구소의 국가가 투자되었다. 이 작품은 H. 리 모 피트 암 센터 연구원, NCI 지정 종합 암 센터 (P30-CA076292)에서 중개 연구 핵심 시설에 의해 부분적으로 지원하고있다. 일차 전지에 대한 액세스는 모 피트 암 센터에서 전체 암 관리 프로토콜을 통해 가능하게되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1 mg/ml Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
References
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