Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

Abstract

En este trabajo se describe un nuevo método que combina ensayos ex vivo de sensibilidad de drogas y análisis de imágenes digitales para estimar quimiosensibilidad y heterogeneidad de mieloma múltiple las células derivadas del paciente (MM). Este enfoque consiste en la siembra de células MM primarias recién extraídos de aspirados de médula ósea en las cámaras de microfluidos implementadas en placas de múltiples pocillos, cada uno compuesto de una reconstrucción del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular (colágeno de la membrana basal o matriz) y el estroma (el paciente células madre mesenquimales derivadas) o células endoteliales derivadas de seres humanos (HUVEC). Las cámaras están drogados con diferentes agentes y concentraciones, y se crean imágenes de forma secuencial durante 96 horas a través de la microscopía de campo claro, en un microscopio motorizado equipado con una cámara digital. Software de análisis de imagen digital detecta células vivas y muertas de la presencia o ausencia de movimiento de la membrana, y genera curvas de cambio en la viabilidad como una función of concentración del fármaco y el tiempo de exposición. Usamos un modelo computacional para determinar los parámetros de la quimiosensibilidad de la población tumor para cada fármaco, así como el número de sub-poblaciones presentes como una medida de la heterogeneidad tumoral. Estos modelos adaptados al paciente se pueden utilizar para simular los regímenes terapéuticos y estimar la respuesta clínica.

Introduction

El objetivo de este método es caracterizar la sensibilidad a los fármacos de mieloma múltiple (MM) células primarias a un panel de agentes ex vivo, lo más cerca posible a las condiciones fisiológicas, y con suficiente precisión que estos resultados se pueden utilizar para identificar quimiorresistente sub- poblaciones dentro de la carga tumoral y, en última instancia, para parametrizar modelos computacionales diseñados para estimar la respuesta clínica.

Los modelos computacionales son herramientas poderosas para analizar sistemas complejos, como las interacciones huésped-terapia del cáncer. Sin embargo, los modelos sólo son tan buenos como los datos utilizados para parametrizar ellos. Desafortunadamente, la mayoría de los datos disponibles en la literatura no se pueden utilizar en su forma actual para parametrizar tales modelos, ya que a menudo se obtienen en condiciones experimentales mutuamente excluyentes. De este modo, los nuevos experimentos se requieren a menudo con el objetivo de obtener el conjunto de parámetros experimentales necesarios. La mayoría de los ensayos de viabilidad, sin embargo, son destructivas y THnos limitamos a un pequeño número de puntos de tiempo, a menudo sólo uno. Esto perjudica en gran medida el uso de ensayos chemosensitivity parametrizar modelos computacionales, ya que tales experimentos no proporcionan información sobre la dinámica temporal del sistema. Esto es especialmente cierto con las células de cáncer primario, que a menudo se limitan a unos pocos millones por muestra, y tienen una vida útil corta después de la biopsia, lo que limita el número de condiciones experimentales disponibles. Además, la mayoría de los ensayos de viabilidad requieren la separación del cáncer de las células no cancerosas (estroma) en el momento de la cuantificación, lo que añade trabajo extra para el protocolo, perturba aún más las células, y limita el número de experimentos que puede realizarse .

Hace 40 años, salmón y colaboradores ¹ propusieron su famoso ensayo de formación de colonias in vitro para la evaluación de la quimiosensibilidad de las células tumorales. Desafortunadamente este ensayo encontró un éxito desigual debido al pequeño número de múltiples myeloma (MM) muestras de pacientes que eran capaces de formar colonias bajo condiciones de control: Se estima que sólo un pequeño subgrupo de 0,001% a 0,1% de las células MM eran capaces de replicación, se denominan como células madre de mieloma múltiple ^2. Esto limita significativamente la tasa de éxito del ensayo y el número de medicamentos que podrían ser probado en un tiempo, incluso en modelos más recientes ^3. Este problema es mucho más importante ahora, cuando agentes MM (estándar o experimentales) son más numerosos que hace cuatro décadas.

Una limitación importante de estos primeros ensayos es su producción dichotomized: ya sea un paciente es "sensible" o "resistente" a un medicamento en particular. No se proporciona información sobre el grado de sensibilidad y la heterogeneidad de la población tumor. Por lo tanto, los pacientes con pequeñas subpoblaciones de células de rápido crecimiento resistentes serían clasificados como "sensibles" a la terapia, sino que recaer en breve, por lo que no beneficio de tratamiento. Dada la importancia de la duración de la respuesta en la supervivencia global (OS) de pacientes con cáncer ^{de 4,5,} está claro cómo estos ensayos no fueron capaces de estimar correctamente OS consistentemente.

Con el fin de evitar estas limitaciones, y ser capaz de generar modelos computacionales específicos del paciente que estimar la respuesta clínica personalizado a un grupo de medicamentos, hemos desarrollado un método para la sensibilidad de drogas prueba no destructiva de mieloma múltiple (MM) líneas celulares y las células MM primarias en una reconstrucción ex vivo del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular y el estroma ^6. Este ensayo, sin embargo, tenía la limitación de depender de una diapositiva de microfluidos comercial en particular, cuyas dimensiones y el coste restringido el número de experimentos o medicamentos que podrían llevarse a cabo a la vez en un equipo determinado.

El sistema aquí descrito se extiende este ensayo original en un alto-throughput organotípicos plataforma de dosis-respuesta, para el cribado in vitro de fármacos, basado en un algoritmo de análisis de imagen digital para no destructiva cuantificar la viabilidad celular. Cada pocillo en 384 o 1536 pocillos placas es una reconstrucción 3D del microambiente de la médula ósea, incluyendo células primarias mm, matriz extracelular, y el estroma y factores de crecimiento derivados del paciente. Microscopía vivo y análisis digital de imágenes se utilizan para detectar eventos de muerte celular en diferentes concentraciones de fármaco, que se utilizan para generar superficies de dosis-respuesta. De los datos in vitro, un modelo matemático identifica el tamaño y la quimiosensibilidad de sub-poblaciones dentro de la carga tumoral del paciente, y se puede utilizar para simular cómo respondería el tumor al fármaco (s) en condiciones fisiológicas en un régimen de clínica ⁶ ( Figura 1).

Las principales novedades de esta plataforma son: (a) pequeño número de células cancerosas requeridos (1.000-10.000 por concent drogasración); (B) la evaluación de la eficacia del fármaco en condiciones fisiológicas (matriz extracelular, estroma, factores de crecimiento derivados del paciente); (C) Ninguna toxicidad de los marcadores de viabilidad ⁷ ya que sólo de imágenes de campo claro se utiliza, por lo tanto no hay necesidad de transfectar células con fluorescencia o bioluminiscencia ^{8 9;} (D) de formación de imágenes continua proporciona efecto de la droga como una función de la concentración y tiempo de exposición (farmacodinámica); y (e) la integración entre in vitro y modelos computacionales evolutivas, para estimar el resultado clínico ⁶ (Silva et al., en preparación).

El factor clave que permite que el algoritmo de análisis de imagen digital para discernir el cáncer de células del estroma es su diferente afinidad a la parte inferior del pozo: células MM no se adhieren, y permanecen en suspensión en la matriz, mientras que las células estromales se adhieren a la parte inferior de la bien y luego estirar.

Esta separación se produce a pesar de que MM y un estromare sembrado al mismo tiempo, y se produce durante el proceso de O / N de la incubación. El desacelerándose en la centrífuga después de la siembra de la placa se acelera aún más este proceso. Como consecuencia, las células MM aparecen en la imagen como discos redondos brillantes rodeadas por un anillo oscuro, mientras que el estroma mantiene un perfil bajo y un tono más oscuro (Figura 2). Por lo tanto, el ensayo en su forma actual es el más adecuado para las células cancerosas no adherentes, aunque los ajustes en el algoritmo se podría hacer con el cáncer independiente y estroma en base a otras características morfológicas, como el tamaño y forma. En este protocolo se describen dos tipos de matriz extracelular (colágeno y matriz de membrana basal), así como dos tipos de co-cultivos, con (células madre mesenquimales derivadas de médula ósea) BMSC y HUVECS, en representación de los nichos intersticiales y perivasculares de la médula ósea , respectivamente.

El uso de una placa de 384 pocillos, 5 concentraciones por drogas y dos repeticiones, que fueron capaces de test hasta 31 fármacos diferentes con la muestra de un solo paciente. En placas de 1536 pocillos este número es 127. La Figura 3 representa la disposición utilizada actualmente para la siembra de células manual, mientras que la Figura Suplementaria 1 representa la distribución óptima usando una pipeta robótica. En el diseño de la figura 3, cada placa de 384 pocillos puede llevar a 3 muestras de pacientes con 7 fármacos diferentes, o una muestra de pacientes evaluados con 21 drogas. Cada fármaco se representa por 5 concentraciones, y cada condición se siembra en los duplicados. 4 pozos de control (ningún fármaco añadido) se siembran para cada conjunto de 7 medicamentos (por ejemplo, pozos 36-39, 126-129 y 200-203). Para garantizar la potencia de los medicamentos que se utilizan, una línea celular de mieloma humano (por ejemplo, H929 o MM1.S) también es cabeza de serie, y drogada por duplicado a la mayor concentración de cada uno de los fármacos utilizados (pozos 76-89). El control de la línea de células positivas se asegura de que los medicamentos que se utilizan tienen una potencia adecuada, ya que sus curvas de respuesta de dosis son comparables acexperimentos Ross. Dos pocillos se sembraron con una línea celular de mieloma como control para las condiciones ambientales, en otras palabras, para detectar posibles problemas en la incubadora de banco durante la exploración (pozos 75 y 90). La enumeración de los pozos sigue un patrón en zigzag con el fin de reducir la distancia recorrida por la etapa motorizada del microscopio, lo que reduce el tiempo de adquisición y reduce el desgaste del equipo.

Protocol

El uso de células humanas derivadas de biopsias que se describen a continuación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Moffitt y llevó a cabo en el marco del ensayo clínico MCC # 14745 realizado en el Centro de Cáncer H. Lee Moffitt y el Instituto de Investigación.

1. Clasificación de las células MM de Médula Ósea aspirados

1. Recoger aspirados de médula ósea (20 ml) de pacientes en la jeringa de heparina de sodio.
2. Aislar las células mononucleares por centrifugación ósea diluido (1: 1 con PBS estéril) sobre un gradiente de centrifugación medio acuoso estéril a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Recoger el interfaz, que contiene las células mononucleares. Lavar las células con PBS frío y contar utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado, usando azul de tripano para la determinación de la viabilidad.
4. Preparar una capa fina de preparación de células de diapositivas ¹⁰ y mancha con Wright-Giemsa para evaluar el porcentaje de células plasmáticas ^11.
5. Calcularla cantidad de perlas CD138 para ser usado en base al número de células y el porcentaje de células plasmáticas. Si a partir de la muestra es menos de 20% de células plasmáticas, a continuación, volver a suspender las células utilizando 90 l de tampón de separación y 10 l de perlas de CD138 por 5 x 10 ⁶ células. Si a partir de la muestra es más de 20% de células plasmáticas, se resuspendieron usando 80 l de tampón de separación y 20 l de perlas de CD138 por 1 x 10 ⁷ células.
6. Se incuban las células con perlas a 4 ° C durante 15 min.
7. Pasar las células a través de un colador de 35 micras añaden separación pre-humedecida (LS) columnas colocadas en el separador de campo magnético (véase la lista de materiales).
8. Retirar la columna de imán. Recoger las células CD138-seleccionado por lavado de la columna 3 veces con 1 ml de tampón de separación.
9. Evaluar el enriquecimiento CD138 con otra preparación de células de capa fina manchado deslice ^10.
10. Filtro de plasma obtenido a partir de biopsia de médula ósea de cada paciente con un filtro de jeringa de 0,22 micras. Utilice plasma frescodel mismo paciente como las células CD138 +.
11. Preparar los medios de comunicación para el experimento completándolo RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 10% de plasma del paciente y 1% de penicilina-estreptomicina.
12. Recoger el flujo a través de la selección (CD138-) y seguir el método de adhesión clásica ¹² para seleccionar las células mesenquimales de médula ósea (BMSC). Dado que este proceso requiere semana antes de BMSCs son listo para ser utilizado, es necesario tener listo BMSCs de pacientes anteriores o donantes sanos.

2. Las células de siembra en placas (usando una pipeta multicanal manual)

1. Utilice una placa de múltiples pocillos (384 o 1536), con paredes negras y un fondo plano transparente, preferentemente uno optimizado para aplicaciones ópticas y cultivo celular.
2. Co-cultivo con células BMSCs mM en cualquiera de colágeno de tipo I o de la matriz de la membrana basal, sin embargo, requieren HUVECs matriz de membrana basal.
3. Mantener las densidades finales de cada tipo de célula enla siguiente gama: 3 x 10 ⁵ células / ml para las líneas celulares mm, 2 x 10 ⁵ células / ml para HUVECs o BMSCs, y 2 x 10 ⁶ células / ml para las células MM derivados del paciente.
   Nota: Estas densidades son el resultado de la optimización experimental para permitir la máxima calidad de imagen y mayor tiempo posible formación de imágenes mientras se mantiene relevancia biológica en los ensayos. Líneas celulares de MM se siembran a densidades más bajas que las células MM primarias debido a su rápida tasa de replicación y el tamaño más grande.
4. Co-cultivo de células MM primarias con BMSCs:
   1. Preparar 100 ml de alícuotas de los medios de comunicación pre-mezclado que consiste en 20 l de 10x MEM, 20 l de _H2O desionizada, 10 l de solución de bicarbonato de sodio al 7,5%, y 50 l de 1x RPMI 1640 y se almacena a 4 ° C.
   2. En el momento de la siembra de las placas con células MM, mezclar partes alícuotas de medios pre-mezclada con 150 l de 3,1 mg / ml de colágeno tipo I bovino a un volumen final de 250 microlitros.
   3. Re-suspterminar 50 l de células en medio RPMI 1640 en seis veces la densidad final deseada.
   4. Mezclar a la suspensión de células con la mezcla de colágeno para crear un volumen final de 300 l con una pipeta P200.
   5. Usando una pipeta manual o repetidor, depositar una gota 8 l de mezcla final de células / matriz en el centro de cada pocillo en placas de 384 pocillos, o 2 l en cada pocillo de placas de 1536 pocillos (Vea el paso 2.6 para un ejemplo de disposición espacial de pozos).
   6. Placa Centrifugar durante 2 min a 500 xg para concentrar todas las células en el mismo plano focal durante la exploración.
   7. Deja placa en una incubadora (5% de CO _2, 37 ° C) durante 1 hr, para la polimerización de gel.
   8. Añadir 80 l de medio de crecimiento suplementado (RPMI-1640, 10% FBS HI, 10% de plasma derivado del paciente, 1% P / S) placas a cada pocillo en 384 pocillos, o 8 l en placas de 1536 pocillos.
   9. Deja placa de O / N en la incubadora (5% de CO _2, 37 ° C) para la adhesión de estroma a la parte inferior de la placa.
5. Co-culture de las células MM primarias con HUVECs:
   1. Transferencia matriz de membrana basal de -80 ° C a un cubo de hielo se descongele.
   2. Contar y volver a suspender las células primarias y HUVECs en medios RPMI-1640 a 4 veces la densidad final, cada uno en un tubo separado.
   3. Mezclar las células del paciente y volúmenes HUVEC en una proporción 1: 1.
   4. Una vez que la matriz de la membrana basal se descongela, pero todavía no polimeriza, mezcla 1: 1 con mezcla de células de la etapa anterior.
   5. Gotitas de semillas con un volumen adecuado de la mezcla de célula-matriz en el centro de cada pocillo (8 l para placas de 384 pocillos y 2 l para placas de 1536 pocillos, consulte el paso 2.6 para un ejemplo de disposición espacial de los pozos).
   6. Placa Centrifugar a 500 xg durante 10 min.
   7. Coloque la placa en la incubadora (5% de _CO2, 37 ^{° C)} durante 1 hora para la polimerización de la matriz.
   8. Añadir medio de cultivo (RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 10% de plasma del paciente y 1% P / S) a cada pocillo (80 l para placas de 384 pocillos, 8 l de 1,5Placas de 36 pocillos).
   9. Deja placa de O / N en la incubadora (5% de CO _2, 37 ° C) para la adherencia de HUVECs a la parte inferior de la placa.
6. Seed una placa de 384 pocillos. La Figura 3 representa una distribución espacial típico de la siembra.
   1. A partir del B2 así, sembrar tantas columnas como fármacos a ensayar. En el ejemplo de la Figura 3, utilizar siete medicamentos.
   2. Repita la siembra tantas veces como concentraciones a utilizar. En el ejemplo en la Figura 3, utilice cinco concentraciones.
   3. Semillas cuatro pozos más para las condiciones de control.
   4. Repita los pasos 2.6.1 y 2.6.2 para la segunda réplica.
   5. Repita los pasos 2.6.1 al 2.6.4 para cada muestra de paciente a ensayar en el plato.
   6. Seed una línea celular MM en dos líneas de pozos, cada uno con tantos pozos como fármacos a ensayar (por duplicado). Cada uno de estos pozos serán tratados con la mayor concentración de cada fármaco para asegurar que el stock utilizado tenía poten adecuadacy (véase la Figura 3, por ejemplo).
   7. Semilla dos pozos con una línea celular MM para servir como control de las condiciones experimentales, tales como el correcto funcionamiento de la incubadora parte superior del banco, medios de crecimiento, etc.

3. siembra de células en placas (Usando una pipeta robótica)

Nota: Esta serie de pasos semillas una placa de 384 pocillos usando una pipeta robótica. El diseño de la placa se representa en la Figura Suplementaria 1, donde las células MM primarias se ensayaron frente a un panel de 31 fármacos diferentes a cinco concentraciones diferentes en dos repeticiones, más el control negativo. Una línea celular también se siembra como control positivo para la evaluación de la eficacia del fármaco y probado contra todos los 31 fármacos en la concentración más alta, en dos repeticiones. Los archivos proporcionados son para una marca y modelo en particular (ver tabla Materiales), pero el algoritmo se pueden adaptar a cualquier pipetas robóticos.

1. Co-cultivo de células MM primarias con BMSCs:
   1. Preparar un tubo de 15 ml que consiste en 240 l de 10x MEM, 240 l de _H2O desionizada, 120 l de solución de bicarbonato de sodio al 7,5%, 600 l de 1x RPMI 1640 y 1,8 ml de 3,1 mg / ml de colágeno tipo I. Bovinos Label tubo como "pre-mezcla para CD138 +". Coloque en hielo hasta su uso.
   2. Preparar un tubo de 1,5 ml que consiste en 50 l de 10x MEM, 50 l de _H2O desionizada, 25 l de solución de bicarbonato de sodio al 7,5%, 125 l de 1x RPMI 1640 y 375 l de 3,1 mg / ml de colágeno tipo I. Bovinos Label tubo como "pre-mezcla para la línea celular". Coloque en hielo hasta su uso.
   3. Vuelva a suspender 300 l de células CD138 + en RPMI 1640 a seis veces la densidad final deseada. Vuelva a suspender 300 l de células BMSC en RPMI 1640 a seis veces la densidad final deseada. Mezclar los dos volúmenes juntos en un tubo de 1,5 ml y la etiqueta "CD138 +". Coloque en la incubadora hasta su uso.
   4. Vuelva a suspender 60 l delínea celular en RPMI 1640 a seis veces la densidad final deseada. Vuelva a suspender 60 l de células BMSC en RPMI 1640 a seis veces la densidad final deseada. Mezclar los dos volúmenes juntos en un tubo de 1,5 ml y la etiqueta de "línea celular". Coloque en la incubadora hasta su uso.
   5. Utilizando el software suministrado con la pipeta robótica, cargar el primer archivo de guión ", cell_seedingPt47.PGM". Coloque un cuadro de 200 l punta de pipeta, una placa de microtitulación, y una placa de pocillo estéril 384 en las estaciones A, B y E, respectivamente, de la robot.
   6. Mezclar el contenido de los tubos "pre-mezcla para CD138 +" y "CD138 +". Transferir 1,5 ml de su contenido al pozo # 1 de la placa de microtitulación. Coloque el tubo con volumen restante en el hielo. Inicie el programa. El robot sembrar los primeros 176 pozos (11 más a la izquierda columnas) de la placa de 384 pocillos y luego hacer una pausa. Transferir el restante del tubo en hielo para bien # 2 de la placa de microtitulación. Reanudar el programa. Losrobot sembrar los 144 pozos restantes de la placa de 384 pocillos y pausa.
   7. Mezclar el contenido de los tubos "premezcla para la línea celular" y "línea celular" y transferir contenidos al pozo # 3 de la placa de microtitulación. Reanudar programa. El robot sembrar los 64 pozos restantes de la placa de 384 pocillos.
   8. Coloque la placa de 384 pocillos en centrífuga durante 10 minutos a 500 xg y 4 ° C. Placa de transferencia de incubadora (5% de _CO2, 37 ° C) durante 1 hora para la polimerización de colágeno.
   9. Cargue el segundo archivo de comandos, "media_layer.PGM". Coloque cuadro de punta de la pipeta 120 l, un depósito de reactivo con 31 ml de RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 10% de plasma del paciente y 1% P / S, y la placa de 384 pocillos con células en estaciones A, B y E, respectivamente. Ejecute el programa. El robot transferirá 81 l de medios de comunicación a cada pocillo. Una vez terminado, transferir placa de 384 pocillos a la incubadora y permitir estroma para adherirse al sustrato O / N.
4. Preparación de medicamentos y las drogas de placas (Utilizando una pipeta multicanal manual)
1. Preparar una plantilla similar a la Figura 3 con el fin de facilitar el proceso de adición de fármaco a los pocillos y reducir la probabilidad de confusión.
2. Prepare, en una placa de 96 pocillos, una dilución en serie de cada uno de los fármacos a ensayar en la placa, por ejemplo, para cinco concentraciones utilizando una dilución 3 veces:
   1. Añadir 120 l de drogas a 10 veces la concentración deseada en la concentración más alta también. Por ejemplo, utilice 500 M melfalán si la mayor concentración de las células se expondrán en la placa será de 50 mM.
   2. Añadir 80 l de medio de crecimiento (RPMI suplementado con 10% FBS, 10% de plasma derivado del paciente y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S)) a los cuatro pozos posteriores.
   3. Transferencia de 40 l desde el primer pozo a la segunda y mezclar, con un volumen total de 120 l en un tercio de la concentración del fármaco del primer pozo, o 167 m.
   4. Repita el paso 4.2.3 a los pocillos restantes (por ejemplo, la transferencia de 40 l de segunda a la tercera, mezclar, a continuación, transferir 40 l del tercer al cuarto lugar, etc.).
3. Transferir 8 l de cada fármaco que contiene así al pocillo correspondiente en la placa celular. Cada fármaco que contiene bien debe tener suficiente volumen para 10 pocillos de la placa celular. En el ejemplo de la figura 3, cada concentración de fármaco se añade a 6 pozos diferentes, a excepción de la más alta concentración, que se añade a 8 pozos.
4. Añadir 8 l de medio de crecimiento (RPMI suplementado con 10% FBS, 10% de plasma derivado del paciente y 1% P / S) a los pocillos de control.
5. Coloque las células en el microscopio, tan pronto como listo y encender la incubación de banco.

5. Preparación de drogas y las drogas de placas (Usando una pipeta robótica)

1. Descargar archivos de script para pipeta robótico de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
2. Cargue el guión "media_layer_DRUGPLATE.PGM" en la interfaz de usuario pipeta robótica. Coloque una caja de puntas de pipeta 120 l, depósito con 21 ml de RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB, 10% de plasma del paciente y el 1% P / S y una placa de 384 pocillos vacíos en las estaciones A, B y E, respectivamente. Ejecute el programa, la pipeta robótico agregará 30 l de los medios de comunicación a todos los pocillos de la placa de 384 pocillos.
3. Después de la plantilla a partir de la Figura 2 Suplementario añadir 200 l de fármaco a 20x concentración máxima a cada pocillo de una placa de microtitulación. Esta instalación tiene capacidad para 31 medicamentos. Para el control del pozo (CTRL), añadir RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 10% de plasma del paciente y 1% P / S.
4. Coloque una caja de puntas de pipeta 120 l, placa de microtitulación con drogas a 20X concentración y 384 pocillos con los medios de comunicación (desde el paso 5.1) en las estaciones A, B y C, respectivamente. Cargar el programa "drug_plate.PGM". La pipeta robótica creará una dilución en seriede 1: 3, después de la distribución espacial en el Adicional Figura 1.
5. Coloque una caja de puntas de pipeta 120 l, la placa de 384 pocillos con la dilución del fármaco (desde el paso 5.3) y la placa de 384 pocillos con células (del paso 3.1.9) en las estaciones A, B y C, respectivamente. Cargar y ejecutar el programa "drug_add.PGM". La pipeta robótica transferirá 8 l de fármaco de cada pocillo en la placa de drogas a su contraparte en la placa celular. Una vez terminado, transferir placa celular a la incubadora del microscopio digital tan pronto como sea posible.

6. Imaging de células en la placa

Nota: El siguiente procedimiento se aplica al microscopio Evos Auto FL, pero se puede adaptar fácilmente a otros microscopios etapa motorizados con la incubación de sobremesa o microscopios incubadora embebido.

1. Limpie el interior de la incubadora de sobremesa con una mezcla de etanol-toallita húmeda y retire con cuidado la tapa de la placa, mientras que la colocación de la tapa del incubator.
2. Siga los pasos de software para agregar las balizas. Este es el término utilizado para referirse a puntos de referencia para las regiones de interés, para ser fotografiado, sucesivamente, durante el experimento (consulte la guía de usuario del software para obtener más información).
3. Utilice un objetivo de aumento de 5X o 10X. Asegúrese de que el enfoque es similar a la Figura 2: las células MM aparecen como discos brillantes rodeados por un anillo oscuro y BMSCs o HUVECs son apenas visibles. Algunas células MM primarias son muy pequeñas y por lo tanto un ajuste fino puede ser necesario para encontrar el enfoque óptimo.
4. Ajuste el intervalo de adquisición entre 10 a 30 minutos y la duración de al menos 96 horas. Mientras intervalos más largos entre las adquisiciones son aceptables, intervalos de 45 min o más puede reducir significativamente la precisión de la medición de la viabilidad.
5. Configure el software de modo que las imágenes de cada pocillo se almacenan en archivos independientes nombrados Beacon-1, Beacon-2, etc. Si se utiliza la pipeta robótica, establecer las balizas en el orden representado enAdicional Figura 3.
6. Asegúrese de que haya suficiente agua en el humidificador incubadora y gas, por lo que las células estarán en condiciones óptimas.
7. Al finalizar el experimento, copie las carpetas que contienen las imágenes a la computadora que ejecute el análisis.

7. La cuantificación de la sensibilidad a los fármacos

Nota: Las siguientes instrucciones guían el uso del análisis de imágenes usando un cluster de ordenadores, ya que el análisis de una placa de múltiples pocillos en un ordenador personal es extremadamente lento.

1. Descargar software ImageJ desde la web del NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
2. Descarga guión y plugins en http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
3. Siga las instrucciones en http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf para ejecutar el software de análisis de imagen digital. El resultado debe ser una hoja de cálculo llamado Results.csv que contiene las medidas de viabilidad a intervalos regulares para each pocillo en la placa durante la duración del experimento (es decir, 96 hr).
4. Si se utiliza una pipeta multicanal manual, lleve a cabo los siguientes pasos.
   1. Descargar el archivo http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt y modificarlo para que coincida con el diseño de la placa definido en el paso 3.1 (por ejemplo, la Figura 3).
   2. Descarga el software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar y ejecutarlo utilizando los archivos creados en los pasos 5.3 y 5.4 como parámetro de entrada. El resultado será un informe de nombre de la carpeta que contiene varias hojas de cálculo, cada agrupación de los resultados de un medicamento en particular.
   3. Copiar y pegar el contenido de la plantilla de hoja de cálculo http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Nota: El resultado debe ser gráficas tales como el representado en la figura 4, que representa la quimiosensibilidad de la muestra a diferentes fármacos como una función de la concentración de fármaco y tiempo de exposición.
   </ Ol>
   4. Si se utiliza una pipeta robótica, realice los siguientes pasos.
      1. Descargar archivos de plantilla de Descargar archivos de script para pipeta robótico de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Plantilla Files.zip y extraer los archivos en un directorio.
      2. Modifique el archivo DrugList.csv según la lista de los medicamentos y la más alta concentración de fármaco en la placa con las células. Siga la disposición de Suplementario Figura 2.
      3. Ejecute el programa BuildExperimentalDesign.java pasando como parámetro de la carpeta que contiene los archivos extraídos en el paso 7.5.1 y los archivos Results.csv desde el paso 7.3. El resultado debe ser de dos carpetas nombrar MM1_S y PtSample. El primero contiene una descripción de los pozos (drogas y concentraciones) para el control positivo línea celular. La segunda contiene la misma información, pero con respecto a la parte de la placa sembrada con células del paciente.
      4. Copie el archivo Results.csv en cada uno de los directorios creados en el paso 7.5.3. Descargarel software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar y ejecutarlo utilizando los archivos creados en los pasos 7.5.3 para ambas carpetas. El resultado será un informe de nombre de carpeta en cada una de las carpetas creadas en 7.5.3. La carpeta Informe contiene varias hojas de cálculo, cada agrupación de los resultados de un medicamento en particular.
      5. Ejecute el programa BuildGraphPadFile.java y pasar como parámetro de la carpeta que contiene los archivos extraídos en el paso 7.5.1 y los archivos Results.csv desde el paso 7.3. El resultado será un archivo GraphPad que contiene las curvas de respuesta de dosis para cada uno de los 31 fármacos, y normalizado por el control. Cada carta contiene 5 concentraciones del fármaco para las células MM primarias y una concentración para el control de la línea de células positivas.

Representative Results

El flujo del experimento se describe brevemente en la Figura 1 Si todos los pasos se han completado con éxito, las imágenes obtenidas por el microscopio debe ser equivalente a la Figura 2:. Viven células MM deben verse claramente discos tan brillantes y BMSCs o HUVECs deben ser apenas visible y bien distribuida en el fondo. Como se ve en la Figura 2A, las células MM varían en tamaño de un paciente a otro, pero en general son más pequeños que las líneas celulares. Puesto que prácticamente no se replican ex vivo durante el intervalo del experimento (96 hr) que se puede sembrar en concentraciones más altas (1-3 millones de células / ml). Stroma debe ser apenas detectable, como BMSC se adhieren a la parte inferior del pozo y estiramiento, presentando un perfil bajo. La línea celular de mieloma humano H929 es significativamente mayor que las células MM derivados del paciente (Figura 2B), y se replica dentro de 24 hr. Para evitar el hacinamiento de la imagen, las líneas celulares de MM se vended una menor densidad, 0,3 millones / ml. Figuras 2C y 2D representan células MM derivados del paciente y las líneas celulares de mieloma humano H929, respectivamente, co-cultivadas con HUVECS. HUVECS primero se adhieren a la parte inferior del pozo y luego comenzar a ponerse en contacto entre sí y forman redes, que más tarde se convierten en lúmenes más gruesas y con.

La figura 4 es un ejemplo de lo que es de esperar de los vídeos procesados ​​generados por el algoritmo de análisis de imagen, mostrando detecta células MM vivo pseudo-coloreadas en verde (Figura 4A) sin o con muy poca señal verde en BMSCs y HUVECs al final del experimento en la concentración de fármaco más alta, cuando todas las células MM están muertos (Figura 4B). El software debe agregar los resultados de diferentes pozos y construir un gráfico que representa la pérdida gradual de la viabilidad con el tiempo de exposición a diferentes concentraciones de fármaco (Figura 4C). La curva de respuesta a la dosis de lalínea celular de control (por ejemplo, H929 o MM1.S) debe ser el mismo que para los experimentos anteriores; desviaciones significativas pueden indicar problemas con la solución madre de fármaco utilizado en el experimento.

Es importante observar cuidadosamente todos los pozos sembradas antes de iniciar el proceso de formación de imágenes, como artefactos pueden engañar al software de análisis de imagen y dar lugar a resultados falsos. Por ejemplo, la Figura 5A muestra el resultado de una densidad excesiva de BMSCs en el pozo o demasiado tiempo transcurrido entre la tripsinización y la siembra, lo que lleva a estas células forman grumos. La Figura 5B muestra "colonias" de las células MM. Si las líneas de células se siembran a densidades elevadas, se forman colonias como se replican y esto reduce la exactitud del algoritmo de análisis de imagen digital, ya que se convierte en cada vez más difícil de discernir una célula de la otra. La Figura 5C es un ejemplo de lo contrario, donde Se sembraron demasiado pocas células mm. Tsu a menudo se produce cuando el número de células MM obtenidos a partir de la aspirado de médula ósea está por debajo de 500.000, y el "volumen muerto" izquierda en el tubo antes de re-suspensión se vuelve comparable con el volumen de los medios de comunicación requerida para volver a suspender las células MM en altas densidades . Para resolver este problema, determinar el volumen muerto para el tubo que se utiliza e incluirla en los cálculos de dilución. Figura 5D es un ejemplo de plano focal sesgada. Observe cómo MM células en la parte superior izquierda son brillantes y los que están en la parte inferior derecha son oscuros. Esto es causado por la mañana placa de forma desigual colocado u objetivo incorrectamente colocado. Esto hará que las células MM en diferentes secciones de la imagen a ser contados de manera diferente. Las barras de escala (parte inferior derecha de cada imagen) representan 500 micras.

Figura 1. Protocolo de Descripción general. (A) Durante un marro huesow biopsia se obtiene un tubo extra de aspirado para el protocolo. Células de mieloma múltiple (B) (mm) se separan magnéticamente de otras células en el aspirado. (c) Tres tubos, que contienen las células MM (MM), células no-mm, y plasma, respectivamente, se obtienen a partir del proceso de separación. ósea derivada de células madre mesenquimales (D) del hueso (BMSCs) de aspirados anteriores son co-cultivadas con células MM recién obtenidos, y re-suspendidas en la matriz extracelular (colágeno o membrana basal de la matriz). (E) La placa se centrifugó para asegurar que como muchos MM como sea posible están en el mismo plano focal y el BMSC están listos para adherirse a la parte inferior del pozo. La placa se coloca en la incubadora hasta que la matriz se polimeriza. (F) Cada pocillo se llena con una mezcla de medios de cultivo y plasma derivado del paciente. La placa se colocó en una incubadora O / N. (G) Los fármacos se añaden a cada pocillo y la placa se coloca en un microscopioequipado con una cámara digital, platina motorizada y banco incubadora superior, y fotografiado a intervalos regulares durante un periodo de 96 horas. (H) Los archivos de imagen para cada pocillo se analizan utilizando un algoritmo que viven segmentos células MM basado en el movimiento de la membrana (células vivas se seudo coloreado en verde) y crea una hoja de cálculo con cambios en la celularidad de cada pocillo para cada punto de tiempo. Barra de escala (abajo a la derecha) representa 500 micras. (I) los grupos de un programa de software de los pozos de las drogas y las concentraciones y crea una hoja de cálculo con las curvas de respuesta a la dosis normalizada por lo que las medidas iniciales son 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura apariencia 2. Pre-drogas esperado de pozos. (A) las células MM co-cultivadas con estroma. (B) La línea celular de mieloma humano H929 co-cultivadas con estroma. (C) El paciente derivado de células MM en co-cultivo con HUVECS. Mieloma (D) humano línea celular H929 en co-cultivo con HUVECS. Las barras de escala (parte inferior derecha de cada figura) representan 500 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Recomendaciones distribución espacial de los pozos en una placa de 384 pocillos. Cada placa de 384 pocillos puede llevar a 3 muestras de pacientes con 7 fármacos diferentes, o una muestra de pacientes evaluados con 21 drogas. Wells en verde claro, azul claro y marrón, contienen células MM de tres pacientes diferentes. Rx1, Rx2, etc., representan diversas drogas, cada uno a las cinco con diferentesconcentraciones y por duplicado. Cuatro pocillos se utilizaron como controles para cada paciente (36-39 para el paciente 1, 126-129 para el paciente 2 y 200-203 para el paciente 3). Wells en naranja contienen líneas celulares en la concentración de fármaco más alta de cada fármaco, por duplicado. Wells en amarillo son los controles de líneas celulares (sin drogas). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Ejemplo de análisis digital de imágenes y gráficos de respuesta a la dosis. (A) las células MM en co-cultivo con BMSCs, incrustado en colágeno I, expuesto a una concentración de 50 nM carfilzomib. Algoritmo de análisis de imagen detecta células vivas y pseudo-colores en verde. (B) Las imágenes se adquieren a intervalos regulares durante la duración del experimento. En este concentratien de fármaco, casi todas las células están muertas en el extremo de 96 hr. (C) El gráfico muestra los cambios en el número de células viables durante cinco concentraciones diferentes de carfilzomib a lo largo de un intervalo de 96 horas, normalizado por el tiempo = 0 hr como 100%. La línea celular de mieloma humano MM1.S se utilizó como control para la eficacia del fármaco. Las barras de escala (abajo a la derecha de A y B) representan 500 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Errores comunes mientras que la siembra o de imágenes de placas. (A) células del estroma "enredados". (B) "colonias" de las células MM. Muy pocas células MM (C). (D) sesgada plano focal. Las barras de escala (parte inferior derecha de cada imagen) representan 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Adicional Figura 1. óptima distribución espacial de los pozos en la placa de 384 pocillos usando una pipeta robótica. En esta configuración de 31 medicamentos diferentes se puede probar a 5 concentraciones diferentes y 2 repeticiones (verde). Además, los controles positivos con una línea celular se puede utilizar para garantizar la potencia del fármaco (rosa). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Adicional Figura 2. Distribución espacial de drogas "placa maestra". La pipeta robótico utilizará esta placa que cada pocillo contiene una de las 31 drogas a 20x la concentración, para crear la placa de dilución de drogas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Adicional Figura 3. La numeración de los pozos que se utilizará en la preparación de un plato con una pipeta robótica. El software que se describe en el protocolo requiere esta numeración de los pozos con el fin de asignar adecuadamente los pozos a las drogas y concentraciones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Adicional Figura 4. Comparación entre diapositivas microfluidos (Khin et al., 2014) y el protocolo actual. Respuesta a la dosis de H929 línea celular de mieloma múltiple medido durante 24 horas en el sistema anterior (bortezomib arriba a la izquierda, melfalán izquierda centro) y en el sistema actual ( la parte superior derecha y bortezomib melfalán medio derecho). Para fines de comparación, DL50 a las 24 horas para ambas plataformas fue de 3,9 nM y 4,1 nM para bortezomib, y 6,4 M y 14,65 M de melfalán. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En resumen, este es un método potente rendimiento y alta para cuantificar la quimiosensibilidad de las células MM primarias y farmacodinámica ex vivo de fármacos en una reconstrucción de la médula ósea. Los pasos críticos dentro de este protocolo son la siembra adecuada de los pozos y centrándose adecuada (véase la Figura 2 para los resultados esperados): asegurar que las células estromales MM y se distribuyen de manera uniforme, que las células estromales son adherentes a la parte inferior del pozo, que todos MM las células se encuentran en el mismo plano focal, y que las células de MM tienen el aspecto de un disco brillante rodeado por un anillo oscuro.

En el caso de la siembra inadecuada (véase la Figura 5), no continúe con el experimento, sino más bien sembrar un segundo plato. Si el problema detectado fue MM baja o alta densidad celular o estroma, comprobar la concentración de células en el tubo antes de la siembra y resuspender a intervalos regulares durante el proceso de siembra para asegurar una distribución homogénea de célulasen los medios de comunicación. El uso de una pipeta de múltiples canales con función de repetidor o dispensador robótico puede reducir significativamente este problema. La proporción de célula / matriz para medios de comunicación (1:10) utilizados en este ensayo trató de maximizar el número de pozos que podrían ser sin semillas y por lo tanto, condiciones estudiadas. Sin embargo, para estudiar los factores solubles producidos o consumidos por las células cancerosas o estroma, se recomienda que una proporción de célula / matriz para los medios de comunicación sea 1: 1.

Como implementado actualmente, este sistema cuantifica solamente las células no adherentes. Con el fin de cuantificar los cambios en la celularidad de estroma tendría que ser modificado y ajustado a las características morfológicas de la estroma del software. Esto sería una característica útil para estudiar el efecto de las células cancerosas o fármacos en el compartimiento de estroma. El sistema aquí descrito es también incapaz de cuantificar la celularidad de células cancerosas adheridas, especialmente si se combinan con estroma adherente. La solución sería modificaciones en la imag digitalese algoritmo de análisis para separar el cáncer de estroma basado en características morfológicas, o para pre-incubar bien población con un colorante fluorescente que podría ser utilizado para identificar las células de cualquiera de población.

La importancia de este protocolo en comparación con los enfoques anteriores es la capacidad de evaluar la respuesta al fármaco de las células de cáncer primario en una reconstrucción ex vivo del microambiente de la médula ósea de una manera no destructiva, por lo que las mediciones secuenciales se pueden hacer, proporcionando así mucho más detallada Información de la farmacodinámica, en lugar de en los puntos de tiempo fijos. Una de las limitaciones de nuestro ensayo previo ⁶ fue el gradiente lineal generada por la difusión del fármaco, que sólo permitió la evaluación de sensibilidad a los fármacos dentro de una ventana lineal de concentraciones. El ensayo actual permite la evaluación de la viabilidad a través de cualquier rango de concentraciones de la droga, ya que cada pozo es una entidad separada. Ambos ensayos, sin embargo, generan resultados equivalentes (

Entre las múltiples aplicaciones futuras de este enfoque, nuestro grupo se centra en el uso de modelos matemáticos para extrapolar la información proporcionada por la farmacodinámica estos ensayos en la respuesta clínica. Para lograr este objetivo se propone para adaptarse a los puntos de datos obtenidos (Figura 4C) para cada medicamento a un sistema de ecuaciones diferenciales, que describe la dinámica de la muerte celular inducida por fármacos. Entonces, aplicando a estos modelos matemáticos las propiedades farmacocinéticas conocidas de cada fármaco en un régimen de clínica, sería posible estimar la respuesta real del paciente ^6. Al automatizar la siembra y drogar utilizando un sistema robótico, sería posible poner a prueba no sólo estándar de medicamentos de atención, sino también más de cien fármacos experimentales por muestra (en una placa de 1536 también). Esto abriría la posibilidad de que en silico ensayos clínicos, donde cientos de medicamentos experimentales podrían ser probados encohortes de pacientes muestras, creando así las curvas de supervivencia para los ensayos clínicos virtuales ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system