Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פיגומים מורכבים של סיבי Interfacial polyelectrolyte לשחרור מבוקר באופן זמני של מולקולות ביולוגיות

Published: August 19, 2015 doi: 10.3791/53079
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

Protocol

1. הכנת פתרונות polyelectrolyte

  1. לטהר chitosan, כמפורט בet al ליאו. בקצרה, ליצור 1% (w / v) פתרון של chitosan ב 2% (V / V) מסנן חומצה אצטית וואקום באמצעות נייר סינון הכיתה 93. לנטרל את התסנין באמצעות 5M NaOH עד pH התייצב ל7. צנטריפוגה chitosan זירז ב1,200 XG במשך 10 דקות. למזוג supernatant ולהוסיף מים ללא יונים לשטוף chitosan. חזור על שלב צנטריפוגה ושטיפת פעמיים נוספות. להקפיא את chitosan זירז ב -80 ° C וLyophilize O / N להשיג הצורה המטוהרת. אחסן chitosan המטוהר בממשלה נטולת לחות.
  2. לשקול את 1 גרם של chitosan מטוהר לתוך צלחת תרבית רקמת סטרילי. מניחים את chitosan בצלחת תרבית הרקמה הקרובה ככל האפשר למנורת UV בארון הבטיחות הביולוגית ולחשוף לאור UV במשך 15 דקות. בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם את chitosan המעוקרים לתוך מיכל זכוכית. לפזר chitosan באמצעות מסונן 0.חומצה אצטית 15M לריכוז סופי בין 0.5% לבין 1% (w / v).
  3. לשקול את 0.1 גרם של מלח נתרן של חומצת alginic ומתמוסס במים מזוקקים 10 מיליליטר deionized (DDI) כדי להשיג 1% (w / v) פתרון. מערבבים את מלח נתרן של חומצת alginic לפחות 2 שעות במיקסר המערבולת כדי להבטיח פירוק מלא. סנן את פתרון אלגינט דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. אחסן את פתרון אלגינט על 4 מעלות צלזיוס.
  4. מחדש גורמים אנושיים רקומביננטי צמיחה כגון גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF) או ביתא - גורם גדילה עצבי (NGF), כפי שהומלץ על ידי יצרן.

2. ציור של סיבי IPC

  1. לערבב חלבונים, גורמי צמיחה או מולקולות ביולוגיות אחרות ל10-20 aliquot μl של פתרון polyelectrolyte שיש מטען נטו דומה. מולקולות ביולוגיות עם מטען שלילי (למשל אלבומין בסרום שור [BSA]) נטו צריכה להיות מעורבות עם פתרון אלגינט. מולקולות ביולוגיות עם מטען חיובי נטו (למשל VEGF) צריכים להיות מעורבות עםפתרון chitosan.
  2. הנח aliquots הקטן (10-20 μl) של chitosan ואלגינט על משטח שטוח ויציב שמכוסה parafilm. הטיפות של chitosan ואלגינט צריכה להיות ממוקמות בקרבה אך לא במגע אחד עם השני.
  3. קל לטבול כל טיפ על זוג מלקחיים לטיפי chitosan ואלגינט. להביא את הטיפות של פוליאלקטרוליטים יחד על ידי צובט את המלקחיים. כאשר הטיפות באות במגע זה עם זה, לאט למשוך את המלקחיים אנכי כלפי מעלה לצייר סיבי IPC מהממשק של שתי טיפות (איור 1 א).
  4. בזהירות במקום סוף סיבי IPC צוירו על המלקחיים על אספן, כגון פיגום פולימרים שטוח המודבק על mandrel מסתובב (ראה סעיף 3 ו -4). סובב את mandrel במהירות קבועה של 10 מ"מ / שנייה כדי לאפשר היווצרות של מדים וbeadless סיבי IPC. להגדיל את המהירות של ציור סיבי IPC יהווה חרוזים, דבר שיגרום לשחרור פרץ של התאגדסיום סיבים ביוכימיים ומוקדם. 10
  5. כדי לקבוע את יעילות התאגדות, לאסוף את כל הנוזלים שנותרו נשארו על parafilm על ידי דילול עם 500 μl של פוספט 1X שנאגרו (PBS). מדוד את תוכן גורם חלבון או צמיחה בשאריות באמצעות assay BCA (לBSA), ELISA (לVEGF וNGF) או assay המתאים כדי לזהות biomolecule משולבת.

3. ייצור של Composite Hydrogel פיגום של pullulan-dextran (PD) פוליסכריד וסיבי IPC

  1. בודה מסגרת pullulan ההקרבה לאוסף סיבי IPC
    1. לשקול את פוליסכריד pullulan ולערבב עם מים מזוקקים deionized (DDI) כדי ליצור 20% (w נ /) תמיסה מימית. מערבבים את O / N פתרון pullulan כדי להבטיח אחידות.
    2. יצוק 15 גרם של פתרון pullulan לפוליסטירן תרבית רקמה בקוטר 10 סנטימטרים צלחת (TCPS). ייבש את O פתרון pullulan / N על 37 מעלות צלזיוס. חותך את סרטי pullulan ל7מ"מ x 7 מ"מ מסגרות מרובעות.
  2. הכנת פתרון פוליסכריד pullulan-dextran
    1. צור 30% (w / v) פתרון של סוכרים pullulan וdextran (3: 1 יחס) במי DDI. מערבבים O / N כדי להבטיח אחידות של פתרון פוליסכריד. להוסיף לאט בסודה לשתייה לפתרון פוליסכריד כדי להשיג ריכוז סופי של 20% (w / v). מערבבים O / N כדי להבטיח אחידות של הפתרון. אחסן את פתרון פוליסכריד ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. איסוף סיבי IPC במסגרת pullulan
    1. להדביק את מסגרת הקרבת pullulan (סעיף 3.1) באמצעות קליפ תנין. היצמד קליפ התנין ומסגרת pullulan בסוף mandrel מסתובב באמצעות דבק מצופה פלסטיק. סובב את mandrel עם המסגרת המודבקת במהירות קבועה של 10 מ"מ / sec. מסגרת pullulan יכולה להיות מודבקת על mandrel מסתובב בכיוונים רצויים.
  4. צייר את סיבי IPC באמצעות זוג המלקחיים (סעיף 1) וATTACh הסוף נמשך של סיבי IPC על מסגרת pullulan מסתובבת. צייר את סיבי IPC במהירות קבועה. כשהגיע לסוף המסוף של סיבי IPC, לייבש את O מבנה סיבים-על-מסגרת / N ב RT.
  5. הטבעת סיבי IPC לתוך פיגום הידרוג'ל PD
  6. לcrosslink כל גרם של פתרון pullulan-dextran, להוסיף 100 μl של 11% (w / v) נתרן trimetaphosphate תמיסה מימית ונתרן הידרוקסידי 10M 100 μl. 7 מערבבים את הפתרון ב 60 סל"ד באמצעות stirplate 1 עד 2 דקות. לאחר התוספת של trimetaphosphate נתרן ונתרן הידרוקסידי, הפתרון רב-סוכר יהיה crosslink כמעט מייד. יוצקים את פתרון פוליסכריד צמיג על מבנה סיבים-על-מסגרת להטביע מלא סיבי IPC. דגירה סיבי pullulan-dextran-IPC המשולב (PD-IPC) בשעה 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי ליצור פיגומים כימיים crosslinked מרוכבים (איור 1).
  7. זהירות: בצע צעד 3.3.2 במנדף ולהשתמש שוה מגן המתאימהpment כחומצה אצטית היא מאכל ודליק.
  8. כדי לגרום להיווצרות נקבובית בפיגום PD-IPC, להטביע את כל הפיגום ב -20% (w / v) חומצה אצטית עבור 20 דקות.
  9. הסר ריאגנטים unreacted ידי פיגומי PD-IPC כביסה ב1X PBS במשך 5 דקות בזמן שלוחץ על 100 סל"ד. חזור על פעולה זו 2 פעמים.
  10. הסר את PBS העודף ולהקפיא מייד את פיגומי PD-IPC ב -80 CO ° / N. Lyophilize הפיגומים לפחות 24 שעות לפני שימוש בכל מבחני שחרור או פעילות ביולוגית מבוקרים.

4. ייצור של Composite פיגום של PCL וסיבי IPC

זהירות: dichloromethane היא חומר מסוכן. השתמש במנדף וציוד מגן אישי בעת טיפול dichloromethane.

  1. יצירת מצעי PDMS טהורים ובדוגמת
    1. צור polydimethylsiloxane טהור (PDMS) מצע אלסטומרי באמצעות פיסת TCPS של ממד רצוי באמצעות תהליך ליתוגרפיה רך. צור pattePDMS rned מצעים באמצעות שיטות ליתוגרפי רכות סטנדרטיים בפולי (methacrylate מתיל) תבניות עם הטופוגרפיה הרצויה. 12
  2. בודה מסגרת PCL ההקרבה לאוסף סיבי IPC
    1. לשקול את PCL ולפזר בdichloromethane ליצור 0.9% (w / v) פתרון. לכל סנטימטר 2 אזור 1 של מצע PDMS, שחרר 500 μl של 0.9% פתרון PCL. תאפשר לכל ממס dichloromethane להתאדות באופן מלא במנדף. חזור על תהליך ליהוק PCL 0.9% כדי לעבות את הסרט לעובי הרצוי. הסר את סרט PCL המיובש מהמצע PDMS. ליצור חור במסגרת PCL באמצעות אגרופן מתאים בגודל. 2
  3. איסוף סיבי IPC במסגרת PCL
    1. להדביק את מסגרת הקרבת PCL עם חור (מ4.2.1) בקליפ תנין. היצמד קליפ התנין על mandrel מסתובב באמצעות דבק מצופה פלסטיק. חבר את הקצה נמשך של סיבי IPC על fram PCLדואר לפני שמתחיל את הסיבוב במהירות קבועה של 10 מ"מ / שנייה (סעיף 2). לאחר סיום ציור סיבי IPC, לייבש את C ° O מבנה סיבים במסגרת / N ב 4.
  4. הטבעת סיבים במסגרת לבנות לתוך מצע PCL דוגמת
    1. זרוק 500 μl של 0.9% פתרון PCL על מצע PDMS ליצור בסיס PCL טהור או בדוגמת, כנדרש. יצוק מספר שכבות של 0.9% פתרון PCL להשיג פיגום עם העובי הרצוי. תאפשר לכל ממס dichloromethane להתאדות באופן מלא במנדף.
    2. הנח את מבנה סיבים על-מסגרת (סעיף 4.3.1) על גבי בסיס PCL. להוסיף 0.9% פתרון PCL על מספר רב של פעמים בסיבים במסגרת לבנות כדי לקבל את העובי הרצוי ולהטביע באופן מלא סיבי IPC, בודה פיגום מרוכבים PCL-IPC (איור 1 ג).

5. מדידה של שחרור הסוכנים ביולוגיים מComposite IPC פיגומים

  1. הנח PD-IPC המורכב אופיגומי PCL-IPC ועצמאי סיבי IPC בנפרד בצלחת 24 גם.
  2. לטבול את הפיגום ועצמאי סיבי IPC עם 500 μl של 1X PBS. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס. לאסוף PBS בנקודות זמן שונים (תקשורת שחרור) ולהחליף עם 500 μl של 1X PBS.
  3. למדוד את כמות החלבון או גורם גדילה בתקשורת השחרור באמצעות assay BCA (BSA), ELISA (VEGF וNGF) או assay המתאים אחר כדי לחשב את פרופיל השחרור מצטבר לbiomolecule המשולב.

6. זריעה של תאים על פיגומים IPC Composite כדי לבדוק את הפעילות הביולוגית של גורמים ביולוגיים פורסם

  1. לעקר את הפיגומים מרוכבים lyophilized PD-IPC או PCL-IPC באמצעות אור UV בארון הבטיחות הביולוגי לפחות 20 דקות.
  2. להשתמש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים לקבל השעיה תא של 2 x 10 5 תאים ב200 תקשורת צמיחת μl. זרעי ההשעיה התא המרוכזת על הפיגומים המורכבים. After 20 דקות, למעלה למעלה הנפח של תקשורת צמיחה לצלול באופן מלא את הפיגומים.
  3. למדוד תא פעילות באמצעות טכניקות סטנדרטיים כגון assay חילוף חומרים הכחולים Alamar פעילות, assay תולדת neurite PC12 או immunofluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במאמר זה, אנו מבקשים ליצור פיגומים מורכבים עם סיבי IPC לשחרור המושהה של מולקולות ביולוגיות שונות. מאפיינים של מולקולות ביולוגיות המשמשות במחקר זה נמצאים בטבלה 1. סיבי IPC היו מוטבעים הראשונים להידרוג'ל PD הידרופילי ליצור פיגום מרוכבים PD-IPC (איור 1). מולקולת דגם BSA נבדק ראשון כדי לקבוע את הכדאיות של שימוש פיגום מרוכבים לשחרור biomolecule מבוקרת. BSA שולב פיגומי PD-IPC עם יעילות של 45 ± 0.97%. BSA שוחרר מPD-IPD הראה קינטיקה הקרובה ליניארי עם מהדורה ראשונית מוחלשת פרץ ואחריו מצב יציב במקביל (איור 2). לאחר 2 חודשים, BSA השיג שחרור כולל של 97%. לעומת זאת, סיבי IPC עצמאיים הציגו שחרור מהיר של 80% מBSA בתוך 4 שעות.

בשלב הבא, בדקנו את פרופיל השחרור ופעילות ביולוגית של VEGF באמצעות scaffo PD-IPCLDS. VEGF התאגד עם יעילות של 75.5 ± 2.7%, והראה שחרור מושהה למשך שבוע לפחות 1 (איור 3 א). תאי האנדותל וריד טבור אנושיים (HUVECs) היו זורעים על פיגומי PD-IPC כדי לקבוע את הפעילות הביולוגית של VEGF. HUVECs על פיגומי PD-IPC הראה עלייה משמעותית בהפחתה הכחולה Alamar ופעילות המטבולית בהשוואה לפיגומי PD רגילים ביום 1, המציין שימור טוב של פונקצית VEGF לאחר ששוחרר מפיגומי PD-IPC (איור 3). הפחתה הכחולה Alamar בימים 3, 6 ו -7 ירדה להשגת רמות דומות עם פיגום PD רגיל (איור 3).

הפיגומים מרוכבים PCL-IPC גם נבדקו לשחרור מבוקר והשוואה עם סיבי IPC עצמאיים. אנחנו התאגדו NGF כמולקולת נציג לפיגומים מרוכבים PCL-IPC עם יעילות שילוב של 66.38 ± 2.71%. PCL-IPC פיגומי מרוכבים הראו קושחרור ar מתמשך וכ -80% במצטבר שחרור לאחר 18 ימים (איור 4 א). מצד השני, IPC עצמאי סיבים הראו שחרור פרץ 70% בתוך 24 שעות ואחריו שיעור שחרור עומד. באמצעות assay תולדת neurite PC12, בדקנו את הפעילות הביולוגית של NGF שוחרר (איור 4). התוצאה neurite של תאי PC12 גדלו על תקשורת שחרור פיגום מרוכבים PCL-IPC הראתה רמות דומות עם תאים בתרבית PC12 30 ng / ml NGF בתוספת תקשורת. זה מצביע על כך NGF שוחרר נשאר ביו לפחות 7 ימים.

שילוב של טופוגרפיה ומשלוח גורם צמיחה מתמשכת עלולים לחקות את המיקרו-הסביבה הסלולרית טוב יותר. המתודולוגיה צדדי של ייצור PCL-IPC אפשרה הייצור של biochemically- ופיגום מרוכבים טופוגרפי-מבוקר. אנו מפוברקים פיגום מרוכבים PCL-IPC עם מבנה תיל בגודל ננו (פיגום NP-PCL-IPC). אנו נצפו EF סינרגיסטיfect של טופוגרפיה וספג שחרור NGF ידי הערכת בידול עצבי של תאי גזע mesenchymal האנושיים (hMSCs) (איור 5). hMSCs תרבית על הפיגומים מרוכבים NP-PCL-IPC הראה ביטוי גבוה יותר של חלבון microtubule 2 (MAP2) הקשורים, מעיד על הבחנה עצבית. מצד השני, ביטוי חלבון MAP2 היה נמוך באופן משמעותי בhMSCs תרבית על PCL-IPC עם שחרור NGF בלבד או PCL דוגמת (NP-PCL).

איור 1
איור 1. התאגדות של סיבי IPC לתוך פיגומים הידרופילי והידרופובי. () ציור של סיבי IPC בממשק של באופן חיובי (chitosan) ולרעה פתרונות polyelectrolyte (אלגינט) טעונים. (ב) תרשים סכמטי המציג שילוב של סיבי IPC בפתרון PD הידרופילי ליצור PD-IPC קומפוזיט פיגום דואר. (ג) תרשים סכמטי המציג שילוב של סיבי IPC בפיגום PCL הידרופובי ליצור PCL-IPC פיגום מורכב. נתון זה מותאם Cutiongco et al., 2014 7 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שחרור מבוקר של BSA מPD-IPC פיגום מורכב. BSA שולב פיגומים מרוכבים PD-IPC והשקתו נמדדה בנקודות זמן שונות באמצעות assay BCA. BSA מצטבר שוחרר מסופק כאחוז מהסכום הכולל של ארגון ה- BSA (במיקרוגרם) התאגד בסיבי IPC ומוצגים אחוז הממוצע כ± סטיית תקן. נתון זה מותאם אל Cutiongco et., 2014. 7"Target =" _ /www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
שחרור איור 3. מבוקר ופעילות ביולוגית של VEGF מפיגום מרוכבים PD-IPC. () פרופיל שחרור מצטבר של VEGF מפיגומים מרוכבים PD-IPC. שחרור VEGF נמדד בנקודות זמן שונות באמצעות ספציפי ELISA לVEGF. כדאיות (ב) תא של תאי האנדותל גדלו על פיגומים מרוכבים PD-IPC, כפי שנמדד על ידי assay חילוף חומרים הכחול Alamar. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות כיוון אחד ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Tukey. * מציין p <0.05. נתון זה מותאם אל Cutiongco et., 2014. 7 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4
שחרור איור 4. מבוקר ופעילות ביולוגית של NGF מפיגום מרוכבים PCL-IPC. פרופיל שחרור מצטבר של NGF מפיגומים מרוכבים PCL-IPC (). שחרור NGF נמדד בנקודות זמן שונות באמצעות ספציפי ELISA לNGF. הכנס תערוכות פרופיל מצטבר שחרורו של NGF מפיגום PCL-IPC לשעה 8 הראשונה. (ב) פעילות הביולוגית של NGF כפי שנמדדה על ידי תולדה של תאים עצביים PC12. תולדת PC12 נמדדה באמצעות ניתוח תמונה. נתון זה מותאם Teo et al., 2014 2 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

.jpg "/>
איור 5. התמיינות של hMSC על פיגום NP-PCL-IPC. תמונה מיקרוסקופית סריקת Confocal של hMSC תרבית על פיגומי מרוכבים שונים. () NP-PCL-IPC, (ב) NP-PCL, (ג) PCL-IPC, (ד) פיגומי PCL וטהור. כתם ירוק מציין MAP2, סמן שושלת עצבי. הכתם אדום מציין F- אקטין, המציג את שלד התא הסלולרי. כתם כחול מציין את הגרעין. נתון זה מותאם Teo et al., 2014 2 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1. מאפיינים של הביוכימיה משמשים לשחרור מבוקר מפיגומי IPC מרוכבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סיבי IPC נוצרים על ידי האינטראקציה של שני פוליאלקטרוליטים טעונים הפוך. התהליך מנצל את הפקת המורכבת מהממשק של פוליאלקטרוליטים, הקלת תהליך הרכבה עצמית להיווצרות סיבים יציבה. מנגנון היווצרות סיבי IPC מבטיח כי כל biomolecule הוסיפה לpolyelectrolyte טעון דומה יכול להיות משולב בתהליך complexation. 10,11 לעומת זאת, תוספת של biomolecule לpolyelectrolyte הטעון הפוך תגרום ממטרים מיידיים. המתודולוגיה הייצור הפשוטה לסיבי IPC משאילה צדדיות בשילוב חומרים ביולוגיים שונים, כגון תאים, גורמי גדילה ומולקולות קטנות. תכונה קריטית זה של סיבי IPC נצפתה גם בשני הפיגומים מרוכבים PD-IPC ו- PCL-IPC, שבו גורמי גדילה עם מאפיינים שונים פיזיים וbiomolecular (תשלום ומשקל מולקולרי) שולבו עם יעילות גבוהה. בקונטרהרח, יעילות אנקפסולציה באמצעות מתודולוגיות microsphere לVEGF וNGF יכול להיות נמוך כמו 16% 6 ו -8% 13, בהתאמה.

שני PD-IPC והפיגומים PCL-IPC גם הפגינו שליטה זמנית של שחרור biomolecule. VEGF מפיגומי PD-IPC הראה שחרור יניארי לפחות 7 ימים. לעומת זאת, דיווח על פרופילי שחרור VEGF מmicrospheres פולימרים הראו שחרור פרץ ראשוני בתוך 24 שעות, משחררים לפחות 60% מכלל תוכן VEGF. 5,14,15 באופן דומה, NGF הוצג ספג משלוח גורם גדילה מPCL-IPC פיגומים, בעוד מערכות אספקת גורם גדילה המבוסס על פולימרים אחרות להראות רמה של שחרור מ -20 ימים מיום השחרור. 13,16 יש להניח, רכיבים השונים של הפיגומים מרוכבים שני לתרום לקינטיקה שחרור גורם גדילה. מנגנוני הרפיה פולימר, נקבוביות וtortuosity יכולים להשפיע באופן משמעותי את שחרורו של מולקולות ביולוגיות הידרופילי. 17 בנוסף, גמאפייני hemical של פיגום פולימרים יכולים להיות משיכה ודחייה אלקטרוסטטית כלפי הגורמים המשפיעים על צמיחת שחרור biomolecule. לפיכך, את המאפיינים של פיגום פולימרים הם קריטיים בקביעת פרופילי שחרור ומולקולות ביולוגיות עם שחרור באופן זמני בשליטה. לדוגמא, בעוד שפיגום PD הראה שחרור BSA הקרוב ליניארי, פיגום מרוכבים דומה באמצעות פולי (ויניל אלכוהול) הידרוג'ל חסר חדירות לארגון ה- BSA. 18 פיגומים פולימריים, שניתן להשתמש בשילוב עם סיבי IPC עשוי לדרוש בדיקה ראשונית כדי לקבוע החדירות שלה טווח.

בנוסף לשחרור מבוקר ביוכימי, היכולת לשמר את הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה היא תכונה חשובה לכל מערכת אספקת biomolecule. הסביבה הקשה בסיסית של פתרון PD ואת הנוכחות של ממס אורגני DCM בPCL יש פוטנציאל לפגוע בכל סוג של מולקולות ביולוגיות. לדוגמא, של משלוח microsphereystem שמשמש dichloromethane הראה מגמה של צמצום פעילות ביולוגי עם הגדלת נקודת זמן עקב הפירוק של NGF עקבית. 16 עם זאת, ראתה שהפעילות הביולוגית של VEGF וNGF נשמר, נוסף ומדגישה כי יתרון עיקרי של סיבי IPC נטמע בתוך מרוכבים פיגומים.

השימוש בפוליסכריד ההקרבה, ביולוגית או מסגרת פולימרים שניתן לשלב בקלות לתוך הפיגום בתפזורת נותן צדדיות כדי ליצור פיגום מורכב עם סיבי IPC מרובים מיושרים בתצורות שונות. 7 כך, יש צורך כי הפיגומים פולימריים להיות מיושמים עם סיבי IPC יש את היכולת להטמעה נוספת לפיגום בתפזורת. תהליך ההטמעה הוא חשוב בהטמעה מלאה סיבי IPC לתוך פיגום פולימרים. אנו נצפו תופעה זו בpullulan ההקרבה ומסגרות PCL, שהיו שניהם מומסים בקלות בממס של PD התפזורת אופיגום PCL. יתר על כן, השיטה בשלב היחיד להתאגדות ייצור וbiomolecule IPC נותנת גמישות למספר מולקולות ביולוגיות שיכול להיות מועבר על ידי פיגום מרוכבים יחיד. הפשטות של המתודולוגיה גם מאפשרת כוונון עדין של קינטיקה יעילות התאגדות ושחרור על ידי שינוי זהות polyelectrolyte או ריכוז. פוליאלקטרוליטים הטבעיים chitosan ואלגינט שמשו בשל הצפיפות הגבוהה תשלום ודמיון לפחמימות ECM שונים נמצאות ברקמות של בעלי חיים. גם עדיין קולגן מפוגל ו8,19 terpolymer או כיטין ואלגינט מאי 20 לשמש להיווצרות סיבי IPC להשפעות שונות. סיבי IPC מרובים לשחרר רמזים ביוכימיים שונים עם גם יכולה להיות מושגת קינטיקה שונה כדי ליצור פיגום מרוכבים רב תפקודי. לדוגמא, חלבוני מטריקס כגון פיברונקטין נטענים לתוך סיבי IPC עשויים לספק פלטפורמה להידבקות תא מרחבית מבוקרת. 7 מתמשכיםשחרור של אנטיביוטיקה וגורמי גדילה גם רצוי עבור יישומי התחדשות רקמות. זה עשוי להיות אפשרי באמצעות PCL-IPC, אשר יכול לשלב, תרופות הידרופובי קטנות מולקולה וגורמים הידרופילי, המבוסס על חלבוני צמיחה בתאים שונים של הפיגום המורכב. 2

המתודולוגיה שלנו הציגה גם מותר הייצור של פיגום עם שני רמזים טופוגרפיים וביוכימיים. אנחנו הבחנו שפיגום NP-PCL-IPC השיפור הגבוה ביותר של בידול hMSC לשושלת העצבית, רומז כי מחקה היבטים רבים של הנישה הסלולרית biophysical וביוכימיים מועיל בהכוונת התנהגות תא. הקלות של המתודולוגיה הוצגה מאפשרת היישום שלה למערכות אחרות patternable פולימרים כגון polyacrylamide 21 או פוליאתילן גליקול 22, ובלבד שתהליך crosslinking לא ישפיע על שלמות סיבי IPC באופן משמעותי. לדוגמא, פיגומי PD היו פרקOsen במחקר זה למנגנון crosslinking הייחודי שלה המתרחש בתנאי סביבה ומימיים. 24 זה עלול לספק יותר מבחינה פיזיולוגית מצעים רלוונטיים במבחנה ובמחקרי vivo. בנוסף, הטבעת סיבי IPC בפיגום מרוכבים יכולה להתגבר על חוסר הכוח מכאני של סיבי IPC 23 על ידי מתן חוזק מתיחה. ואכן, PCL 25 נבחר לחוזק המכני הגבוה שלה.

לסיכום, שיטה פשוטה ליצירת פיגומים מרוכבים למסירת biomolecule תוארה. אנחנו הראינו כיצד IPC סיבים יכולים לשמש לאספקה ​​רצופה של מולקולות ביולוגיות מבלי להתפשר על הפעילות הביולוגית שלה ואת יעילות ההתאגדות. הראינו את זה על ידי יצירת פיגומים מורכבים עם שתי וריאציות: PD-IPC ופיגומי PCL-IPC. תחולה של סיבי IPC אינה מוגבלת להתאגדות בPD- ופיגומים מבוססי PCL, אבל עלול להתארך עד מערכות פולימרים אחרותוכדי לספק מולקולות ביולוגיות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הלאומית סינגפור מנוהלת על ידי אחד ממרכזי המחקר שלה למצוינות, Mechanobiology המכון, סינגפור. MFAC נתמך על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (סינגפור) והסוכנות הלאומית למחקר (צרפת) התכנית משותפת במסגרת פרויקט מספר 1122703037. BKKT נתמכת על ידי מכון Mechanobiology. אנו מודים למר דניאל HC וונג לכתב היד והגב 'שחר JH ניאו לסיוע בהפקת וידאו קריאת הוכחה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pullulan  Hayashibara Inc Okayama Japan Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds.
Dextran Sigma Aldrich D1037 MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds.
Sodium Bicarbonate  Sigma Aldrich S5761 Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. 
Sodium Trimetaphosphate Sigma Aldrich T5508 This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh.
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S5881 This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves.
Chitosan Sigma Aldrich 448877 MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers.
Acetic Acid Merck This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. 
Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity Sigma Aldrich A2158 Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C.
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. 
BCA assay kit Pierce 23225 This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. 
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor R&D systems 293-VE Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml.
Heparin Sodium Salt From Porcine Sigma Aldrich H3393 This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. 
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Lonza C2517A This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. 
Alamar blue Life Technologies DAL1025 This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. 
ScanVac Coolsafe Lyophilizer Labogene 7.001.200.060 This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers.
Polycaprolactone (PCL) Sigma Aldrich 181609 MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105.
Dichloromethane Sigma Aldrich V800151 This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical.
Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) Dow Corning (240)4019862 The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS.
Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) R&D systems 256-GF Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg⁠/⁠ml. Aliquot and store in -20 °C until use.
Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) Cambrex This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography.
Rat PC12 Pheochromocytoma Cells  ATCC This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells.
Grade 93 filter paper Whatman Z699675 This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7.
Swing bucket centrifuge Eppendorf 5810R To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed.
Motor with mandrel rotating at constant speed Rhymebus RM5E The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame.
Phosphate buffered saline FirstBase Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. 
10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) Greiner The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. 
Human VEGF ELISA kit R&D systems DVE00 The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium.
Human NGF ELISA kit R&D systems DY256 The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium.
Plastic Coated Adhesive Tape Bel-Art 9040336 The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  2. Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
  3. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  4. Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
  5. Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  6. King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
  7. Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
  8. Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
  9. Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
  10. Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
  11. Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
  12. Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
  13. Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
  14. Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
  15. Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
  16. Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
  17. Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
  18. Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
  19. Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
  20. Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
  21. Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
  22. Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
  23. Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
  24. Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
  25. Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 102 פיגום מורכב פולימרים הידרוג'ל הביוכימיה אנקפסולציה מרחב בזמן שחרור מושהה טופוגרפיה
פיגומים מורכבים של סיבי Interfacial polyelectrolyte לשחרור מבוקר באופן זמני של מולקולות ביולוגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cutiongco, M. F. A., Teo, B. K. K.,… More

Cutiongco, M. F. A., Teo, B. K. K., Yim, E. K. F. Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules. J. Vis. Exp. (102), e53079, doi:10.3791/53079 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter