Protocol
1. Voorbereiding van de Polyelectrolyte Solutions
- Zuiver chitosan, zoals beschreven in Liao et al. Kortom, maak een 1% (w / v) oplossing van chitosan in 2% (v / v) azijnzuur en vacuum filter met rang 93 filtreerpapier. Neutraliseer het filtraat bij gebruik van 5M NaOH tot de pH gestabiliseerd 7. Centrifugeer de geprecipiteerde chitosan bij 1200 xg gedurende 10 min. Decanteer het supernatant en voeg gedeïoniseerd water aan de chitosan wassen. Herhaal de wasstap centrifugeren en twee keer. Bevries de geprecipiteerde chitosan bij -80 ° C en Lyophilize O / N om het gezuiverde vorm te verkrijgen. Bewaar gezuiverd chitosan in een ontvochtigde kast.
- Weeg 1 g gezuiverd chitosan in een steriele weefselkweek schotel. Plaats het chitosan in de weefselkweekplaat zo dicht mogelijk bij de UV-lamp in de bioveiligheidskast en blootstellen aan UV licht gedurende 15 minuten. Met behulp van een steriel pincet, plaatst de gesteriliseerde chitosan in een glazen container. Los chitosan gebruikmaking gefiltreerd 0.15M azijnzuur tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% en 1% (w / v).
- Weeg 0,1 g van alginezuur natriumzout en los op in 10 ml gedestilleerd gedeïoniseerd (DDI) water tot een 1% (w / v) oplossing. Meng het alginezuur natriumzout minstens 2 uur op de vortex menger om volledige oplossing te verzekeren. Filter de alginaatoplossing door middel van 0,2 um spuitfilter. Bewaar de alginaat oplossing bij 4 ° C.
- Reconstitueer humaan recombinant groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) of beta - nerve growth factor (NGF), zoals aanbevolen door de fabrikant.
2. Tekening van IPC Fibers
- Meng eiwitten, groeifactoren of andere biomoleculen in 10-20 pi aliquot van het polyelektrolyt oplossing die een vergelijkbare netto lading heeft. Biologische moleculen met een netto negatieve lading (bijvoorbeeld runderserumalbumine [BSA]) moet worden gemengd met alginaat oplossing. Biologische moleculen met een netto positieve lading (bijvoorbeeld VEGF) moet worden gemengd metchitosan oplossing.
- Plaats kleine hoeveelheden (10-20 pl) van chitosan en alginaat op een stabiele vlakke ondergrond, dat is bedekt met parafilm. De druppels van chitosan en alginaat moet dicht worden geplaatst zonder in contact met elkaar.
- Licht dip elke tip over een pincet in de chitosan en alginaat druppels. Breng de druppels polyelektrolieten elkaar door te knijpen de tang. Wanneer de druppels in contact komen met elkaar, trek de tang verticaal omhoog naar de IPC vezel te trekken uit het grensvlak van de twee druppeltjes (figuur 1A).
- Plaats het einde van de getekende IPC fiber op de tang op een collector, zorgvuldig zoals een platte polymere steiger aangebracht op een roterende doorn (zie hoofdstuk 3 en 4). Draai de doorn met een vaste snelheid van 10 mm / sec tot de vorming van uniforme en beadless IPC vezels mogelijk. Het verhogen van de snelheid van het trekken van de IPC vezels korrels ontstaan die een stootafgifte van geïncorporeerde veroorzakenbiochemische en voortijdige beëindiging vezels. 10
- Om opnamedoelmatigheid bepalen verzamel alle resterende vloeistof links op de parafilm door verdunning met 500 pi 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Meet het eiwit of groeifactor inhoud van het residu door middel van BCA assay (BSA), ELISA (voor VEGF en NGF) of een geschikte test te detecteren biomolecuul opgenomen.
3. Fabricage van Composite Hydrogel Steiger van Pullulan-Dextran (PD) Polysaccharide en IPC Fibers
- Fabriceren offer pullulan frame voor IPC fiber collectie
- Weeg pullulan polysaccharide en meng met gedestilleerd gedeïoniseerd (DDI) water tot een 20% te maken (w / v) waterige oplossing. Meng de pullulanoplossing O / N om homogeniteit te garanderen.
- Cast 15 g pullulan oplossing in een diameter van 10 cm weefselkweek polystyreen (TCPS) schotel. Droog de oplossing pullulan O / N bij 37 ° C. Snijd de pullulan films in 7mm x 7 mm vierkante frames.
- Voorbereiding pullulan-dextran polysaccharide oplossing
- Een 30% (w / v) oplossing van de polysachariden pullulan en dextran (3: 1 verhouding) in DDI water. Mix O / N om de homogeniteit van de polysacharideoplossing waarborgen. Voeg langzaam in natriumbicarbonaat met de polysaccharide oplossing tot een eindconcentratie van 20% te bereiken (gew / v). Mix O / N om de homogeniteit van de oplossing te waarborgen. Bewaar de oplossing polysaccharide bij 4 ° C.
- Verzamelen IPC vezels op pullulan kader
- Bevestig de opofferende pullulan frame (paragraaf 3.1) met behulp van een alligator clip. Plak de krokodillenklem en pullulan frame op het uiteinde van de roterende doorn met behulp van kunststof bekleed plakband. Draai de doorn met de aangebrachte frame een constante snelheid van 10 mm / sec. Het pullulan frame kan worden bevestigd op de roterende mandrel in de gewenste richtingen.
- Teken de IPC vezels met behulp van een pincet (deel 1) en ATTACh het getekende einde van de IPC vezels op de draaiende pullulan frame. Trek de IPC vezels met een constante snelheid. Bij het bereiken van het uiteinde van de IPC vezel, droog de vezels-on-construct O / N bij kamertemperatuur.
- Inbedding IPC vezels in PD hydrogel scaffold
- Voor elke gram van pullulan-dextran oplossing verknopen, voeg 100 pl 11% (w / v) natriumtrimetafosfaat oplossing en 100 ui 10 M natriumhydroxide. 7 Roer de oplossing bij 60 opm met een stirplate gedurende 1 tot 2 minuten. Na toevoeging van natriumtrimetafosfaat en natriumhydroxide, de polysacharideoplossing vrijwel onmiddellijk verknopen. Giet de viskeuze polysaccharide oplossing op de vezels construct-on-frame volledige verankering IPC vezels. Incubeer de gecombineerde pullulan-dextran-IPC vezels (PD-IPC) bij 60 ° C gedurende 30 min een chemisch verknoopte samenstelling scaffolds (figuur 1B) te vormen.
- LET OP: Voer stap 3.3.2 in de zuurkast en het gebruik van de juiste beschermende equipment azijnzuur is een bijtend en brandbaar.
- Om porievorming in de PD-IPC scaffold induceren, onderdompelen gehele steiger 20% (w / v) azijnzuur gedurende 20 min.
- Verwijder ongereageerde reagens door wassen PD-IPC steigers in 1X PBS gedurende 5 minuten onder schudden bij 100 rpm. Herhaal deze stap 2 keer.
- Verwijder de overtollige PBS en de PD-IPC steigers onmiddellijk te bevriezen bij -80 ° CO / N. Lyofiliseren de steigers ten minste 24 uur voor gebruik in een gecontroleerde afgifte of biologische assays.
4. Fabricage van Composite Steiger van PCL en IPC Fibers
LET OP: Dichloormethaan is een gevaarlijk materiaal. Gebruik de zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van dichloormethaan.
- Het creëren van ongerepte en gedessineerde PDMS substraten
- Maak een ongerepte polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer substraat met behulp van een stuk TCPS van gewenste afmeting met behulp van zachte lithografie proces. Maak patterned PDMS substraten door standaard zachte lithografische werkwijzen voor poly (methylmethacrylaat) sjablonen met de gewenste topografie. 12
- Fabriceren offer PCL frame voor IPC fiber collectie
- Weeg PCL en los op in dichloormethaan om 0,9% te maken (w / v) oplossing. Voor elke 1 cm 2 oppervlakte van de PDMS substraat dalen 500 pl 0,9% PCL oplossing. Laat al het dichloormethaan oplosmiddel volledig verdampen in de zuurkast. Herhaal het proces van het gieten van 0,9% PCL de film dikker tot de gewenste dikte. Verwijder de gedroogde film van de PCL PDMS substraat. Maak een gat in de PCL-frame met behulp van een geschikt-sized puncher. 2
- Verzamelen IPC vezels op de PCL kader
- Bevestig de opofferende PCL frame met gat (van 4.2.1) op een alligator clip. Plak de alligator clip op de draaiende doorn door het gebruik van kunststof gecoate plakband. Bevestig de getekende einde van de IPC vezels op de PCL Frame voordat u de rotatie bij een constante snelheid van 10 mm / sec (deel 2). Na afloop van IPC vezeltrekken, droog de fiber-on-construct O / N bij 4 ° C.
- Inbedding fiber-on frame construct in een patroon PCL substraat
- Drop 500 pl 0,9% PCL oplossing op het substraat PDMS een ongerept of gepatroneerde PCL base maken, zoals vereist. Gegoten meerdere lagen 0,9% PCL oplossing van een scaffold met de gewenste dikte te verkrijgen. Laat al het dichloormethaan oplosmiddel volledig verdampen in de zuurkast.
- Plaats de fiber-on-construct (sectie 4.3.1) bovenop de PCL base. Voeg 0,9% PCL oplossing op de fiber-on-construct meerdere malen om de gewenste dikte te krijgen en volledige verankering IPC vezels, het vervaardigen van een PCL-IPC composiet scaffold (figuur 1C).
5. Meting van het vrijkomen van biologische agentia uit Composite IPC Steigers
- Plaats composiet PD-IPC ofPCL-IPC steigers en stand-alone IPC vezels afzonderlijk in een 24-wells plaat.
- Dompel het schavot en stand-alone IPC vezels met 500 pi 1X PBS. Incubeer de monsters bij 37 ° C. Verzamel PBS op verschillende tijdstippen (afgiftemedia) en vervangen door 500 pi 1X PBS.
- Meet de hoeveelheid eiwit of groeifactor in afgiftemedia met een BCA assay (BSA), ELISA (VEGF en NGF) of andere geschikte test voor het cumulatieve afgifteprofiel van de opgenomen biomolecuul berekenen.
6. Het zaaien van cellen op Composite IPC Steigers op Test bioactiviteit van Uitgebracht biologische agentia
- Steriliseer de gevriesdroogde PD-IPC of PCL-IPC composiet scaffolds met UV licht in de biologische veiligheidskast ten minste 20 min.
- Gebruik standaard celkweek technieken om een celsuspensie van 2 x 10 5 cellen te verkrijgen in 200 gl kweekmedium. Seed de geconcentreerde celsuspensie op de composiet steigers. After 20 min, top-up van het volume van de groei media om volledig onderdompelen de steigers.
- Meet cel activiteit door middel van standaard technieken zoals Alamar blauw metabolische activiteit test, PC12 neurietuitgroei assay of immunofluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel hebben we geprobeerd om composiet steigers met IPC vezels voor de langdurige afgifte van verschillende biomoleculen te creëren. Kenmerken van de biomoleculen die in deze studie worden in Tabel 1. IPC vezels werden eerst ingebed in een hydrofiel PD hydrogel een PD-IPC composiet scaffold (Figuur 1B) maken. Model molecule BSA werd eerst getest om de haalbaarheid van het gebruik van een samengestelde matrix voor gecontroleerde afgifte biomolecuul bepalen. BSA werd opgenomen in PD-IPC steigers met een rendement van 45 ± 0,97%. BSA afgegeven uit de PD-IPD vertoonden bijna lineaire kinetiek met een eerste verzwakte stootafgifte gevolgd door een gelijktijdige statische toestand (figuur 2). Na 2 maanden, BSA behaalde een totale uitstoot van 97%. Daarentegen standalone IPC vezels vertoonden een snelle afgifte van 80% BSA in 4 uur.
Vervolgens hebben we het afgifteprofiel en de biologische activiteit van VEGF gecontroleerd met PD-IPC scaffolds. VEGF werd gecreëerd met een rendement van 75,5 ± 2,7%, en vertoonde een langdurige afgifte gedurende ten minste 1 week (figuur 3A). Humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) werden gezaaid op de PD-IPC scaffolds de bio-activiteit van VEGF te bepalen. HUVECs op de PD-IPC scaffolds vertoonden een significante toename Alamar blue reductie en metabolische activiteit in vergelijking met gewoon PD steigers op dag 1, wat aangeeft goede conservering van VEGF functie na vrijkomen uit PD-IPC scaffolds (Figuur 3B). Alamar blue reductie op dag 3, 6 en 7 gedaald tot niveaus vergelijkbaar met gewone PD scaffold (figuur 3B) te bereiken.
De PCL-IPC composiet scaffolds werden ook onderzocht op gecontroleerde afgifte en dan stand-alone IPC vezels. We opgenomen NGF als vertegenwoordiger molecuul in de PCL-IPC composiet steigers met een incorporatie rendement van 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC composiet steigers toonde lijnar vertraagde afgifte en circa 80% cumulatieve afgifte na 18 dagen (Figuur 4A). Anderzijds, IPC stand-alone vezel vertoonde een 70% stootafgifte binnen 24 uur gevolgd door een stagnerende afgiftesnelheid. Met behulp van een PC12 neuriet uitgroei assay, onderzochten we de biologische activiteit van de vrijgemaakte NGF (figuur 4B). De neurietuitgroei van PC12 cellen gekweekt op PCL-IPC composiet steiger vrijlating media toonden een vergelijkbaar niveau met PC12 cellen gekweekt in 30 ng / ml NGF aangevuld media. Dit geeft aan dat het afgegeven bioactieve NGF bleef gedurende ten minste 7 dagen.
Combinatie van topografie en aanhoudende groeifactor levering kan de cellulaire micro beter na te bootsen. De veelzijdige methodologie van PCL-IPC fabricage mag de fabricage van een biochemically- en topografisch-gecontroleerde samengestelde schavot. We verzonnen een PCL-IPC composiet steiger met nano-sized roosters structuur (NP-PCL-IPC steiger). We zagen de synergetische effect topografie en aanhoudende afgifte van NGF beoordelen neuronale differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) (figuur 5). hMSCs gekweekt op de NP-PCL-IPC composiet scaffolds vertoonden hogere expressie van het microtubule geassocieerd proteïne 2 (MAP2), indicatief voor neuronale differentiatie. Anderzijds, MAP2 eiwitexpressie was aanzienlijk lager in hMSCs gekweekt op PCL-IPC slechts NGF afgifte of gepatroneerde PCL (NP-PCL).
Figuur 1. Opname van IPC vezels in hydrofiele en hydrofobe scaffolds. (A) Tekening van IPC vezels op het snijvlak van positieve (chitosan) en negatief (alginaat) geladen polyelektrolyt oplossingen. (B) Schematische weergave incorporatie van IPC vezels in hydrofiele PD-oplossing voor PD-IPC composiet creëren e schavot. (C) Schematische weergave incorporatie van IPC vezels in hydrofobe PCL steiger op PCL-IPC maken composiet schavot. Dit cijfer is aangepast van Cutiongco et al., 2014 7 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. gecontroleerde afgifte van BSA uit PD-IPC composiet scaffold. BSA werd opgenomen in PD-IPC composiet scaffolds en afgifte werd gemeten op verschillende tijdstippen via BCA assay. Cumulatieve BSA vrijgegeven wordt verschaft als een percentage van de totale hoeveelheid BSA (in mg) opgenomen in het IPC vezels en die als gemiddelde percentage ± standaardafwijking. Dit cijfer is aangepast van Cutiongco et al., 2014 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. gecontroleerde afgifte en de bioactiviteit van VEGF van PD-IPC composiet schavot. (A) Cumulatieve afgifteprofiel van VEGF van PD-IPC composiet steigers. VEGF afgifte werd gemeten op verschillende tijdstippen via ELISA die specifiek is voor VEGF. (B) Levensvatbaarheid van de cellen van endotheelcellen gekweekt op PD-IPC composiet scaffolds, zoals gemeten door Alamar blue assay metabolische. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA met Tukey post-hoc-test. * Geeft p <0,05. Dit cijfer is aangepast van Cutiongco et al., 2014 7 Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Figuur 4. gecontroleerde afgifte en de bioactiviteit van NGF uit PCL-IPC composiet schavot. (A) Cumulatieve afgifteprofiel van NGF uit PCL-IPC composiet steigers. NGF afgifte werd gemeten op verschillende tijdstippen via ELISA specifiek voor NGF. Insert toont cumulatieve afgifteprofiel van NGF uit PCL-IPC matrix voor de eerste 8 uur. (B) Biologische activiteit van NGF zoals gemeten door uitgroei van PC12 neurale cellen. PC12 uitgroei werd gemeten door middel van beeldanalyse. Dit cijfer is aangepast van Teo et al., 2014 2 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
.jpg "/>
Confocale scanning microscopie beeld van hMSC Figuur 5. Differentiatie van hMSC over NP-PCL-IPC schavot. Gekweekt op verschillende composiet steigers. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) Oorspronkelijk PCL scaffolds. Groene vlek geeft MAP2, een neuronale afstamming marker. Rode vlek geeft F-actine, die de cellulaire cytoskelet. Blauwkleuring geeft de kern. Dit cijfer is aangepast van Teo et al., 2014 2 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Kenmerken van biochemicaliën gebruikt voor gecontroleerde afgifte van composiet IPC steigers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPC vezels worden gevormd door de wisselwerking van twee tegengesteld geladen polyelektrolyten. De werkwijze maakt gebruik van de extractie van het complex van het grensvlak van de polyelektrolyten, een zelf-assemblageproces voor stabiele vezelvorming vergemakkelijken. Het mechanisme van IPC vezelvorming voor zorgt dat biomolecuul toegevoegd aan een even geladen polyelektrolyt tijdens de complexvorming te kunnen integreren. 10,11 Omgekeerd toevoeging van een biologische molecule in de tegengesteld geladen poly-elektrolyt leidt tot onmiddellijke precipitatie. De eenvoudige fabricage methode voor IPC vezels leent veelzijdigheid waarin verschillende biologische materialen zoals cellen, groeifactoren en kleine moleculen. Deze kritische eigenschap van IPC vezels werd ook waargenomen in zowel de PD-IPC en PCL-IPC composiet steigers, waarbij groeifactoren met verschillende fysische en biomoleculaire eigenschappen (lading en molecuulgewicht) werden opgenomen met een hoge efficiëntie. In contrast, inkapselingsefficiëntie gebruik microsfeer methoden voor VEGF en NGF kan zo laag als 16% en 6% 8 13 resp.
Beide PD-IPC en PCL-IPC steigers toonde ook tijdelijke controle van biomolecuul release. VEGF van PD-IPC steigers toonde lineaire release voor minstens 7 dagen. Daarentegen rapporteerde VEGF afgifteprofielen van polymere microsferen vertoonden een aanvankelijke burst afgifte binnen 24 uur, het vrijgeven van ten minste 60% van het totale VEGF gehalte. 5,14,15 Evenzo NGF bleek growth factor delivery te hebben geleden van PCL-IPC steigers, terwijl andere op polymeerbasis growth factor afgiftesystemen tonen een plateau van vrijgave van 20 dagen na het uitbrengen. 13,16 Vermoedelijk de verschillende onderdelen van de samengestelde scaffolds beide bijdragen tot groeifactor vrijgavekinetiek. Polymer relaxatiemechanismen kunnen porositeit en kronkeling van grote invloed op de afgifte van hydrofiele biomoleculen. 17 Bovendien is de cCHEMISCHE kenmerken van de polymere steiger kan elektrostatische aantrekking en afstoting in de richting van de groeifactoren die biomolecuul vrijlating invloed hebben. Aldus, de karakteristieken van de polymère scaffold zijn kritisch bij het bepalen afgifteprofielen en biomoleculen tijdelijk met gecontroleerde afgifte. Bijvoorbeeld, terwijl de PD scaffold bleek nagenoeg lineair BSA afgifte, een vergelijkbaar gecombineerde scaffold behulp van poly (vinyl alcohol) hydrogel ontbrak permeabiliteit voor BSA. 18 Polymere scaffolds die kunnen worden gebruikt in combinatie met IPC vezels voorafgaand getest om haar doorlatendheid range.
Naast gereguleerde biochemische afgifte, het vermogen om de biologische activiteit van groeifactoren handhaven is een belangrijk kenmerk voor een biomolecule afgiftesysteem. De harde alkalisch milieu van de PD oplossing en de aanwezigheid van organische oplosmiddelen in DCM PCL hebben het potentieel om elke vorm van biomoleculen degraderen. Bijvoorbeeld, microbolletjes levering system dat dichloormethaan gebruikt liet een consistente trend van afnemende bioactiviteit met toenemende tijdstip door de afbraak van NGF. 16 echter waargenomen dat de bioactiviteit van VEGF en NGF wordt gehandhaafd, voorts herhaald dat een belangrijk voordeel van IPC vezels worden opgenomen in het samengestelde steigers.
Het gebruik van een op te offeren, biocompatibele polymeer of polysaccharide kader dat gemakkelijk kan worden opgenomen in de bulk scaffold geeft de veelzijdigheid van een composiet scaffold met meerdere IPC vezels uitgelijnd in verschillende configuraties. 7 Het is dus noodzakelijk dat de polymere scaffolds te passen IPC vezels hebben het vermogen tot verdere assimilatie in een bulk scaffold. Het assimilatieproces is belangrijk in volledig inbedden IPC vezels in het polymere skelet. We namen dit verschijnsel in het offer pullulan en PCL frames, die beide gemakkelijk opgelost in het oplosmiddel van de bulk of PDPCL schavot. Bovendien is de eenstaps werkwijze voor IPC fabricage en biomolecuul opname geeft flexibiliteit om het aantal biomoleculen die een enkel samengesteld scaffold kan worden geleverd. De eenvoud van de werkwijze maakt het ook fine-tuning van het opnamedoelmatigheid en afgifte kinetica door het veranderen polyelektrolyt identiteit of concentratie. De natuurlijke polyelectrolyten chitosan en alginaat gebruikt vanwege zijn hoge ladingsdichtheid en gelijkenis met verschillende ECM koolhydraten in dierlijk weefsel. Nog gemethyleerd collageen en terpolymeer 8,19 of chitine en alginaat mei 20 ook worden gebruikt voor IPC vezelvorming in verschillende effecten. Meerdere IPC vezels vrijkomen verschillende biochemische signalen met verschillende kinetica kan worden bereikt om een multifunctioneel composiet scaffold maken. Bijvoorbeeld kan extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine in IPC vezels geladen als platform voor ruimtelijk gecontroleerde celadhesie. 7 Sustainedafgifte van antibiotica en groeifactoren zijn ook gewenst voor weefselregeneratie toepassingen. Dit kan mogelijk zijn door het gebruik van PCL-IPC, die hydrofoob, kleine molecule drugs en hydrofiele, op basis van eiwitten groeifactoren in verschillende compartimenten van de samengestelde steiger kan nemen. 2
De gepresenteerde methode ook toegestaan de vervaardiging van een steiger met zowel topografische en biochemische signalen. We observeerden dat het NP-PCL-IPC scaffold had de hoogste verhoging van hMSC differentiatie in de neuronale oorsprong, wat impliceert dat nabootsen meerdere aspecten van de biofysische en biochemische cellulaire niche voordelig bij het sturen celgedrag. Het gemak van de gepresenteerde methode maakt toepassing ervan op andere patternable polymeersystemen zoals polyacrylamide of polyethyleenglycol 21 22, op voorwaarde dat de verknopingswerkwijze IPC vezel integriteit niet significant zullen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, PD scaffolds werden chosen in deze studie zijn unieke verknoping mechanisme dat optreedt bij omgevings- en 24 waterige omstandigheden. Dit kan potentieel leiden tot meer fysiologisch relevante substraten voor in vitro en in vivo studies. Bovendien insluiten IPC vezels in een samengesteld scaffold kan het gebrek aan mechanische sterkte van IPC vezels 23 weggenomen door treksterkte. Inderdaad, PCL 25 werd gekozen vanwege de hoge mechanische sterkte.
Kortom, een eenvoudige methode om composiet draagstructuren voor biomolecule afgifte beschreven. We zien hoe IPC vezels kunnen worden gebruikt voor langdurige afgifte van biomoleculen zonder zijn biologische activiteit en opnamedoelmatigheid. We toonden dit door het creëren van samengestelde steigers met twee varianten: PD-IPC en PCL-IPC steigers. Toepasbaarheid van IPC vezels is niet beperkt tot opname in PD en PCL-gebaseerde scaffolds, maar kan eventueel worden uitgebreid tot andere polymeersystemenen andere biomoleculen te leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Singapore National Research Foundation door een van haar Research Centers of Excellence, de Mechanobiology Institute, Singapore toegediend. MFAC wordt ondersteund door het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (Singapore) en Nationaal Agentschap voor Onderzoek (Frankrijk) gezamenlijk programma onder project nummer 1122703037. BKKT wordt ondersteund door het Mechanobiology Institute. We danken de heer Daniel HC Wong-proof te lezen het manuscript en mevrouw Dawn JH Neo voor het assisteren in de video productie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
