Protocol
1. Fremstilling av polyelektrolytt Solutions
- Rens kitosan, som beskrevet i Liao et al. Korthet skape en 1% (w / v) løsning av chitosan i 2% (v / v) eddiksyre og vakuum-filter ved bruk av klasse 93 filterpapir. Nøytraliserer filtratet ved hjelp av 5 M NaOH inntil pH stabiliserte seg til 7. Sentrifuger utfelte chitosan ved 1200 xg i 10 min. Dekanter supernatanten og legge til avionisert vann for å vaske kitosan. Gjenta sentrifugeringen og vasketrinnet to ganger til. Fryse det utfelte chitosan ved -80 ° C og Lyofiliser O / N for å oppnå den rene formen. Lagre renset kitosan i en avfuktes skap.
- Vei ut 1 g renset kitosan i en steril vevskulturskål. Plasser kitosan i vevskulturskål så nær som mulig til UV-lampen i den biologiske sikkerhetskabinett og utsettes for UV-lys i 15 min. Ved hjelp av steril pinsett, plassere sterilisert kitosan i en glassbeholder. Oppløse kitosan ved hjelp filtrert 0.15M eddiksyre til en endelig konsentrasjon på mellom 0,5% og 1% (w / v).
- Vei opp 0,1 g av alginsyre og natriumsalt oppløses i 10 ml destillert deionisert (DDI) vann for å oppnå en 1% (w / v) løsning. Bland alginsyre natriumsalt i minst 2 timer på vortex-blander for å sikre fullstendig oppløsning. Filtrer alginatoppløsning gjennom 0,2 mikrometer sprøyte filter. Oppbevar alginatoppløsning ved 4 ° C.
- Rekonstituer humane rekombinante vekstfaktorer så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), eller beta - nervevekstfaktor (NGF), som anbefalt av produsenten.
2. Tegning av IPC Fibers
- Bland-proteiner, vekstfaktorer eller andre biomolekyler i 10-20 pl alikvot av polyelektrolytt løsning som har en lignende nettoladning. Biologiske molekyler med netto negativ ladning (f.eks bovint serumalbumin [BSA]) bør blandes med alginatoppløsning. Biologiske molekyler med netto positiv ladning (f.eks VEGF) bør blandes medkitosan løsning.
- Plasser små aliquoter (10-20 pl) av kitosan og alginat på en stabil flat overflate som er dekket med parafilm. De små dråper av kitosan og alginat skal plasseres i umiddelbar nærhet, men ikke i kontakt med hverandre.
- Lett dyppe hver spiss på en pinsett inn i kitosan og alginat dråper. Ta med dråper av polyelektrolytter sammen ved å knipe tang. Når dråpene kommer i kontakt med hverandre, drar det sakte tang vertikalt oppover for å trekke koblingsapparatet fiber fra grenseflaten av de to dråpene (figur 1A).
- Forsiktig enden av den trukne fiber på IPC tang på en samler, for eksempel en flat polymer stillas som er festet på en roterende spindel (se punkt 3 og 4). Roterer spindelen ved en fast hastighet på 10 mm / sek for å tillate dannelse av ensartede og beadless IPC fibre. Øker hastigheten for å trekke koblingsapparatets fibrene vil danne kuler, noe som vil føre til en eksplosjon frigjøring av inkorporertbiokjemiske og prematur fiber oppsigelse. 10
- For å bestemme inkorporasjonseffektivitet, samle alle de gjenværende væske igjen på parafilmen ved fortynning med 500 ul av 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Mål proteinet eller vekstfaktor-innholdet i residuet ved BCA-analyse (for BSA), ELISA (for VEGF og NGF) eller et egnet analyse for å påvise innlemmet biomolekyl.
3. Fabrikasjon av Composite Hydrogel Stillas av Pullulan-dekstran (PD) Polysaccharide og IPC Fibers
- Fabrikere offer pullulan ramme for IPC fiber samling
- Vei ut pullulan polysakkarid og blandes med destillert deionisert (DDI) vann for å lage en 20% (w / v) vandig løsning. Bland pullulan løsning O / N for å sikre homogenitet.
- Fell 15 g pullulan løsning i en 10 cm diameter vevskulturpolystyren (TCPS) parabolen. Tørk pullulan løsning O / N ved 37 ° C. Skjær pullulan filmene til 7mm x 7 mm firkantede rammer.
- Forbereder pullulan-dekstran polysakkaridløsningen
- Lag en 30% (w / v) løsning av polysakkaridene dekstran og pullulan (3: 1 ratio) i DDI vann. Bland O / N for å sikre homogeniteten av polysakkaridløsningen. Tilsett langsomt i natriumbikarbonat til polysakkaridløsningen for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20% (w / v). Bland O / N for å sikre homogeniteten av oppløsningen. Oppbevar polysakkarid-løsning ved 4 ° C.
- Samle IPC fibre på pullulan ramme
- Fest offer pullulan rammen (avsnitt 3.1) ved hjelp av en alligator klipp. Stick alligator klippet og pullulan ramme på enden av den roterende dor ved hjelp av plastbelagt tape. Rotere doren med påført ramme ved en konstant hastighet på 10 mm / sek. Pullulan ramme kan være festet på den roterende spindel i ønskede retninger.
- Tegn IPC fibrene ved hjelp av en pinsett (seksjon 1) og Attach den trukne ende av koblingsapparatet fibre på den roterende pullulan rammen. Tegn IPC-fibre med en konstant hastighet. Ved å nå den terminale enden av IPC fiber, tørk fibre selv om rammekonstruksjon O / N ved RT.
- Inkludering IPC fiber til PD hydrogel stillaset
- For å fornette hvert gram pullulan-dekstranoppløsningen, tilsett 100 ul 11% (vekt / volum) natriumtrimetafosfat vandig løsning og 100 pl 10 M natriumhydroksid. 7 Bland løsningen ved 60 opm ved anvendelse av en stirplate for 1 til 2 min. Etter tilsetning av natriumtrimetafosfat og natriumhydroksyd, vil tverrbinde polysakkaridet løsningen nesten umiddelbart. Hell den viskøse polysakkarid-løsningen på fibrene-on-ramme-konstruksjonen på for helt å IPC fibrene. Inkuber de kombinerte pullulan-dekstran-IPC fibre (PD-IPC) ved 60 ° C i 30 minutter for å danne et kjemisk tverrbundne kompositt stillas (Figur 1b).
- FORSIKTIG: Utfør trinn 3.3.2 i avtrekksskap og bruke skikkelig brannvern equipment som eddiksyre er en etsende og brannfarlig.
- For å indusere poredannelse i PD-IPC stillas, senke hele stillaset i 20% (w / v) eddiksyre i 20 min.
- Fjerne ureagerte reagenser ved å vaske PD-IPC stillasene i 1 x PBS i 5 minutter under rysting ved 100 rpm. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Fjern overflødig PBS og umiddelbart fryse PD-IPC stillaser ved -80 ° CO / N. Lyofilisere stillasene minst 24 timer før bruk i noen kontrollerte utslipp eller bioaktivitet analyser.
4. Fabrikasjon av Composite Stillas av PCL og IPC Fibers
FORSIKTIG: Dichloromethane er et farlig materiale. Bruk avtrekksskap og personlig verneutstyr ved håndtering av diklormetan.
- Opprette uberørte og mønstrede PDMS underlag
- Lag en uberørt polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer underlaget med et stykke TCPS av ønsket dimensjon bruker myk litografi prosess. Lag patterned PDMS substrater ved anvendelse av standard myke litografiske metoder på poly (metylmetakrylat) maler med den ønskede topografi. 12
- Fabrikere offer PCL ramme for IPC fiber samling
- Vei ut PCL og oppløses i diklormetan for å skape en 0,9% (w / v) løsning. For hver 1 cm 2 område av PDMS substratet, slipp 500 mL av 0,9% PCL-løsning. La all diklormetan løsningsmidlet fordampe for å fullt ut i avtrekksskap. Gjenta fremgangsmåten med å støpe 0,9% PCL å tykne filmen til den ønskede tykkelse. Fjern tørket PCL film fra PDMS underlaget. Lag et hull i PCL rammen med en passende størrelse puncher. 2
- Samle IPC fibre på PCL ramme
- Fest offer PCL ramme med hull (fra 4.2.1) på en alligator klipp. Stikk alligator klippet på den roterende spindel ved hjelp av plastbelagt teip. Fest trukket slutten av IPC fiber på PCL frame før rotasjonen ved en konstant hastighet på 10 mm / sek (seksjon 2). Etter slutten av IPC fiber tegning, tørk fiber-on-ramme-konstruksjon O / N ved 4 ° C.
- Inkludering fiber-on-frame konstruere inn mønstret PCL underlaget
- Slipp 500 ul av 0,9% PCL løsning på PDMS substratet for å skape en uberørt eller mønstret PCL base, etter behov. Fell flere lag av 0,9% PCL-løsning for å oppnå et stillas med den ønskede tykkelse. La all diklormetan løsningsmidlet fordampe for å fullt ut i avtrekksskap.
- Plasser fiber-on-frame konstruksjon (seksjon 4.3.1) på toppen av PCL basen. Legg 0,9% PCL løsning på fiber-on-frame konstruere flere ganger for å få ønsket tykkelse og fullt legge IPC fibrene, fabrikkere en PCL-IPC kompositt stillas (figur 1C).
5. Måling av Offentliggjøring av biologiske midler fra Composite IPC Stillas
- Plasser kompositt PD-IPC ellerPCL-IPC stillaser og frittstående IPC fibre separat i en 24-brønns plate.
- Fordyp stillaset og frittstående IPC fibre med 500 mL 1X PBS. Inkuber prøvene ved 37 ° C. Samle PBS på ulike tidspunkter (utgivelse medier) og erstatte med 500 mL 1X PBS.
- Måle mengden av protein eller vekstfaktor i versjons media ved anvendelse av en BCA-analyse (BSA), ELISA (VEGF og NGF) eller annen egnet assay for å beregne den kumulative frigjøringsprofil for den inkorporerte biomolekyl.
6. Seeding Celler på Composite IPC Stillas å teste bioaktivitet av frigitte biologiske midler
- Steril de lyofiliserte PD-IPC eller PCL-IPC komposittstillasene ved hjelp av UV-lys på biologisk sikkerhetskabinett i minst 20 min.
- Bruk av standard cellekulturteknikker for å oppnå en celle-suspensjon av 2 x 10 5 celler i 200 ul vekstmedium. Seed konsentrert cellesuspensjon på kompositt stillaser. After 20 min, topp-opp volumet av vekstmedier til fullt dukke stillasene.
- Mål-celleaktivitet ved hjelp av vanlige teknikker slik som Alamar blue metabolsk aktivitet assay, PC12 neurittutvekst assay eller immunfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen har vi ønsket å lage sammensatte stillaser med IPC fiber for vedvarende frigjøring av ulike biomolekyler. Karakteristikker av biomolekyler som brukes i denne undersøkelsen finnes i tabell 1. IPC-fibre ble først innleiret i en hydrofil hydrogel PD for å skape en PD-IPC kompositt stillas (figur 1B). Model molekyl BSA ble først testet for å bestemme muligheten for å bruke en sammensatt stillas for kontrollert frigivelse biomolekyl. BSA ble innlemmet i PD-IPC stillasene med en effektivitet på 45 ± 0,97%. BSA frigjort fra PD-IPD viste nær-lineær kinetikk med en initial burst svekket frigjøring, etterfulgt av en samtidig stabil tilstand (figur 2). Etter to måneder, BSA oppnådde en samlet utgivelse på 97%. I motsetning til dette, stående IPC fibre oppviste en hurtig frigjøring av 80% av BSA i 4 timer.
Deretter sjekket vi utgivelsen profil og bioaktivitet av VEGF bruker PD-IPC scaffoLDS. VEGF ble inkorporert med en effektivitet på 75,5 ± 2,7%, og viste en vedvarende frigjøring i minst en uke (figur 3A). Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) ble sådd på PD-IPC stillasene for å bestemme bioaktiviteten av VEGF. HUVECs på PD-IPC stillasene viste en signifikant økning i Alamar blue reduksjon og metabolsk aktivitet sammenlignet med vanlig PD stillaser på dag 1, noe som indikerer god bevaring av VEGF funksjon etter å ha blitt frigjort fra PD-IPC stillasene (figur 3b). Alamar blue reduksjon på dag 3, 6 og 7 ble redusert for å oppnå sammenlignbare nivåer med ren PD stillaset (figur 3B).
PCL-IPC komposittstillasene ble også testet for kontrollert frigjøring og sammenlignet med frittstående IPC fibre. Vi innlemmet NGF som representant molekyl inn i PCL-IPC komposittstillasene med en innlemmelse virkningsgrad på 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC kompositt stillaser viste linjear vedvarende frigjøring og ca 80% kumulativ meldingen etter 18 dager (Figur 4A). På den annen side, IPC frittstående fiber viste en 70% burst frigivelse innen 24 timer, etterfulgt av en stillestående frigjøringshastighet. Ved hjelp av en PC12 neurittutvekst assay, undersøkte vi bioaktiviteten av den frigitte NGF (figur 4B). Den neurittutvekst av PC12 celler dyrket på PCL-IPC kompositt stillaset utgivelsen medier viste lignende nivåer med PC12 celler dyrket i 30 ng / ml NGF supplert media. Dette indikerer at den frigjorte NGF forble bioaktivt i minst 7 dager.
Kombinasjonen av topografi og vedvarende vekstfaktor levering kan etterligne den cellulære mikromiljøet bedre. Den allsidige metodikk for PCL-IPC fabrikasjon tillatt fabrikasjon av en biochemically- og topografisk styrte kompositt stillaset. Vi fabrikkert en PCL-IPC kompositt stillas med nano-størrelse rister struktur (NP-PCL-IPC stillas). Vi observerte den synergis effekt av topografi og vedvarende NGF utgivelsen ved å vurdere nevronal differensiering av humane stamceller (hMSCs) (figur 5). hMSCs dyrket på NP-PCL-IPC kompositt stillaser viste høyere uttrykk av microtubule assosiert protein 2 (MAP2), indikerer neuronal differensiering. På den annen side, MAP2 protein-ekspresjon ble betydelig lavere i hMSCs dyrket på PCL-IPC med bare NGF frigivelse eller mønstret PCL (NP-PCL).
Figur 1. Innlemmelse av IPC fibre i hydrofile og hydrofobe stillaser. (A) Tegning av IPC fibre i grenselandet mellom positivt (kitosan) og negativt (alginat) som belastes polyelektrolytt løsninger. (B) Skjematisk diagram som viser inkorporering av IPC fibre i hydrofil PD løsning for å lage PD-IPC komposit e stillaset. (C) Skjematisk diagram som viser inkorporeringen av fibre i IPC hydrofobe PCL stillas for å skape PCL-IPC kompositt stillaset. Dette tallet er tilpasset fra Cutiongco et al., 2014. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kontrollert frigjøring av BSA fra PD-IPC kompositt stillaset. BSA ble innlemmet i PD-IPC kompositt stillasene og dets frigjøring ble målt ved forskjellige tidspunkter ved hjelp av BCA-analyse. Kumulativ BSA utgitt er gitt som en prosentandel av den totale mengden av BSA (i ug) innarbeides i IPC-fibrene, og er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik i prosent. Dette tallet er tilpasset fra Cutiongco et al., 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kontrollert utslipp og bioaktivitet av VEGF fra PD-IPC kompositt stillaset. (A) Akkumulert utgivelsen profilen til VEGF fra PD-IPC kompositt stillaser. VEGF utgivelsen ble målt på ulike tidspunkter med Elisa spesifikk for VEGF. (B) Cellenes levedyktighet av endotelceller dyrket på PD-IPC kompositt stillas, som målt ved Alamar blue metabolske analysen. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. * Angir p <0,05. Dette tallet er tilpasset fra Cutiongco et al., 2014. 7 Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 4. Kontrollert utslipp og bioaktivitet av NGF fra PCL-IPC kompositt stillaset. (A) Akkumulert utgivelsen profilen til NGF fra PCL-IPC kompositt stillaser. NGF utgivelsen ble målt på ulike tidspunkter med Elisa spesifikk for NGF. Sett viser akkumulert utgivelsen profilen til NGF fra PCL-IPC stillas for første 8 timer. (B) bioaktivitet av NGF som målt ved utvekst av PC12 neuralceller. PC12 utvekst ble målt gjennom bildeanalyse. Dette tallet er tilpasset fra Teo et al., 2014. 2 Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
.jpg "/>
Figur 5. Differensiering av HMSC om NP-PCL-IPC stillaset. Confocal scanning mikroskopi bilde av HMSC dyrket på ulike sammensatte stillaser. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) Tine PCL stillaser. Grønn flekk betegner MAP2, en neuronal avstamning markør. Rød flekk betegner F-aktin, som viser den cellulære cytoskjelettet. Blå flekk betegner kjernen. Dette tallet er tilpasset fra Teo et al., 2014. 2 Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Kjennetegn på biokjemikalier som brukes for kontrollert frigjøring fra kompositt IPC stillaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPC fibre er dannet ved interaksjon av to motsatt ladede polyelektrolytter. Fremgangsmåten anvender ekstraksjon av komplekset fra grenseflaten av polyelektrolytter, som muliggjør selvbygging fremgangsmåte for stabil fiberdannelse. Mekanismen for IPC fiberdannelse sikrer at ethvert biomolekyl lagt inn i et likt ladet polyelektrolytt kan inkorporeres i løpet av komplekseprosessen. 10,11 Omvendt vil tilsetning av et biomolekyl til en motsatt ladet polyelektrolytt resultere i øyeblikkelig utfelling. Den enkle fabrikasjon metodikk for IPC fibre gir allsidighet i å innlemme forskjellige biologiske materialer så som celler, vekstfaktorer og små molekyler. Denne kritiske funksjon i IPC fibrene ble også observert i både PD-IPC og PCL-IPC kompositt stillasene, hvor vekstfaktorer med ulike fysiske og biomolekylære egenskaper (gebyr og molekylvekt) ble tatt med høy effektivitet. I contrast, kan innkapslingseffektivitet ved hjelp av mikro metoder for VEGF og NGF være så lav som 16% og 6% 8 13, henholdsvis.
Både PD-IPC og PCL-IPC stillaser også vist tidsmessig kontroll av biomolekyl utgivelse. VEGF fra PD-IPC stillaser viste lineær utgivelse i minst 7 dager. I motsetning til dette rapporterte VEGF-frigjøringsprofiler av polymer mikrokuler viste en initial burst frigivelse innen 24 timer, frigjør minst 60% av det totale VEGF innhold. 5,14,15 Tilsvarende NGF ble vist å ha vedvarende vekstfaktor levering fra PCL-IPC stillasene, mens andre polymerbaserte vekstfaktor leveringssystemer viser et platå av utgivelse fra 20 dager etter utgivelsen. 13,16 Antagelig de ulike komponentene av de sammensatte stillasene både bidra til vekstfaktor utslipp kinetikk. Polymer avspenningsmekanismer, kan porøsiteten og tortuosity stor grad påvirke frigivelse av hydrofile biomolekyler. 17 I tillegg er chemical karakteristikker av polymere stillaset kan ha elektrostatisk tiltrekning og frastøting mot vekstfaktorer som påvirker biomolekyl utgivelse. Således, egenskapene til den polymere stillaset er kritiske for å bestemme frigjøringsprofiler og med biomolekyler-temporalt kontrollert frigivelse. For eksempel, mens den PD stillaset viste nesten-lineær BSA utgivelse, et tilsvarende sammensatt stillas ved hjelp av poly (vinylalkohol) hydrogel manglet permeabilitet til BSA. 18 Polymer stillaser som kan brukes i kombinasjon med IPC fibre kan kreve preliminær testing for å bestemme dets permeabilitet område.
I tillegg til å kontrollert frigjøring biokjemisk, er evnen til å beholde den biologiske aktivitet av vekstfaktorer en viktig egenskap for ethvert biomolekyl leveringssystem. Den harde alkalisk miljø av PD-oppløsning og nærvær av organisk løsningsmiddel i DCM PCL har potensial til å degradere noen form for biomolekyler. For eksempel microsphere levering system som brukte diklormetan viste en konsistent tendens til å svekke bioaktivitet med økende endepunktet på grunn av nedbrytning av NGF. 16 Ikke desto mindre, har vi observert at bioaktiviteten av VEGF og NGF opprettholdes, videre gjentok at en viktig fordel med IPC fibrene er assimilert inne i kompositt stillaser.
Bruken av en offer, biokompatibelt polysakkarid eller polymer ramme som lett kan inkorporeres i bulk stillaset gir allsidighet til å skape en sammensatt stillas med flere IPC fibre innrettet i forskjellige konfigurasjoner. 7. Således er det nødvendig at de polymere stillasene som skal påføres med IPC fibre har kapasitet for videre assimilering inn i en bulk stillaset. Assimilasjonspresset er viktig i fullt innstøping IPC fiber til polymer stillaset. Vi observerte dette fenomenet i offer pullulan og PCL-rammer, som begge ble lett løst opp i oppløsningsmidlet i bulk eller PDPCL stillaset. Videre er det enkelt-trinns metode for fabrikasjon og IPC biomolekyl inkorporering gir fleksibilitet til antallet biomolekyler som kan leveres av en enkelt sammensatt stillaset. Enkelheten av metodikken gir også finjustering av innlemmelse effektivitet og utslipp kinetikk ved å endre polyelektrolytten identitet eller konsentrasjon. Den naturlige polyelektrolytter kitosan og alginat ble benyttet på grunn av høy ladningstetthet og likheten til ulike ECM-karbohydrater som finnes i animalsk vev. Ennå metylert kollagen og terpolymer 8,19 eller kitin og alginat 20 kan også benyttes for IPC fiberdannelse i varierende effekter. Flere IPC fibre frigjøre forskjellige biokjemiske signaler med ulike kinetikk kan også oppnås for å opprette en multi-funksjonelle kompositt stillaset. For eksempel kan ekstracellulære matriseproteiner så som fibronektin som er lastet inn i IPC fibre tilveiebringe en plattform for romlig kontrollert celleadhesjon. 7 Vedvarendefrigjøring av antibiotika og vekstfaktorer er også ønskelig for vev gjenfødelse applikasjoner. Dette kan være mulig ved hjelp av PCL-IPC, som kan innlemme hydrofobe, små molekyl narkotika og hydrofile, proteinbaserte vekstfaktorer i ulike avdelinger av den sammensatte stillaset. 2
Vår presenteres metodikken også tillatt fabrikasjon av et stillas med både topografiske og biokjemiske signaler. Vi observerte at NP-PCL-IPC stillaset hadde høyest forbedring av HMSC differensiering inn i neuronal avstamning, noe som tyder på at etterligne flere aspekter av den biofysiske og biokjemiske cellular nisje er gunstig i regi celle atferd. Den enkle metoden som er presentert tillater dens anvendelse i andre patternable polymere systemer som polyakrylamid 21 eller polyetylenglykol 22, forutsatt at tverrbindingsprosessen ikke vil påvirke IPC fiberintegritet. For eksempel PD stillaser var chOsen i denne studien for sin unike tverrbinding mekanisme som forekommer i omgivelsene og vandige betingelser. 24 Dette kan potensielt gi mer fysiologisk relevante substrater for in vitro og in vivo studier. I tillegg kan innstøping IPC fibre i en kompositt stillas overvinne mangelen på mekanisk styrke av IPC fibre 23 ved å tilveiebringe strekkfasthet. Faktisk ble PCL 25 valgt for sin høy mekanisk styrke.
I sammendrag, ble en enkel metode for å lage kompositt stillas for biomolekyl levering rives. Vi demonstrerte hvordan IPC fibre kan benyttes for vedvarende levering av biomolekyler uten å svekke dets bioaktivitet og inkorporering effektivitet. Vi viste dette ved å lage sammensatte stillas med to varianter: PD-IPC og PCL-IPC stillaser. Anvendelse av IPC fibre er ikke begrenset til, inkorporering i PD og PCL-baserte stillasene, men kan eventuelt utvides til andre polymere systemerog for å levere andre biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Singapore National Research Foundation administreres av en av sine forskningssentre for forskning, den Mechanobiology Institute, Singapore. MFAC er støttet av Direktoratet for Science, Technology and Research (Singapore) og National Agency for forskning (Frankrike) felles program under prosjektnummer 1122703037. BKKT støttes av Mechanobiology Institute. Vi takker Mr. Daniel HC Wong for korrekturlesing av manuskriptet og Ms. Dawn JH Neo for å bistå i videoproduksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
