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Bioengineering

Biomolecules के अस्थायी नियंत्रित रिलीज के लिए Interfacial polyelectrolyte तंतुओं का समग्र Scaffolds

Published: August 19, 2015 doi: 10.3791/53079
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

Protocol

Polyelectrolyte समाधान के 1. तैयारी

  1. लियाओ एट अल में विस्तृत रूप में, chitosan के शुद्ध। संक्षेप में, एक 1% बनाने के 2% में chitosan के समाधान (w / v) (वी / वी) एसिटिक एसिड और वैक्यूम फिल्टर ग्रेड 93 फिल्टर पेपर का उपयोग कर। पीएच 10 मिनट के लिए 1,200 XG पर अपकेंद्रित्र 7. उपजी chitosan के लिए स्थिर हो जब तक 5M NaOH का उपयोग कर छानना बेअसर। सतह पर तैरनेवाला छानना और chitosan धोने के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें। Centrifugation और धोने कदम दो बार दोहराएँ। शुद्ध फार्म प्राप्त करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस और lyophilize हे / एन पर उपजी chitosan के रुक। एक dehumidified कैबिनेट में शुद्ध chitosan के स्टोर।
  2. एक बाँझ टिशू कल्चर डिश में शुद्ध chitosan की 1 ग्राम वजन। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी लैंप के लिए संभव के रूप में बंद टिशू कल्चर पकवान में chitosan प्लेस और 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश को बेनकाब। बाँझ संदंश का प्रयोग, एक ग्लास कंटेनर में निष्फल chitosan के लिए जगह है। भंग chitosan के 0 फ़िल्टर्ड का उपयोग करते हुए।0.5% और 1% के बीच एक अंतिम एकाग्रता के लिए 15M एसिटिक एसिड (w / v)।
  3. Alginic एसिड सोडियम नमक की 0.1 ग्राम वजन और (डब्ल्यू / वी) समाधान के लिए एक 1% प्राप्त करने के लिए विआयनीकृत (DDI) आसुत जल 10 मिलीलीटर में भंग। पूरा विघटन को सुनिश्चित करने के भंवर मिक्सर पर कम से कम 2 घंटे के लिए alginic एसिड सोडियम नमक मिलाएं। 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से alginate समाधान फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर alginate समाधान स्टोर।
  4. निर्माता की सिफारिश के अनुसार तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF), - ऐसे संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) या बीटा के रूप में मानव पुनः संयोजक वृद्धि कारकों पुनर्गठित।

आईपीसी फाइबर 2. ड्राइंग

  1. एक ऐसी ही शुद्ध आरोप है कि polyelectrolyte समाधान के 10-20 μl विभाज्य में प्रोटीन, वृद्धि कारकों या अन्य biomolecules मिलाएं। शुद्ध नकारात्मक चार्ज (जैसे गोजातीय सीरम albumin [बीएसए]) के साथ जैविक अणुओं alginate समाधान के साथ मिलाया जाना चाहिए। शुद्ध सकारात्मक चार्ज (जैसे वीईजीएफ़) के साथ जैविक अणुओं के साथ मिलाया जाना चाहिएchitosan के समाधान।
  2. Parafilm के साथ कवर किया जाता है कि एक स्थिर सपाट सतह पर chitosan और alginate के छोटे aliquots (10-20 μl) रखें। chitosan और alginate की बूंदों पास में रखा गया है, लेकिन नहीं एक दूसरे के साथ संपर्क में होना चाहिए।
  3. हल्के chitosan और alginate बूंदों में संदंश की एक जोड़ी पर एक टिप डुबकी। एक साथ संदंश बन्द रखो द्वारा polyelectrolytes की बूंदों लाओ। बूंदों एक दूसरे के साथ संपर्क में आते हैं, धीरे-धीरे दो बूंदों (चित्रा 1 ए) के इंटरफ़ेस से आईपीसी फाइबर आकर्षित करने के लिए खड़ी ऊपर की ओर संदंश खींच।
  4. ध्यान से इस तरह के एक घूर्णन खराद का धुरा पर चिपका एक फ्लैट पोलीमेरिक पाड़ के रूप में एक कलेक्टर, पर संदंश पर तैयार आईपीसी फाइबर के अंत जगह (धारा 3 देखें और 4)। वर्दी की और आईपीसी तंतुओं beadless गठन की अनुमति के लिए 10 मिमी / सेकंड की एक निश्चित गति से खराद का धुरा घुमाएँ। शामिल की एक फट रिहाई का कारण होगा जो मोती के रूप में होगा आईपीसी तंतुओं ड्राइंग की गति बढ़ रही हैजैव रासायनिक और समय से पहले फाइबर समाप्ति। 10
  5. निगमन क्षमता का निर्धारण करने के लिए, शेष सभी तरल पदार्थ 1X फॉस्फेट बफर खारा के 500 μl (पीबीएस) के साथ गिराए द्वारा parafilm पर छोड़ दिया इकट्ठा। बीसीए (बीएसए के लिए) परख, (वीईजीएफ़ और NGF के लिए) एलिसा या निगमित बायोमोलिक्यूल पता लगाने के लिए एक उपयुक्त परख के माध्यम से छाछ में प्रोटीन या वृद्धि कारक सामग्री को मापने के।

कम्पोजिट Hydrogel pullulan-dextran के पाड़ (पीडी) polysaccharide और आईपीसी फाइबर 3. निर्माण

  1. आईपीसी फाइबर संग्रह के लिए बलि पुलुलान फ्रेम Fabricating
    1. पुलुलान पॉलीसैक्राइड वजन और (डब्ल्यू / वी) जलीय समाधान के लिए एक 20% बनाने के लिए आसुत विआयनीकृत (DDI) पानी के साथ मिश्रण। एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए पुलुलान समाधान हे / एन मिलाएं।
    2. एक 10 सेमी व्यास टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) डिश में pullulan के समाधान की 15 ग्राम कास्ट। 37 डिग्री सेल्सियस पर पुलुलान समाधान हे / एन सूखी। 7 में पुलुलान फिल्मों कटमिमी 7 मिमी वर्ग फ्रेम एक्स।
  2. पुलुलान-dextran के पॉलीसैक्राइड समाधान की तैयारी
    1. एक 30% बनाएं polysaccharides के समाधान पुलुलान और dextran (w / v): DDI पानी में (3 1 के अनुपात)। पॉलीसैक्राइड समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ओ / एन मिलाएं। धीरे-धीरे 20% की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए पॉलीसैक्राइड समाधान करने के लिए सोडियम बाइकार्बोनेट में जोड़ने के लिए (w / v)। समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ओ / एन मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीसैक्राइड समाधान स्टोर।
  3. Pullulan के फ्रेम पर आईपीसी तंतुओं का संग्रह
    1. एक मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर बलि पुलुलान फ्रेम (खंड 3.1) प्रत्यय। प्लास्टिक में लिपटे चिपकने वाला टेप का उपयोग कर घूर्णन खराद का धुरा के अंत पर मगरमच्छ क्लिप और pullulan फ्रेम रहो। 10 मिमी / सेकंड की एक स्थिर गति से चिपका फ्रेम के साथ खराद का धुरा घुमाएँ। पुलुलान फ्रेम वांछित झुकाव में घूर्णन खराद का धुरा पर चिपका जा सकता है।
  4. एक संदंश की जोड़ी (खंड 1) और attac का उपयोग कर आईपीसी तंतुओं ड्राएच घूर्णन pullulan के फ्रेम पर आईपीसी फाइबर की खींचा अंत। एक स्थिर गति से आईपीसी तंतुओं ड्रा। आईपीसी फाइबर के टर्मिनल अंत तक पहुँचने पर, एन आर टी पर / तंतुओं पर फ्रेम निर्माण हे सूखी।
  5. पीडी हाइड्रोजेल पाड़ में आईपीसी तंतुओं Embedding
  6. । (W / v) सोडियम जलीय समाधान और 100 μl 10M सोडियम हाइड्रोक्साइड trimetaphosphate 11% की 100 μl जोड़ें, पुलुलान-dextran के समाधान के हर ग्राम crosslink 7 1 से 2 मिनट के लिए एक stirplate का उपयोग कर 60 rpm पर समाधान मिश्रण करने के लिए। सोडियम trimetaphosphate और सोडियम हाइड्रोक्साइड के अलावा के बाद, पॉलीसैक्राइड समाधान के लगभग तुरंत crosslink जाएगा। आईपीसी तंतुओं को पूरी तरह एम्बेड करने के तंतुओं पर फ्रेम निर्माण पर चिपचिपा पॉलीसैक्राइड समाधान डालो। एक रासायनिक Crosslinked समग्र मचान (चित्रा 1 बी) के रूप में करने के लिए 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर संयुक्त पुलुलान-dextran-आईपीसी फाइबर (पीडी-आईपीसी) सेते हैं।
  7. चेतावनी: धूआं हुड में कदम 3.3.2 प्रदर्शन और उचित सुरक्षात्मक सम उपयोगएसिटिक एसिड के रूप में pment के संक्षारक और ज्वलनशील एक है।
  8. पीडी-आईपीसी पाड़ में ताकना गठन को प्रेरित करने के लिए, 20 मिनट के लिए 20% में (डब्ल्यू / वी) एसिटिक एसिड पूरे पाड़ डूब।
  9. 100 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 5 मिनट के लिए 1X पीबीएस में वाशिंग पी.डी. आईपीसी scaffolds के द्वारा unreacted अभिकर्मकों निकालें। इस चरण 2 बार दोहराएँ।
  10. अतिरिक्त पीबीएस निकालें और तुरंत -80 डिग्री सीओ / एन पर पीडी-आईपीसी scaffolds के फ्रीज। Scaffolds के किसी भी नियंत्रित रिहाई या bioactivity assays में उपयोग करने से पहले कम से कम 24 घंटा Lyophilize।

PCL और आईपीसी तंतुओं का समग्र पाड़ के 4. निर्माण

चेतावनी: dichloromethane एक खतरनाक सामग्री है। Dichloromethane जब से निपटने धूआं हुड और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का प्रयोग करें।

  1. प्राचीन और नमूनों PDMS substrates के बनाना
    1. नरम लिथोग्राफी प्रक्रिया का उपयोग कर वांछित आयाम की TCPS के एक टुकड़े का उपयोग कर एक प्राचीन polydimethylsiloxane (PDMS) elastomeric सब्सट्रेट बनाएँ। Patte बनाएँवांछित स्थलाकृति के साथ टेम्पलेट्स पाली (मिथाइल methacrylate) पर मानक नरम Lithographic विधियों का उपयोग कर rned PDMS substrates। 12
  2. आईपीसी फाइबर संग्रह के लिए बलि PCL के फ्रेम Fabricating
    1. PCL के वजन और (डब्ल्यू / वी) समाधान के लिए एक 0.9% बनाने के लिए dichloromethane में भंग। PDMS सब्सट्रेट के हर 1 2 सेमी क्षेत्र के लिए, 0.9% PCL के समाधान के 500 μl ड्रॉप। पूरी तरह से धूआं हुड में लुप्त हो जाना dichloromethane विलायक के सभी की अनुमति दें। इच्छित मोटाई के लिए फिल्म गाढ़ा करने के लिए 0.9% PCL के कास्टिंग की प्रक्रिया को दोहराएं। PDMS सब्सट्रेट से सूखे पीसीएल फिल्म निकालें। एक उपयुक्त आकार पंचर का उपयोग कर PCL के फ्रेम में एक छेद बना। 2
  3. PCL के फ्रेम पर आईपीसी तंतुओं का संग्रह
    1. एक मगरमच्छ क्लिप पर (4.2.1) से छेद के साथ बलि PCL के फ्रेम प्रत्यय। प्लास्टिक में लिपटे चिपकने वाला टेप का उपयोग करके घूर्णन खराद का धुरा पर मगरमच्छ क्लिप रहो। पीसीएल फ्रैम पर आईपीसी फाइबर की तैयार की छोर संलग्न10mm / सेक (खंड -2) में एक स्थिर गति से रोटेशन शुरू करने से पहले ई। आईपीसी फाइबर ड्राइंग के अंत के बाद, फाइबर पर फ्रेम निर्माण हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस सूखी।
  4. फाइबर पर फ्रेम नमूनों पीसीएल सब्सट्रेट में निर्माण Embedding
    1. आवश्यकता के रूप में, एक प्राचीन या नमूनों PCL के आधार बनाने के लिए PDMS सब्सट्रेट पर 0.9% PCL के समाधान के 500 μl गिरा। इच्छित मोटाई के साथ एक पाड़ प्राप्त करने के लिए 0.9% PCL के समाधान के कई परतों कास्ट। पूरी तरह से धूआं हुड में लुप्त हो जाना dichloromethane विलायक के सभी की अनुमति दें।
    2. PCL के आधार के शीर्ष पर फाइबर पर फ्रेम निर्माण (धारा 4.3.1) रखें। इच्छित मोटाई पाने के लिए फाइबर पर फ्रेम के निर्माण के लिए कई बार पर 0.9% PCL के समाधान जोड़ें और पूरी तरह से एक पीसीएल-आईपीसी समग्र पाड़ (चित्रा 1C) fabricating, आईपीसी तंतुओं एम्बेड।

कम्पोजिट आईपीसी Scaffolds से जैविक एजेंटों की रिहाई के 5. मापन

  1. प्लेस समग्र पी.डी. आईपीसी यापीसीएल-आईपीसी scaffolds और खड़े अकेले भारतीय दंड संहिता के रेशों को अलग से एक 24 अच्छी तरह से थाली में।
  2. पाड़ को विसर्जित कर दिया और अकेले खड़े आईपीसी तंतुओं 1X पीबीएस के 500 μl के साथ। 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। विभिन्न समय अंक (रिहाई मीडिया) में पीबीएस लीजिए और 1X पीबीएस के 500 μl के साथ बदलें।
  3. निगमित बायोमोलिक्यूल के लिए संचयी रिहाई प्रोफाइल की गणना के लिए एक बीसीए परख (बीएसए), एलिसा (वीईजीएफ़ और NGF) या अन्य उपयुक्त परख का उपयोग रिहाई मीडिया में प्रोटीन या विकास का पहलू की मात्रा को मापने।

कम्पोजिट आईपीसी scaffolds पर प्रकोष्ठों के 6. सीडिंग का विमोचन जैविक एजेंटों की bioactivity टेस्ट

  1. कम से कम 20 मिनट के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर lyophilized पी.डी. आईपीसी या पीसीएल-आईपीसी समग्र scaffolds के जीवाणुरहित।
  2. 200 μl विकास मीडिया में 2 x 10 5 कोशिकाओं के एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए मानक सेल कल्चर तकनीक का प्रयोग करें। समग्र मचान पर केंद्रित सेल निलंबन बीज। Afteआर 20 मिनट, पूरी तरह से scaffolds के डूब विकास मीडिया के टॉप-अप मात्रा।
  3. ऐसे Alamar नीले चयापचय गतिविधि परख, PC12 neurite परिणाम परख या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रूप में मानक तकनीक के माध्यम से सेल गतिविधि को मापने।

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Representative Results

इस अनुच्छेद में, हम विभिन्न biomolecules के निरंतर जारी करने के लिए भारतीय दंड संहिता फाइबर के साथ समग्र मचान बनाने की मांग की। इस अध्ययन में इस्तेमाल biomolecules के लक्षण तालिका 1 में पाए जाते हैं। आईपीसी तंतुओं पहले एक पी.डी. आईपीसी समग्र पाड़ (चित्रा 1 बी) बनाने के लिए एक हाइड्रोफिलिक पीडी हाइड्रोजेल में एम्बेडेड थे। मॉडल अणु बीएसए पहली नियंत्रित बायोमोलिक्यूल रिहाई के लिए एक समग्र पाड़ के उपयोग की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया गया था। बीएसए 45 ± 0.97% की दक्षता के साथ पी.डी. आईपीसी मचान में शामिल किया गया था। पीडी-आईपीडी से रिहा बीएसए एक सहवर्ती स्थिर राज्य द्वारा पीछा एक प्रारंभिक तनु फट रिहाई (चित्रा 2) के साथ निकट रेखीय कैनेटीक्स दिखाया। 2 महीने बाद, बीएसए 97% की कुल रिहाई हासिल की। इसके विपरीत, स्टैंडअलोन आईपीसी तंतुओं 4 घंटे के भीतर बीएसए का 80% की एक तेजी से रिहाई का प्रदर्शन किया।

अगला, हम पी.डी. आईपीसी scaffo का उपयोग कर वीईजीएफ़ की रिहाई की प्रोफाइल और bioactivity की जाँचLDS। वीईजीएफ़ 75.5 ± 2.7% की दक्षता के साथ शामिल किया है, और कम से कम 1 सप्ताह (चित्रा 3) के लिए एक निरंतर जारी दिखाया गया था। मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) वीईजीएफ़ की bioactivity निर्धारित करने के लिए पीडी-आईपीसी scaffolds पर वरीयता प्राप्त थे। पीडी-आईपीसी scaffolds पर HUVECs पी.डी. आईपीसी मचान (3B चित्रा) से रिहा होने के बाद वीईजीएफ़ समारोह का अच्छा संरक्षण, यह दर्शाता है 1 दिन में सादे पीडी scaffolds के साथ तुलना में Alamar नीले रंग में कमी और चयापचय गतिविधि में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई। दिन 3, 6 और 7 में Alamar नीले कमी सादे पीडी पाड़ (3B चित्रा) के साथ तुलनीय स्तर को प्राप्त करने के लिए कम किया है।

पीसीएल-आईपीसी समग्र मचान भी नियंत्रित रिहाई के लिए परीक्षण किया है और स्टैंडअलोन आईपीसी फाइबर के साथ तुलना की गई। हम 66.38 ± 2.71% का समावेश दक्षता के साथ पीसीएल-आईपीसी समग्र मचान में एक प्रतिनिधि अणु के रूप में NGF शामिल किया। पीसीएल-आईपीसी समग्र मचान लाइन से पता चलागिरफ्तारी निरंतर जारी है और 18 दिनों (चित्रा -4 ए) के बाद लगभग 80% संचयी रिहाई। दूसरी ओर, भारतीय दंड विधान खड़े अकेले फाइबर एक स्थिर रिहाई की दर से पीछा 24 घंटे के भीतर एक 70% फट रिहाई दिखाया। एक PC12 neurite परिणाम परख का उपयोग करना, हम जारी NGF (चित्रा 4 बी) की bioactivity की जांच की। पीसीएल-आईपीसी समग्र पाड़ रिहाई मीडिया पर हो PC12 कोशिकाओं के neurite परिणाम 30 एनजी में सुसंस्कृत PC12 कोशिकाओं के साथ समान स्तर से पता चला / एमएल NGF मीडिया पूरक। यह जारी किया NGF कम से कम 7 दिनों के लिए बायोएक्टिव बना रहा है कि इंगित करता है।

स्थलाकृति का संयोजन और सतत विकास कारक प्रसव बेहतर सेलुलर microenvironment नकल कर सकते हैं। पीसीएल-आईपीसी निर्माण की बहुमुखी कार्यप्रणाली एक biochemically- और भौगोलिक विवरण के अनुसार नियंत्रित समग्र पाड़ के निर्माण की अनुमति दी। हम नैनो आकार gratings संरचना (एनपी पीसीएल-आईपीसी पाड़) के साथ एक पीसीएल-आईपीसी समग्र पाड़ गढ़े। हम सहक्रियाशील एफई मनायास्थलाकृति के fect और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSCs) (चित्रा 5) के neuronal भेदभाव का आकलन करने से NGF रिहाई निरंतर। एनपी पीसीएल-आईपीसी समग्र मचान पर संवर्धित hMSCs neuronal भेदभाव का संकेत microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) के उच्च अभिव्यक्ति, दिखाया। दूसरी ओर, MAP2 प्रोटीन अभिव्यक्ति केवल NGF रिहाई या नमूनों PCL (एनपी पीसीएल) के साथ पीसीएल-आईपीसी पर संवर्धित hMSCs में काफी कम था।

चित्र 1
हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक मचान में आईपीसी फाइबर की चित्रा 1. निगमन। सकारात्मक (chitosan) के इंटरफेस पर आईपीसी फाइबर की (ए) आहरण और नकारात्मक (alginate) का आरोप लगाया polyelectrolyte समाधान। (बी) पी.डी. आईपीसी composit बनाने के लिए हाइड्रोफिलिक पीडी समाधान में आईपीसी तंतुओं का समावेश दिखा योजनाबद्ध आरेख ई पाड़। हाइड्रोफोबिक PCL के पाड़ में आईपीसी तंतुओं का समावेश दिखा रहा है (सी) योजनाबद्ध आरेख पीसीएल-आईपीसी समग्र पाड़ बनाने के लिए। यह आंकड़ा Cutiongco एट अल। से अनुकूलित है, 2014 में 7 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
पीडी-आईपीसी समग्र पाड़। बीएसए से बीएसए की चित्रा 2. नियंत्रित रिलीज पी.डी. आईपीसी समग्र मचान में शामिल किया गया था और इसकी रिलीज बीसीए परख का उपयोग कर विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा गया था। जारी की संचयी बीएसए आईपीसी तंतुओं में शामिल (g में) बीएसए की कुल राशि का एक प्रतिशत के रूप में प्रदान की जाती है और मानक विचलन ± के रूप में मतलब प्रतिशत प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा Cutiongco एट अल से अनुकूलित है।, 2014 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. नियंत्रित रिलीज और पीडी-आईपीसी समग्र पाड़ से वीईजीएफ़ की bioactivity। (ए) पी.डी. आईपीसी समग्र मचान से वीईजीएफ़ का संचयी रिहाई प्रोफ़ाइल। वीईजीएफ़ रिहाई वीईजीएफ़ के लिए एलिसा विशिष्ट का उपयोग कर विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा गया था। Alamar नीले चयापचय परख द्वारा मापा जाता है, के रूप में पीडी-आईपीसी समग्र मचान पर हो endothelial कोशिकाओं (बी) सेल व्यवहार्यता। सांख्यिकीय विश्लेषण Tukey की पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग किया गया था। * पी <0.05 अर्थ। यह आंकड़ा Cutiongco एट अल से अनुकूलित है।, 2014 में 7 एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।

चित्रा 4
चित्रा 4. नियंत्रित रिलीज और पीसीएल-आईपीसी समग्र पाड़ से NGF की bioactivity। (ए) पीसीएल-आईपीसी समग्र मचान से NGF का संचयी रिहाई प्रोफ़ाइल। NGF रिहाई NGF के लिए एलिसा विशिष्ट का उपयोग कर विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा गया था। 'सम्मिलित पहले 8 घंटे के लिए पीसीएल-आईपीसी पाड़ से NGF की संचयी रिहाई प्रोफाइल से पता चलता है। NGF (बी) bioactivity PC12 तंत्रिका कोशिकाओं के परिणाम द्वारा मापा। PC12 परिणाम छवि विश्लेषण के माध्यम से मापा गया था। यह आंकड़ा तियो एट अल। से अनुकूलित है, 2014 में 2 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जेपीजी "/>
चित्रा एनपी पीसीएल-आईपीसी पाड़ पर hMSC 5. भेदभाव। HMSC के confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग छवि अलग समग्र मचान पर सुसंस्कृत। (ए) एनपी पीसीएल-आईपीसी, (बी) एनपी पीसीएल, (सी) पीसीएल-आईपीसी, (डी) प्राचीन PCL के मचान। ग्रीन दाग MAP2, एक neuronal वंश मार्कर अर्थ। लाल दाग सेलुलर cytoskeleton दिखा, एफ actin अर्थ। ब्लू दाग नाभिक को दर्शाता है। यह आंकड़ा तियो एट अल। से अनुकूलित है, 2014 में 2 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टेबल समग्र आईपीसी मचान से नियंत्रित रिहाई के लिए इस्तेमाल जैव रसायनों के 1. लक्षण।

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Discussion

आईपीसी तंतुओं दो विपरीत आरोप लगाया polyelectrolytes की बातचीत से बनते हैं। प्रक्रिया स्थिर फाइबर गठन के लिए एक आत्म विधानसभा की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने, polyelectrolytes के इंटरफ़ेस से जटिल की निकासी का इस्तेमाल करता है। आईपीसी फाइबर गठन के तंत्र एक इसी तरह का आरोप लगाया polyelectrolyte complexation प्रक्रिया के दौरान शामिल किया जा सकता है में किसी भी बायोमोलिक्यूल कहा कि यह सुनिश्चित करता है। 10,11 इसके विपरीत, oppositely आरोप लगाया polyelectrolyte में एक बायोमोलिक्यूल के अलावा तात्कालिक वर्षा में परिणाम होगा। आईपीसी फाइबर के लिए सरल निर्माण पद्धति ऐसी कोशिकाओं, वृद्धि कारक है और छोटे अणुओं के रूप में विभिन्न जैविक सामग्री को शामिल करने में बहुमुखी प्रतिभा के लिए उधार देता है। आईपीसी तंतुओं के इस महत्वपूर्ण सुविधा भी विभिन्न शारीरिक और biomolecular गुण (प्रभारी और आणविक वजन) के साथ वृद्धि कारकों उच्च दक्षता के साथ शामिल किया गया है, जहां पी.डी. आईपीसी और पीसीएल-आईपीसी समग्र मचान, दोनों में मनाया गया। कॉन्ट्रा मेंअनुसूचित जनजाति, वीईजीएफ़ और NGF के लिए microsphere तरीकों का उपयोग कर encapsulation के दक्षता क्रमश: 16% 6 और 8% के रूप में 13 के रूप में कम हो सकता है।

पीडी भारतीय दंड संहिता और पीसीएल-आईपीसी scaffolds के दोनों भी बायोमोलिक्यूल रिहाई के अस्थायी नियंत्रण का प्रदर्शन किया। पीडी-आईपीसी मचान से वीईजीएफ़ कम से कम 7 दिनों के लिए रेखीय रिहाई दिखाया। इसके विपरीत, बहुलक microspheres से वीईजीएफ़ रिहाई के प्रोफाइल कुल वीईजीएफ़ सामग्री के कम से कम 60% रिहा, 24 घंटे के भीतर एक प्रारंभिक फट रिलीज से पता चला है की सूचना दी। 5,14,15 इसी तरह, NGF पीसीएल-आईपीसी से वृद्धि कारक वितरण निरंतर दिखाया गया था मचान, अन्य पोलीमेरिक-आधारित विकास का पहलू वितरण प्रणाली रिहाई के 20 दिनों से जारी होने के एक पठार दिखा है। 13,16 मुमकिन है, समग्र scaffolds के विभिन्न घटकों के दोनों वृद्धि कारक रिलीज कैनेटीक्स के लिए योगदान करते हैं। पॉलिमर विश्राम तंत्र, porosity और टेढ़ा-मेढ़ापन बहुत हाइड्रोफिलिक biomolecules के रिलीज को प्रभावित कर सकते हैं। 17 इसके अलावा, गपोलीमेरिक पाड़ की hemical विशेषताओं बायोमोलिक्यूल रिहाई को प्रभावित करता है कि वृद्धि कारकों के प्रति electrostatic आकर्षण और प्रतिकर्षण पड़ सकता है। इस प्रकार, बहुलक पाड़ की विशेषताओं अस्थायी नियंत्रित रिलीज के साथ रिलीज प्रोफाइल और biomolecules का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हैं। पीडी पाड़ पॉलि (विनाइल शराब) का उपयोग कर के पास रेखीय बीएसए विज्ञप्ति जारी की, इसी तरह की एक समग्र पाड़ से पता चला है, जबकि उदाहरण के लिए, हाइड्रोजेल बीएसए को पारगम्यता कमी रह गई थी। इसके पारगम्यता निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक परीक्षण की आवश्यकता हो सकती आईपीसी फाइबर के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है कि 18 Polymeric मचान सीमा होती है।

नियंत्रित जैव रासायनिक रिहाई के अलावा, विकास कारकों की bioactivity बनाए रखने के लिए क्षमता किसी भी बायोमोलिक्यूल वितरण प्रणाली के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है। पीडी समाधान की कठोर क्षारीय पर्यावरण और पीसीएल में जैविक डीसीएम विलायक की उपस्थिति biomolecules के किसी भी प्रकार से नीचा करने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, Microsphere वितरण कीdichloromethane प्रयोग किया जाता है कि ystem कारण NGF की गिरावट के timepoint बढ़ाने के साथ bioactivity ह्रासमान के अनुरूप एक प्रवृत्ति देखी गई। 16 बहरहाल, हम वीईजीएफ़ और NGF की bioactivity आगे आईपीसी फाइबर का एक प्रमुख लाभ समग्र भीतर आत्मसात कर रहे हैं कि दोहराते हुए बनाए रखा है कि मनाया मचान।

आसानी से थोक पाड़ में शामिल किया जा सकता है कि एक बलि biocompatible, पॉलीसैक्राइड या polymeric फ्रेम का उपयोग अलग अलग विन्यास में गठबंधन एकाधिक आईपीसी फाइबर के साथ एक समग्र पाड़ बनाने के लिए बहुमुखी प्रतिभा देता है। 7 इस प्रकार, यह पोलीमेरिक scaffolds के लागू होने के लिए आवश्यक है कि आईपीसी फाइबर के साथ एक थोक पाड़ में आगे आत्मसात के लिए क्षमता है। आत्मसात प्रक्रिया पूरी तरह से polymeric पाड़ में आईपीसी तंतुओं को एम्बेड में महत्वपूर्ण है। हम दोनों को आसानी से थोक पीडी के विलायक या में भंग कर रहे थे, जो बलि पुलुलान और PCL के फ्रेम, में इस घटना मनायापीसीएल पाड़। इसके अलावा, भारतीय दंड विधान निर्माण और बायोमोलिक्यूल शामिल करने के लिए एक कदम विधि एक समग्र पाड़ द्वारा दिया जा सकता है कि biomolecules के नंबर करने के लिए लचीलापन देता है। कार्यप्रणाली की सादगी भी polyelectrolyte पहचान या एकाग्रता बदलकर समावेश दक्षता और रिलीज कैनेटीक्स के ठीक ट्यूनिंग की अनुमति देता है। प्राकृतिक polyelectrolytes chitosan और alginate जानवरों के ऊतकों में पाया विभिन्न ईसीएम कार्बोहाइड्रेट करने के लिए अपने उच्च घनत्व और आरोप समानता की वजह से इस्तेमाल किया गया। फिर भी methylated कोलेजन और terpolymer 8,19 या काइटिन और alginate 20 भी अलग-अलग प्रभाव के लिए भारतीय दंड संहिता फाइबर गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अलग कैनेटीक्स भी एक बहुआयामी समग्र पाड़ बनाने के लिए प्राप्त किया जा सकता है के साथ एकाधिक आईपीसी तंतुओं विभिन्न जैव रासायनिक संकेतों जारी। उदाहरण के लिए, भारतीय दंड विधान तंतुओं में भरी हुई ऐसी फ़ाइब्रोनेक्टिन के रूप में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन spatially नियंत्रित कोशिका आसंजन के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है। 7 निरंतरएंटीबायोटिक दवाओं और वृद्धि कारकों की रिहाई भी ऊतक पुनर्जनन अनुप्रयोगों के लिए वांछित हैं। इस हाइड्रोफोबिक, छोटे अणु दवाओं और समग्र पाड़ के विभिन्न डिब्बों में हाइड्रोफिलिक, प्रोटीन आधारित वृद्धि कारकों को शामिल कर सकते हैं जो पीसीएल-आईपीसी, का उपयोग करके संभव हो सकता है। 2

हमारी प्रस्तुत कार्यप्रणाली भी स्थलाकृतिक और जैव रासायनिक संकेतों दोनों के साथ एक पाड़ के निर्माण की अनुमति दी। हम एनपी पीसीएल-आईपीसी पाड़ जैवभौतिक और जैव रासायनिक सेलुलर आला के कई पहलुओं की नकल उतार सेल व्यवहार निर्देशन में लाभकारी है जिसका अर्थ है कि न्यूरोनल वंश में hMSC भेदभाव के उच्चतम वृद्धि की थी कि मनाया। प्रस्तुत कार्यप्रणाली की आसानी crosslinking प्रक्रिया काफी आईपीसी फाइबर अखंडता को प्रभावित नहीं करेगा, बशर्ते कि इस तरह के polyacrylamide 21 या पॉलीथीन ग्लाइकोल 22 के रूप में अन्य patternable पोलीमेरिक सिस्टम, के लिए अपने आवेदन अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, पीडी scaffolds के CH थेपरिवेश और जलीय स्थितियों में होता है कि अपनी अनूठी crosslinking के तंत्र के लिए इस अध्ययन में Osen। 24 यह संभवतः अधिक physiologically में इन विट्रो के लिए और vivo अध्ययन में प्रासंगिक substrates के प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, एक समग्र पाड़ में आईपीसी तंतुओं को एम्बेड तन्य शक्ति प्रदान करके आईपीसी तंतुओं 23 के यांत्रिक शक्ति की कमी को दूर कर सकते हैं। दरअसल, PCL 25 है अपने उच्च यांत्रिक शक्ति के लिए चुना गया था।

सारांश में, बायोमोलिक्यूल प्रसव के लिए समग्र मचान बनाने के लिए एक सरल तरीका बताया गया था। हम अपने bioactivity और समावेश दक्षता समझौता किए बिना biomolecules के निरंतर वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे भारतीय दंड संहिता तंतुओं का प्रदर्शन किया। पीडी भारतीय दंड संहिता और पीसीएल-आईपीसी मचान: हम दो रूपों के साथ समग्र मचान बनाने के द्वारा यह पता चला है। आईपीसी फाइबर की प्रयोज्यता PD- और पीसीएल-आधारित scaffolds में समावेश करने के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन संभावित अन्य पोलीमेरिक प्रणालियों के लिए बढ़ाया जा सकता हैऔर अन्य biomolecules देने के लिए।

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Acknowledgments

यह काम अपनी उत्कृष्टता के अनुसंधान केन्द्रों, Mechanobiology संस्थान, सिंगापुर में से एक ने दिलाई सिंगापुर नेशनल रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। MFAC 1122703037. BKKT Mechanobiology संस्थान द्वारा समर्थित है, अनुसंधान के लिए विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान के लिए एजेंसी (सिंगापुर) और राष्ट्रीय एजेंसी (फ्रांस) परियोजना संख्या के तहत संयुक्त कार्यक्रम के द्वारा समर्थित है। हम प्रूफ रीडिंग वीडियो उत्पादन में सहायता के लिए पांडुलिपि और सुश्री डॉन झा नव के लिए श्री डेनियल कोर्ट वोंग धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pullulan  Hayashibara Inc Okayama Japan Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds.
Dextran Sigma Aldrich D1037 MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds.
Sodium Bicarbonate  Sigma Aldrich S5761 Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. 
Sodium Trimetaphosphate Sigma Aldrich T5508 This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh.
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S5881 This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves.
Chitosan Sigma Aldrich 448877 MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers.
Acetic Acid Merck This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. 
Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity Sigma Aldrich A2158 Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C.
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. 
BCA assay kit Pierce 23225 This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. 
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor R&D systems 293-VE Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml.
Heparin Sodium Salt From Porcine Sigma Aldrich H3393 This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. 
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Lonza C2517A This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. 
Alamar blue Life Technologies DAL1025 This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. 
ScanVac Coolsafe Lyophilizer Labogene 7.001.200.060 This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers.
Polycaprolactone (PCL) Sigma Aldrich 181609 MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105.
Dichloromethane Sigma Aldrich V800151 This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical.
Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) Dow Corning (240)4019862 The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS.
Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) R&D systems 256-GF Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg⁠/⁠ml. Aliquot and store in -20 °C until use.
Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) Cambrex This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography.
Rat PC12 Pheochromocytoma Cells  ATCC This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells.
Grade 93 filter paper Whatman Z699675 This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7.
Swing bucket centrifuge Eppendorf 5810R To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed.
Motor with mandrel rotating at constant speed Rhymebus RM5E The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame.
Phosphate buffered saline FirstBase Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. 
10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) Greiner The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. 
Human VEGF ELISA kit R&D systems DVE00 The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium.
Human NGF ELISA kit R&D systems DY256 The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium.
Plastic Coated Adhesive Tape Bel-Art 9040336 The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 102 समग्र पाड़ पॉलिमर हाइड्रोजेल जैव रसायनों encapsulation अस्थायी स्थानिक निरंतर जारी स्थलाकृति
Biomolecules के अस्थायी नियंत्रित रिलीज के लिए Interfacial polyelectrolyte तंतुओं का समग्र Scaffolds
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Cutiongco, M. F. A., Teo, B. K. K., Yim, E. K. F. Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules. J. Vis. Exp. (102), e53079, doi:10.3791/53079 (2015).

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