Protocol
1. Preparación de Soluciones Polyelectrolyte
- Purificar quitosano, como se detalla en Liao et al. Brevemente, crear un 1% (w / v) de solución de quitosano en 2% (v / v) de filtro de ácido acético y vacío usando papel de filtro de grado 93. Neutralizar el filtrado usando NaOH 5 M hasta que el pH se estabilizó a 7. Centrifugar el quitosano precipitado a 1200 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante y añadir agua desionizada para lavar el quitosano. Repetir la etapa de centrifugación y lavado dos veces más. Congelar el quitosano precipitado a -80 ° C y se liofiliza O / N para obtener la forma purificada. Guarde quitosano purificada en un armario deshumidificado.
- Pesar 1 g de quitosano purificado en una placa de cultivo de tejido estéril. Coloque el quitosano en el cultivo de tejidos plato tan cerca como sea posible a la lámpara UV en la cabina de seguridad biológica y exponer a luz UV durante 15 min. Con unas pinzas estériles, coloque el quitosano esterilizados en un recipiente de vidrio. Disolver quitosano utilizando filtró 0.15M ácido acético a una concentración final entre 0,5% y 1% (w / v).
- Pesar 0,1 g de sal sódica del ácido algínico y disolver en 10 ml agua desionizada (DDI) de agua destilada para obtener un 1% (w / v) solución. Mezclar la sal sódica del ácido algínico durante al menos 2 horas en el mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. Se filtra la solución de alginato a través de filtro de jeringa de 0,2 micras. Guarde la solución de alginato a 4 ° C.
- Reconstituir factores recombinantes humanas de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o beta - factor de crecimiento nervioso (NGF), según lo recomendado por el fabricante.
2. Dibujo de Fibras IPC
- Mezclar proteínas, factores de crecimiento u otras biomoléculas en 10-20 l alícuota de la solución de polielectrolito que tiene una carga neta similar. Las moléculas biológicas con carga negativa (por ejemplo, albúmina de suero bovino [BSA]) net deben mezclarse con la solución de alginato. Las moléculas biológicas con carga positiva neta (por ejemplo, VEGF) se deben mezclar consolución de quitosano.
- Coloque pequeñas alícuotas (10-20 mu l) de quitosano y alginato en una superficie plana y estable que está cubierta con parafilm. Las gotitas de quitosano y alginato deben ser colocados en estrecha proximidad pero no en contacto uno con el otro.
- Ligeramente moje cada punta en un par de pinzas en las gotitas de quitosano y alginato. Traiga las gotitas de polielectrolitos juntos pellizcando los fórceps. Cuando las gotas entran en contacto uno con el otro, tire lentamente el fórceps verticalmente hacia arriba para extraer la fibra IPC desde la interfaz de las dos gotas (figura 1A).
- Coloque con cuidado el extremo de la fibra IPC dibujado en la pinza en un colector, como un andamio polimérica plana colocada sobre un mandril giratorio (véase la sección 3 y 4). Girar el mandril a una velocidad fija de 10 mm / seg para permitir la formación de fibras uniforme y beadless IPC. El aumento de la velocidad de dibujo las fibras IPC formar perlas, lo que provocará una liberación por reventamiento de incorporadoterminación de fibra bioquímica y prematura. 10
- Para determinar la eficiencia de incorporación, recoger todos los líquidos restantes quedan en el Parafilm diluyendo con 500 l de 1X tampón fosfato salino (PBS). Mida el contenido de proteína o factor de crecimiento en el residuo a través de ensayo BCA (para BSA), ELISA (por VEGF y NGF) o un ensayo apropiado para detectar biomolécula incorporado.
3. Fabricación de Compuesto de hidrogel Cadalso de pululano-dextrano (PD) Polisacárido y Fibras IPC
- Fabricación marco pululano sacrificio para la recolección de fibra IPC
- Pesar polisacárido pululano y mezclar con agua desionizada destilada (DDI) agua para crear un 20% (w / v) solución acuosa. Mezclar la solución de pululano O / N para asegurar la homogeneidad.
- Reparto de 15 g de solución de pululano en un 10 cm de diámetro de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) plato. Secar la solución de pululano O / N a 37 ° C. Cortar las películas de pululano en 7mm x 7 mm marcos cuadrados.
- Preparación de solución de polisacárido pululano-dextrano
- Crear un 30% (w / v) solución de los polisacáridos pululano y dextrano (3: 1 ratio) en agua DDI. Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución de polisacárido. Añadir lentamente en bicarbonato de sodio a la solución de polisacárido para lograr una concentración final de 20% (w / v). Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución. Guarde la solución de polisacárido a 4 ° C.
- Recogida de fibras IPC en marco pululano
- Fije el bastidor pululano sacrificial (sección 3.1) utilizando una pinza. Pegar la pinza de cocodrilo y el marco de pululano en el extremo del mandril giratorio con cinta adhesiva recubierta de plástico. Girar el mandril con el marco fijada a una velocidad constante de 10 mm / seg. El marco de pululano se puede fijar sobre el mandril giratorio en orientaciones deseadas.
- Dibuje las fibras IPC utilizando un par de pinzas (sección 1) y ATTACh al final elaborado de las fibras del IPC sobre el marco pululano rotativo. Dibuje las fibras IPC a una velocidad constante. Al llegar a la terminal de la fibra de IPC, secar el constructo O fibras sobre bastidor / N a temperatura ambiente.
- Incorporación de fibras IPC en andamio hidrogel PD
- Para reticular cada gramo de solución de pululano dextrano, añadir 100 l de 11% (w / v) de sodio trimetafosfato solución acuosa y 100 l de hidróxido de sodio 10M. 7 Mezclar la solución a 60 rpm utilizando una placa agitadora durante 1 a 2 min. Después de la adición de trimetafosfato de sodio y el hidróxido de sodio, la solución de polisacárido se reticular casi inmediatamente. Vierta la solución de polisacárido viscoso en la construcción fibras sobre bastidor para incrustar totalmente las fibras del IPC. Incubar las fibras pululano-dextrano-IPC combinados (PD-IPC) a 60 ° C durante 30 minutos para formar una andamios compuestos químicamente reticulado (Figura 1B).
- PRECAUCIÓN: Siga el paso 3.3.2 en la campana de extracción y el uso de equi protección adecuadopo como ácido acético es un corrosivo e inflamable.
- Para inducir la formación de poros en el andamio PD-IPC, sumergir todo el andamio en 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min.
- Retire los reactivos que no han reaccionado por lavado andamios-PD IPC en 1X PBS durante 5 min con agitación a 100 rpm. Repita este paso 2 veces.
- Retire el exceso de PBS y congelar inmediatamente los andamios-PD IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar los andamios de al menos 24 horas antes de su uso en cualquier ensayos de liberación o bioactividad controladas.
4. Fabricación de Andamios Compuesto de PCL y Fibras IPC
PRECAUCIÓN: El diclorometano es un material peligroso. Utilice la campana de humos y equipo de protección personal al manipular diclorometano.
- Creación de sustratos PDMS prístinas y estampados
- Crear un polidimetilsiloxano prístina (PDMS) de sustrato elastomérico con un trozo de TCPS de dimensión deseada utilizando el proceso de litografía blanda. Crear pattePDMS rned sustratos mediante el uso de métodos litográficos suaves estándar en poli (metacrilato de metilo) plantillas con la topografía deseada. 12
- La fabricación de sacrificio marco PCL para la recolección de fibra IPC
- Pesar PCL y disolver en diclorometano para crear un 0,9% (w / v) solución. Por cada 1 cm 2 área del sustrato PDMS, la caída de 500 l de solución PCL 0,9%. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos. Repetir el proceso de fundición 0,9% PCL para espesar la película hasta el grosor deseado. Retire la película PCL secado del sustrato PDMS. Crear un agujero en el marco de PCL utilizando un golpeador de dimensiones adecuadas. 2
- El cobro de las fibras del IPC en el marco de PCL
- Fije el bastidor PCL sacrificial con el agujero (de 4.2.1) en una pinza. Pegue la pinza sobre el mandril de rotación mediante el uso de cinta adhesiva recubierta de plástico. Conecte el extremo del trazado de la fibra del IPC en el fram PCLe antes de iniciar la rotación a una velocidad constante de 10 mm / seg (sección 2). Tras el final de dibujo fibra IPC, secar la fibra sobre bastidor constructo O / N a 4 ° C.
- Incorporación de fibra sobre bastidor construir en el sustrato PCL con dibujos
- Caída de 500 l de solución PCL 0,9% sobre el sustrato PDMS para crear una base de PCL prístina o modelado, según se requiera. Reparto de múltiples capas de solución PCL 0,9% para obtener un andamio con el espesor deseado. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos.
- Coloque la construcción de fibra sobre bastidor (sección 4.3.1) en la parte superior de la base de PCL. Añadir solución PCL 0,9% en los de fibra sobre bastidor construir varias veces para obtener el espesor deseado e incrustar totalmente las fibras de la CIP, la fabricación de un armazón de material compuesto PCL-IPC (Figura 1C).
5. Medición de la liberación de agentes biológicos del compuesto IPC Andamios
- Coloque compuesta PD-IPC oAndamios PCL-IPC y autónomos fibras IPC por separado en una placa de 24 pocillos.
- Sumerja el andamio y autónomos fibras IPC con 500 l de PBS 1X. Incubar las muestras a 37 ° C. Recoger PBS en diversos puntos temporales (medios de liberación) y reemplazar con 500 l de PBS 1X.
- Medir la cantidad de proteína o factor de crecimiento en los medios de liberación usando un ensayo de BCA (BSA), ELISA (VEGF y NGF) u otro ensayo apropiado para calcular el perfil de liberación acumulativo para la biomolécula incorporado.
6. La siembra de células en compuestos Andamios IPC para probar bioactividad de Agentes Biológicos Liberadas
- Esterilizar los andamios compuestos liofilizados PD-IPC o PCL-IPC utilizando luz UV en la cabina de seguridad biológica durante al menos 20 min.
- Usar técnicas de cultivo celular estándar para obtener una suspensión celular de 2 x 10 5 células en medios de crecimiento 200 l. Semillas de la suspensión celular concentrada en los andamios compuestos. After 20 min, recarga el volumen de medio de cultivo para sumergir totalmente los andamios.
- Medir la actividad celular a través de técnicas estándar, tales como ensayo de actividad de Alamar azul metabólica, ensayo de crecimiento de neuritas PC12 o inmunofluorescencia.
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Representative Results
En este artículo, hemos tratado de crear los andamios compuestos con fibras de IPC para la liberación sostenida de diversas biomoléculas. Características de las biomoléculas utilizados en este estudio se encuentran en la Tabla 1. IPC fibras se incrustaron primero en un hidrogel hidrófilo PD para crear un armazón de material compuesto PD-IPC (Figura 1B). Molécula Modelo BSA fue probado primero para determinar la viabilidad de utilizar un armazón de material compuesto para la liberación controlada de biomoléculas. BSA se incorporó en andamios PD-IPC con una eficiencia del 45 ± 0,97%. BSA liberado de la PD-IPD mostró una cinética casi lineales con una versión atenuada de ráfaga inicial seguida de un estado estacionario concomitante (Figura 2). Después de 2 meses, BSA logró una liberación total del 97%. En contraste, las fibras IPC independientes mostraron una rápida liberación de 80% de BSA dentro de 4 hr.
A continuación, nos registramos el perfil de liberación y bioactividad de VEGF utilizando PD-IPC Scaffolds. VEGF fue incorporada con una eficiencia del 75,5 ± 2,7%, y mostró una liberación sostenida durante al menos 1 semana (Figura 3A). Células endoteliales de vena umbilical Humanos (HUVEC) fueron sembradas en los andamios-PD IPC para determinar la bioactividad de VEGF. HUVECs en los andamios-PD IPC mostró un aumento significativo en la reducción de azul Alamar y la actividad metabólica en comparación con los andamios PD lisos en el día 1, lo que indica una buena preservación de la función de VEGF después de ser liberado de los andamios PD-IPC (Figura 3B). Reducción de azul Alamar al día 3, 6 y 7 se redujo hasta alcanzar niveles comparables con el andamio PD normal (Figura 3B).
Los andamios compuestos PCL-IPC se ensayaron también para la liberación controlada y se compararon con fibras IPC independientes. Incorporamos NGF como una molécula representativa en los andamios compuestos PCL-IPC con una eficiencia incorporación de 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC andamios compuestos mostró líneaar liberación sostenida y aproximadamente 80% de liberación acumulada después de 18 días (Figura 4A). Por otro lado, IPC stand-alone fibra mostró una liberación por reventamiento 70% dentro de 24 horas seguido por una velocidad de liberación estancada. El uso de un ensayo de crecimiento de neuritas PC12, se analizó la bioactividad del NGF liberado (Figura 4B). El crecimiento de las neuritas de las células PC12 cultivadas en PCL-IPC armazón de material compuesto medios de liberación mostró niveles similares con células PC12 cultivadas en 30 ng / ml de NGF complementado medios de comunicación. Esto indica que el NGF liberado permaneció bioactivo durante al menos 7 días.
La combinación de la topografía y la entrega del factor de crecimiento sostenido pueden imitar el microambiente celular mejor. La metodología versátil de fabricación PCL-IPC permitió la fabricación de un armazón de material compuesto biochemically- y controlada topográficamente. Hemos fabricado un armazón de material compuesto PCL-IPC con estructura de rejillas de tamaño nanométrico (NP-PCL-IPC andamio). Observamos la ef sinérgicafect de la topografía y la liberación sostenida de NGF mediante la evaluación de la diferenciación neuronal de las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) (Figura 5). hMSCs cultivadas en los andamios compuestos NP-PCL-IPC mostraron una mayor expresión de la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), indicativo de la diferenciación neuronal. Por otro lado, MAP2 expresión de la proteína fue sustancialmente menor en hMSCs cultivadas en PCL-IPC con solamente liberación NGF o PCL modelado (NP-PCL).
Figura 1. Incorporación de fibras IPC en andamios hidrófilos e hidrófobos. (A) Dibujo de fibras IPC en la interfaz de positivamente (quitosano) y negativamente (alginato) soluciones de polielectrolitos cargados. (B) Diagrama esquemático que muestra la incorporación de fibras de IPC en solución PD hidrófila para crear PD-IPC composit e andamio. (C) Diagrama esquemático que muestra la incorporación de fibras de IPC en hidrofóbica andamio PCL para crear PCL-IPC armazón de material compuesto. Esta figura es una adaptación de Cutiongco et al., 2014. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La liberación controlada de BSA a partir de PD-IPC armazón de material compuesto. BSA se incorporó en PD-IPC andamios compuestos y su liberación se midió en varios puntos de tiempo usando el ensayo BCA. BSA acumulativa liberada se proporciona como un porcentaje de la cantidad total de BSA (en microgramos) incorporado en las fibras de la CIP y se presentan porcentaje como media ± desviación estándar. Esta figura es una adaptación de Cutiongco et al., 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Controlado liberación y bioactividad de VEGF de PD-IPC armazón de material compuesto. (A) perfil de liberación acumulada de VEGF de PD-IPC andamios compuestos. La liberación de VEGF se midió en varios puntos de tiempo utilizando ELISA específico para VEGF. (B) La viabilidad celular de las células endoteliales cultivadas en PD-IPC andamios compuestos, tal como se mide mediante el ensayo metabólico azul Alamar. Análisis estadístico se realizó utilizando un modelo lineal con la prueba post-hoc de Tukey. * Denota p <0,05. Esta figura es una adaptación de Cutiongco et al., 2014. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4. Controlado liberación y bioactividad de NGF de PCL-IPC armazón de material compuesto. (A) perfil de liberación acumulada de NGF de PCL-IPC andamios compuestos. NGF de liberación se midió en varios puntos de tiempo utilizando ELISA específico para NGF. Insertar muestra el perfil de liberación acumulada de NGF de PCL-IPC andamio para la primera de 8 horas. (B) bioactividad de NGF tal como se mide por derivación de células neuronales PC12. PC12 excrecencia se midió a través de análisis de imagen. Esta figura es una adaptación de Teo et al., 2014. 2 Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5. La diferenciación de hMSC en NP-PCL-IPC andamio. Imagen de microscopía confocal de barrido de hMSC cultivadas en diferentes andamios compuestos. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) andamios PCL prístinas. Mancha verde denota MAP2, un marcador de linaje neuronal. Mancha roja denota F-actina, que muestra el citoesqueleto celular. Mancha azul denota el núcleo. Esta figura es una adaptación de Teo et al., 2014. 2 Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Características de los productos bioquímicos utilizados para la liberación controlada de andamios IPC compuestos.
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Discussion
IPC fibras se forman por la interacción de dos polielectrolitos con cargas opuestas. El proceso utiliza la extracción del complejo desde la interfaz de los polielectrolitos, facilitando un proceso de autoensamblaje para la formación de fibras estable. El mecanismo de formación de la fibra IPC asegura que cualquier biomolécula añadió en un polielectrolito cargado de manera similar se puede incorporar durante el proceso de complejación. 10,11 A la inversa, la adición de una biomolécula en el polielectrolito de carga opuesta se traducirá en la precipitación instantánea. La metodología de fabricación simple para fibras IPC presta versatilidad en la incorporación de diversos materiales biológicos tales como células, factores de crecimiento y moléculas pequeñas. Esta característica crítica de fibras IPC también se observó tanto en los andamios compuestos PD-IPC y PCL-IPC, en los que se incorporan factores de crecimiento con diferentes propiedades físicas y biomoleculares (carga y peso molecular) con una alta eficiencia. En contrast, eficiencia de encapsulación usando metodologías de microesferas para VEGF y NGF puede ser tan bajo como 16% y 8% 6 13, respectivamente.
Tanto PD-IPC y andamios PCL-IPC también demostraron control temporal de la liberación de biomoléculas. VEGF de andamios PD-IPC mostró liberación lineal durante al menos 7 días. En contraste, informaron perfiles de liberación de VEGF a partir de microesferas poliméricas mostraron una liberación inicial de ráfaga dentro de 24 hr, la liberación de al menos 60% del contenido total de VEGF. 5,14,15 Del mismo modo, el NGF ha demostrado tener sostenido entrega del factor de crecimiento de PCL-IPC andamios, mientras que otros sistemas de administración del factor de crecimiento a base de polímeros muestran una meseta de liberación de 20 días de liberación. 13,16 Presumiblemente, los diferentes componentes de los andamios compuestos tanto contribuyen a la cinética de liberación de factores de crecimiento. Mecanismos de relajación del polímero, la porosidad y tortuosidad pueden afectar en gran medida la liberación de biomoléculas hidrófilas. 17 Además, la ccaracterísticas hemical del andamio polimérico pueden tener atracción electrostática y repulsión hacia los factores de crecimiento que afecta la liberación de biomoléculas. Por lo tanto, las características del andamio polimérico son críticos en la determinación de perfiles de liberación y biomoléculas con liberación controlada temporalmente. Por ejemplo, mientras que el andamio PD mostró una liberación casi lineal BSA, un armazón de material compuesto similar utilizando poli (alcohol vinílico) de hidrogel carecía de la permeabilidad a BSA. 18 andamios poliméricos que se pueden utilizar en combinación con fibras IPC puede requerir pruebas preliminares para determinar su permeabilidad gama.
Además de liberación controlada bioquímica, la capacidad de retener la bioactividad de los factores de crecimiento es una característica importante para cualquier sistema de entrega de biomolécula. El ambiente alcalino duro de la solución de PD y la presencia de disolvente orgánico en DCM PCL tienen el potencial de degradar cualquier tipo de biomoléculas. Por ejemplo, s la entrega de microesferasistema que utiliza diclorometano mostró una tendencia consistente de disminuir con el aumento de la bioactividad punto de tiempo debido a la degradación de NGF. 16 Sin embargo, se observó que se mantiene la bioactividad de VEGF y NGF, reiterando además que una ventaja clave de fibras IPC se asimilan dentro del material compuesto andamios.
El uso de un polisacárido biocompatible sacrificial o marco polimérico que se puede incorporar fácilmente en el andamio mayor da la versatilidad para crear un armazón de material compuesto con múltiples fibras IPC alineados en diferentes configuraciones. 7 Por lo tanto, es necesario que los andamios poliméricos que han de aplicarse con fibras IPC tener la capacidad para una mayor asimilación en un andamio a granel. El proceso de asimilación es importante en la incorporación de fibras totalmente IPC en el armazón polimérico. Hemos observado este fenómeno en el pululano sacrificial y marcos de PCL, que fueron tanto fácilmente disuelto en el disolvente de la PD a granel oAndamio PCL. Además, el método de un solo paso para IPC fabricación y biomolécula incorporación da flexibilidad a la cantidad de biomoléculas que pueden ser entregados por una sola armazón de material compuesto. La simplicidad de la metodología también permite el ajuste fino de los de eficiencia incorporación y liberación cinética mediante el cambio de identidad polielectrolito o concentración. El quitosano polielectrolitos naturales y alginato fueron utilizados debido a su alta densidad de carga y similitud con diversos hidratos de carbono de ECM han encontrado en los tejidos animales. Sin embargo, el colágeno metilado y terpolímero de 8,19 o quitina y alginato 20 también pueden utilizarse para la formación de fibras IPC a efectos variables. Fibras IPC Múltiples liberan diferentes señales bioquímicas con diferentes cinéticas también se puede lograr para crear un armazón de material compuesto multi-funcional. Por ejemplo, las proteínas de la matriz extracelular, como fibronectina cargados en fibras IPC pueden proporcionar una plataforma para la adhesión celular espacialmente controlada. 7 Sostenidaliberación de antibióticos y factores de crecimiento también son deseables para aplicaciones de regeneración tisular. Esto puede ser posible mediante el uso de PCL-IPC, que puede incorporar hidrófobos, fármacos de moléculas pequeñas y factores hidrófilos, a base de proteínas de crecimiento en diferentes compartimentos de la armazón de material compuesto. 2
Nuestra metodología presentada también permite la fabricación de un andamio con ambas señales topográficas y bioquímicos. Hemos observado que el andamio NP-PCL-IPC tuvo el mayor aumento de la diferenciación de hMSC en el linaje neuronal, lo que implica que imitando múltiples aspectos de la nicho celular biofísicos y bioquímicos es beneficioso en la dirección de comportamiento de la célula. La facilidad de la metodología presentada permite su aplicación a otros sistemas poliméricos tales como poliacrilamida configurable 21 o polietilenglicol 22, siempre que el proceso de reticulación no afectará significativamente integridad de la fibra IPC. Por ejemplo, andamios PD fueron chOsen en este estudio por su único mecanismo de reticulación que se produce en condiciones ambientales y acuosas. 24 Potencialmente, esto puede proporcionar más fisiológicamente relevantes para sustratos in vitro y en estudios in vivo. Además, la incorporación de fibras de IPC en un armazón de material compuesto puede superar la falta de resistencia mecánica de las fibras IPC 23 proporcionando resistencia a la tracción. De hecho, PCL 25 fue elegido por su alta resistencia mecánica.
En resumen, se describe un método simple para crear los andamios compuestos para la entrega biomolécula. Hemos demostrado cómo las fibras IPC se puede utilizar para la liberación sostenida de biomoléculas sin comprometer su bioactividad y la eficacia de incorporación. Demostramos esto creando andamios compuestos con dos variaciones: PD-IPC y andamios PCL-IPC. Aplicabilidad de fibras IPC no se limita a la incorporación en PD- y andamios basados en PCL, pero se puede extender potencialmente a otros sistemas poliméricosy entregar otras biomoléculas.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur administrada por uno de sus Centros de Investigación de Excelencia, el Instituto Mecanobiología, Singapur. MFAC con el apoyo de la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (Singapur) y la Agencia Nacional de Investigación (Francia) el programa conjunto con el número 1122703037. BKKT proyecto es apoyado por el Instituto Mecanobiología. Agradecemos al Sr. Daniel HC Wong para la prueba de lectura del manuscrito y la Sra Amanecer JH Neo para ayudar en la producción de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
