Introduction
ほとんどの細菌細胞は、両方のプランクトン（自由生活）と成長1の表面に付着した（固着）モードを採用することができます。成長の表面接続モードでは、細菌細胞が分泌し、バイオフィルムを形成するために、細胞外高分子物質（EPS）を大量に身を包みます。 EPSは、主にタンパク質、エキソポリサッカライド、外DNAで構成され、バイオフィルム形成2に不可欠です。これは、細菌が空間的に区別するために使用することが可能な物理的な足場として機能し、有害な環境条件と宿主応答から細菌を保護します。 EPSのさまざまなコンポーネントは、バイオフィルム形成3で異なる役割を持っており、EPSの成分の発現の変化は劇的にバイオフィルム構造体4 を改造することができます。 EPS成分も分子5のシグナルとして機能することができ、最近の研究では、それらの移動およびバイオフィルム差分を案内するために微生物細胞と相互作用する特定のEPSのコンポーネントを示していますerentiation 6-8。
EPSの研究は大きく、EPS 9,10の特定のコンポーネントで欠損変異によって生成したバイオフィルムの形態学的な分析に基づいて進んでいます。また、EPSは通常、マクロスケール（バルク特性評価）11で特徴づけられます。形態学的には、しかし、定量的なディテールやバルク特性評価を欠いて、平均値を返し、バイオフィルムの異質内に存在する詳細を失うことができます分析します。マイクロスケールでのEPSのメカニック特性のリアルタイム特性評価に進行する増加傾向が存在することになります。このプロトコルは、粒子追跡マイクロレオロジーは、 緑膿菌バイオフィルム4の粘弾性および有効な架橋のマトリックス成 分ペルとPSLエキソポリサッカライドの時空間的効果を決定することができる方法を示しています。
パッシブマイクロレオロジーは、簡単かつ安価であるRH日付12,13の材料の空間microrheologicalサンプリングの最高のスループットを提供eology方法。受動的なマイクロレオロジーでは、プローブ球体は、サンプル中に配置され、熱エネルギー（k BはT）によって駆動されるそれらのブラウン運動は、ビデオ顕微鏡が続きます。いくつかの粒子が同時に追跡することができ、粒子の時間依存座標は、従来のランダムウォークに従ってください。したがって、平均して、粒子は、同じ位置にとどまります。しかし、粒子の変位の標準偏差または平均二乗変位（MSD）は、ゼロではありません。粘性流体が流れているので、時間が進むにつれて、粘性流体中の粒子のMSDは、直線的に増加します。これとは対照的に、粘弾性又は弾性物質で見られる高分子架橋は、彼らが流れに抵抗するのに役立ち、かつ粒子がMSD曲線（ 図1A）でプラトーにつながる、その変位の限らになります。この観察は、関係を次のMSDαt
粒子の大きさ、密度、および表面化学はmicrorheological実験の正確な適用に重要である（この場合、バイオフィルムマトリックスのポリマーは、 図1Bを参照）について検討システムに関して選択されます。まず、粒子は、粒子自体よりもはるかに小さい構造を持つ物質のレオロジーを測定します。物質の構造は、粒子、額面の動きと同様の規模のものである場合ticleは、個々の構造の形状や向きによって乱されます。しかし、粒子の周囲の構造が非常に小さい場合、この効果は小さく、粒子（ 図1B）に均質な環境を提示し、平均化。第二に、粒子の密度は、媒体（1.05グラムml -1の水性媒体のための）沈降を回避し、慣性力が無視できるようにしていることのようになります。ポリスチレンラテックス粒子のほとんどは、上記の基準を満たしています。運動は、物質の構造と熱エネルギーとの衝突によって駆動される、ランダムであれば、粒子のMSDのレオロジー解釈にのみ有効ですとして理想的には、粒子がバイオフィルムマトリックスのポリマーと相互作用しません。これは、プローブ粒子は、プレバイオフィルムの成長表面に結合するか、バウンスする傾向があるかどうかをチェックすることによって観察することができます。しかし、バイオフィルムへの魅力の欠如にもかかわらず、粒子がマトリックスに組み込むことができる必要があります。また、バイオフィルムの物理化学的不均一性は、異なる粒子は、バイオフィルムの異なる領域におけるプローブとして、より適している可能性があります。したがって、異なるサイズおよび表面化学の粒子は、バイオフィルムに適用されるべきです。
このように、粒子のMSDは、異なる成分がレオロジーに寄与し、バイオフィルムの拡散方法に関する有用な情報を提供することができます。さらに、異なるプローブの使用は1つがバイオフィルムの空間の物理化学的不均一性に関する情報を導出することができます。この方法は、バイオフィルムの機械的特性に影響抗菌治療を試験するために使用される、またはバイオフィルムの機械的特性は、別の種の導入によって変更されたかを調査するために、混合種バイオフィルムに適用することができます。粒子のMSDはまた、バイオフィルムの分散を特徴付けるために有用であり得ます。このような研究は、潜在的にAバイオフィルムの治療を改善する、バイオフィルムの我々の理解に役立つであろうND便利な活動のためのバイオフィルムのエンジニアリング。
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Protocol
1.バイオフィルム栽培
- 細菌株の作製
- 1日前にバイオフィルムの栽培に、凍結した細菌培養物からの適切な成長培地2mlを接種することにより、浮遊性細菌培養液を準備します。ムコイドPのルリア-ブロス培地（10gのL -1のNaCl、10グラムL -1の酵母抽出物、および10gのL -1トリプトン）を使用します緑膿菌とそのΔ ペルとΔPSL欠損変異株。 37℃、200 rpmで振とうした条件で一晩インキュベートします。分光光度計を用いて0.40のOD 600に一晩培養を希釈します。
- 好ましくは、分解することなく、フローセルを撮像する顕微鏡部屋にすることができる移動局またはトロリーに、以前に記載14されたフローセルのセットアップを組み立てます。
- 2 Lまたは各フローセル5 Lボトルに無菌成長培地を準備します。最少培地M9（48ミリモルの Na 2 HPO 4、22 mMのを使用してくださいKH 2 PO 4、19 mMのNH 4 Clで、9のNaCl、2mMのMgSO 4を、および0.1mMのCaCl 2）Pの 0.04％グルコース（重量/容量）および0.2％（重量/容量）カザミノ酸）を補充し緑膿菌は、セルバイオフィルムを流します。
- マイクロ遠心チューブに小分け蛍光マイクロスフェアおよび9,391.2 gで遠心分離器で5分間滅菌H 2 Oにスピンダウン。前2 Lまたは5 L培地ボトルに増殖培地に添加するアジ化ナトリウム（消毒剤）を除去するために1ミリリットルの増殖培地中で上清と再懸濁を削除します。
注：マイクロスフェアの異なるサイズが異なる濃度で来て、指示に応じて希釈してください。例えば、2.18×10 6マイクロml -1の各粒子サイズのを与えるために直径1.0μmのマイクロスフェアの120μlを、0.5μmの直径のミクロスフェアと成長培地の2リットルに0.2μmの直径のミクロスフェアの0.96μlの15μlのを分散させます。 - upstを培地ボトルを取り付けフローセルの連増殖培地全体設定を通って流れることを可能にします。流れを停止し、フローセルチャンバーに希釈した一晩培養を注入。細菌が約5.5×10 -3 Mの秒 -1、または蠕動ポンプで8回転数の流量で成長培地の流れを継続する前に1時間カバーガラスの基層にアタッチすることを許可します。
注：バイオフィルムは、通常3-7日、室温（25℃）で栽培されています。 - また、静的な文化のセットアップのために、粒子と1ミリリットルの成長培地に一晩培養物10μlを加えることによって、微量遠心管中で一晩培養を100倍に希釈します。フローバイオフィルムに使用されるものに比べて約500倍の静的培養のための増殖培地中の粒子濃度を増やしフローセルバイオフィルムを常に補充される（例えば、増殖培地10mlに1.0μmの直径の球の600μLを洗浄し、再懸濁）粒子が、静置培養ではありません。
- 200を追加します。1; 8ウェルスライドチャンバーに粒子と希釈し一晩培養物のリットル。静的な条件の下で、37℃でインキュベートします。バイオフィルムは、通常、1日に栽培されています。バイオフィルムは、1日以上成長させると粒子と新鮮な増殖培地で毎日過ごした成長培地を交換してください。
2.顕微鏡
- 3日目と5日、蠕動ポンプからの流れを切り、顕微鏡室にフローセルのセットアップを持って来ます。フローからドリフト（環境の変化によって、系統誤差の原因）を防止するために、フローセルチャンバーの入口と出口の近くにチューブを固定します。正立顕微鏡の顕微鏡ステージ上にフローセルを置きます。
注：マイクロウェルのイメージングのために倒立顕微鏡を使用してください。 - 以下のために（3日目および5）さまざまな場所（微小コロニーとフラット未分化層）で、別の日に、バイオフィルムに埋め込まれたマイクロスフェアの動きのビデオを取るために40倍油浸対物レンズで蛍光顕微鏡を使用してください時間的・空間的な調査。長い時間をかけてイベントを調査するために、短い時間スケール（高速ダイナミクス毎秒25〜50フレームのフレームレートで例えば 1.5〜3分ビデオ）内で発生するイベント、低いフレームレートで長い動画を調査するために、高いフレームレートで短いビデオを撮影スケール（2.5〜5フレーム/遅いダイナミクスのための秒のフレームレートで例えば 15〜30分間のビデオ）。
注：ビデオは、典型的には5~10の粒子を含み、ファイルサイズ、典型的に1.0から2.5 GBのです。大きい微小コロニーは、より多くの粒子を保持することができます。各カテゴリの5-10動画（異なる微小コロニーのとフラット未分化層内の異なる場所の例 5-10ビデオ）を取ります。バイオフィルムマイクロコロニー、チャネル、ボイドやフラット未分化の層から成ってもよい異種のアーキテクチャを有しています。 - フィジー/ ImageJの（例えばCZI、TIF）で読み取ることができる適切な形式で動画を保存します。
- 完成したVIDをスクロールしてドリフトのためのビデオをチェックEO粒子が同時に同じ方向に移動しないことを観察します。ドリフトは、Zステージの動き、フローセル内の電流、除振台、空気圧や温度変化の不均衡によって引き起こされ得ます。正しいマイナー通常顕微鏡ソフトウェアを備えた後処理技術を使用して漂流。ドリフトを補正することはできませんここで任意のビデオを破棄します。解像度（ピクセル/ UM）、フレーム、時間数：粒子追跡解析時に必要とされている以下のパラメータを、記録しておきます。
- 顕微鏡ステージからフローセルを取り外し、バイオフィルムを栽培継続する蠕動ポンプを再起動します。
3.粒子追跡解析
- オープンソースソフトウェア（ImageJの）にプラグインTrackMateを使用することにより、粒子の軌跡を取得します。フィジーでダウンロードhttp://fiji.sc/Fiji。フィジーでビデオを開き、プラグインメニューの下、トラッキングとTrackMateを選択します。
- 目の設定を確認するか、調整Eウィンドウステップ2.4に記録されたビデオのパラメータを一致させるために、初期キャリブレーション設定を示唆しています。
- ImageJのを使用してTrackMate中の粒子を検出します。
- （例えば1000）のログ検出器」、入力された粒子径およびしきい値を選択します。紫色の円は、ビデオ全体の粒子に従うことを確認するには、「プレビュー」ボタンをクリックしながら、映像をスクロールします。必要に応じて直径値としきい値を調整します。紫色の円は空のスペースに表示された場合のしきい値を大きくします。十分ではない粒子が検出された場合のしきい値を減らします。検出に粒子を完了するために、次のボタンをクリックします。
- 「初期しきい値」で検出された粒子を追加または削除するオプションが提示された場合、次のボタンをクリックし、[ビューを選択 'と初期粒子検出が良好であった場合は調整せずに続行するには、Windows「フィルタを選択」を。
- OPTIの「簡易LAPトラッカー」を選択します「トラッカー方法を選択]ウィンドウのバーに粒子はほとんどバイオフィルムに焦点の外に移動しないと簡単に追跡されます。提案し、低リンクとギャップ閉鎖最大距離値を使用して、次へをクリックします。
- その粒子追跡は、粒子がTrackMateによって描かれたトラックに従うこと、および不要なまたは不足しているトラックがないことを確認するためにビデオをスクロールすることにより、良好であることを確認してください。さまざまなフィルタリングステップをスキップします。 「アクションを選択」最後のウィンドウに移動します。ドロップダウンメニューから「xmlファイルにエクスポートトラック」を選択し、「実行」をクリックします。トラックを保存するフォルダを選択してください。
注：粒子軌跡とマイクロレオロジーの使用を分析するためのパブリックドメインで利用できる様々なプログラムがあります。 msdanalyzerとTrackArtは、MATLAB環境で実行粒子トラッキング解析プログラムの一例です。
- のメニューで選択することで、xmlファイル内の粒子軌跡をインポートするためにMATLABを準備MATLABファイル> ...パスを設定し、フィジーのパッケージに使用可能なスクリプトフォルダを追加します。
- msdanalyzerと粒子軌跡を分析するために、zipファイルまたはtar.gzファイルへのリンクをダウンロードat http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- @msdanalyzerフォルダ15を抽出し、MATLABパスに属するフォルダにドロップします（ 例：C： Documents and Settings <ユーザー名> マイドキュメントは、MATLABを）。 MATLABを起動し、入力してアナライザを開始：
MA = msdanalyzer（2、「ええと '、'秒 '）
UMと秒は、ビデオ内の物理的な空間と時間の単位である場合。- 次のように入力して、粒子の軌道をインポートします。
[トラック、MD] = importTrackMateTracks（ 'ファイル名.xml'、 'CLIPZ」; 'scaleT'）
MA = ma.addAll（トラック）;
ここで「CLIPZ」は、2D映像のためのZディメンションを削除し、「scaleT」。 - 使用してグラフ上に軌跡をプロットします。
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - 使用して粒子のMSDのを計算します。
MA = ma.computeMSD。
ma.msd - 各粒子のMSDのをプロットします。
図
ma.plotMSD - ）3.5.1.4に3.5.1.1を繰り返して、同一categery（3日目に野生型微小コロニーに埋め込 ま例えば粒子）の他のビデオから粒子軌跡を組み合わせます。
- アンサンブル平均または全ての曲線の平均値をプロットします。
ma.plotMeanMSD
リニアから対数スケールにy軸とx軸を変更します。長いラグタイムで、MSD曲線はより長い時間スケールでの不十分な統計にノイジーになります。 MSD曲線はまた、動的エラーに急激に上昇することがあります。曲線のこれらの領域は、ブラシツールを使用して除去することができ>曲線の終点を選択し、選択 'ブラッシング」するツールメニューの「ブラシのかけていないと削除」。
- 次のように入力して、粒子の軌道をインポートします。
- でEzyfitをダウンロードhttp://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/とMATLABパスに属するフォルダにEzyfitを追加する（ 例：C： Documents and Settings <ユーザー名> マイドキュメントは、MATLABを）。インストールefmenu MATLABワークスペースを入力してEzyfitメニューをインストールします。 FigureウィンドウにEzyfitメニューを使ってMATLABを再起動します。 Ezyfitメニュー」が表示フィット'>'パワー'>' * X ^ n 'の中で選択することで、べき乗則にMSDカーブフィットは、nは、推定拡散指数 αでした。
注：msdanalyzerは、MSDカーブのフィッティングのためのMatlabの曲線フィッティングツールボックスが必要です。 Ezyfitはカーブフィッティングを行うことができ、代替とフリーソフトウェアです。 - 他の場所や時間に新しい粒子のMSDを計算するためのクリア現在の粒子軌跡とのMSD：
明確な媒体中の粒子の様々な平均MSD曲線（コントロール）を算出した後、および微小コロニーと様々な株の未分化領域、比較のために1つのグラフにカーブをコピーして貼り付けます。試料の剛性と低いMSD値で増加を架橋。フラット曲線は低いαを持っており、サンプルが高いαで急勾配の曲線よりも弾力性があります。 - カーブを選択し、そのような中央値と範囲として、データ統計を見て、「ツール」を参照してください。ビーズのMSDは、ビーズが関係に応じて埋め込 まれた材料のJ（t）はクリープコンプライアンスに比例し、
ここで、J =クリープコンプライアンス、D =粒子径、k個のB =ボルツマン定数、T =温度と t =時間。
- @msdanalyzerフォルダ15を抽出し、MATLABパスに属するフォルダにドロップします（ 例：C： Documents and Settings <ユーザー名> マイドキュメントは、MATLABを）。 MATLABを起動し、入力してアナライザを開始：
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Representative Results
ボイド（バイオフィルム上記培地）、平野（細胞の未分化フラット層）と微小コロニーを（ 図2A内のラベルを参照してください）含まバイオフィルム、の異なる領域におけるバイオフィルムの局所的な粘弾性特性を調べました。日3〜5の成熟の間のバイオフィルムの粘弾性特性の経時変化も測定しました。空隙中の粒子のMSDは、純粋な媒体中での粒子のMSDに制御匹敵として使用しました。これとは対照的に、バイオフィルムの中に閉じ込め粒子が固定された位置で振動とMSDの値は、粘弾性材料の代表的なものから強く弾性ゲル（ 図3）の範囲でした。
ムコイドP.緑膿菌野生型およびそのΔ ペル変異株 （ 図2Aおよび図2B）は、それらのバイオフィルムで3日目までに細い平野に散在する微小コロニーを開発しました。 3日目のプレーンは、あまりにも薄かったですレオロジー特性の調査。ムコイドP.によって形成されたバイオフィルムの両方で3微小コロニー日に緑膿菌野生型とΔ ペル株 、粒子のMSDは時間のための時間とは無関係であった（ 図4、表1）微小コロニーは、弾性であることを示した、10秒（α= 0）に0.1秒の遅れ。対応する粒子のMSDSから算出された中央クリープコンプライアンスは-2 4.3×10 Paであった-1および3.6×10 -2 Paがそれぞれ-1。 5日までにムコイドP.における微小コロニーのクリープコンプライアンス緑膿菌野生型株は、マトリックス内の有効な架橋の減少を示し、ペンシルベニア-1 2.5×10 -1に増加しました。 5日目微小コロニーはまだムコイドPに日からレオロジーに3〜5平野を変更していないα= 0、Δ 画素を有する弾性ました緑膿菌野生型とΔ ペル株はシミました弾性のLAR（α= 0）とその成熟度（未分化構造）を反映することができ、3日目微小コロニーに有効な架橋。
ΔPSL変異株（ 図2C）によって形成されたバイオフィルムは、あまり分化し、開発が遅れていました。これは、MSDの値はバイオフィルムがはるかに少ない効果的に架橋されたPよりであることを示した3日目の後に微小コロニーを開発厚い平野とバイオフィルムが得られました緑膿菌野生型およびΔ 画素株（ 図4、表1）。平野は 、α= 0.12と0.26日3時と5それぞれで、粘弾性ました。 3日目と5平野の中央値はクリープコンプライアンスは1.0 Paであっ-1。微小コロニーは5日目に発症した場合には、クリープコンプライアンスは、しきい値架橋が微小コロニーの分化に必要であることを示す、2.8×10 -1 Paの-1に減少しました。 HoweveR、クリープコンプライアンスはまだ若い日のクリープコンプライアンス3ムコイドP.よりも大きかったです緑膿菌野生型およびΔpel微小コロニー。 5日目微小コロニーは 、α= 0.34と粘弾性ました。このように、P。緑膿菌のバイオフィルムは、ペルの不在下で弾性、高度に架橋されています。 PSLの非存在下では、バイオフィルムは、粘弾性と少ない架橋となりました。このような微小コロニーとして成熟したバイオフィルムの構造では、ペルとPSLエキソポリサッカライドの両方の発現は、時間の経過の異なるレオロジーの違いが生じました。架橋の減少は、成熟の間のバイオフィルムマトリックス中のペルのエキソポリサッカライドへのPSLの減少に起因する可能性があります。
図1：バイオフィルム中の粒子追跡マイクロレオロジー（A）灰色の円は、時間と共に直線的に成長した粘性物質に粒子MSDを表しており、α= 1の黒三角は、バイオフィルムのEPSに振動プローブ粒子の時間であり、a = 0（B）とは無関係である弾性物質の粒子MSDダイアグラムを示しています。粒子は、細菌細胞のようにモデル化され、直径が似ています。粒子を包むマトリックスポリマーは、粒子よりもはるかに小さいです。
図2：PのerspectiのV eおよびDのワット電子VI断面Y 5バイオフィルム（緑）B yのコンF OCALのmicroscoのP yのコンティN uous後 <強い>（紫）1.0μM、0.5μメートル（赤）と0.2μMでeeding F（オレンジ）PA rが負に帯電したカルボキシル化表面とticles。バイオフィルム（A）ムコイドPから形成されました緑膿菌 、および変異体（B）のΔ 画素および（C）ΔPSL株。粒子は、バイオフィルムの全ての領域に組み込まれています。微小コロニー、平野とボイドの例は、（A）で標識されています。 チュウら 、mBio、2014年から変更された4。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
fig3.jpg "/>
図3：バイオフィルムの微小コロニー（ダークブルー）に振動する粒子のトラックに比べて成長培地（多色）でブラウン運動を実行する粒子のトラックの粒子軌跡の比較。セグメント化された色は、z平面で焦点の出入りによる粒子の追跡の中断を示します。
図4：バイオフィルム中の1.0μmの粒子のMSDのムコイドP.緑膿菌は、弾性であり、微小コロニーは5日目3から有効な架橋が減少しています。 Δ ペルは、弾性であり、3〜5日からレオロジーに変更されません。 ΔのPSLは、粘弾性であり、主に3〜5日からレオロジーで大幅に変更されません平野で構成されています。
| ひずみ | 日 | 地域 </ TD> | 中央値クリープコンプライアンス（PA -1） |
| 野生型 | 3日 | 微小コロニー | 4.3×10 -2 |
| 野生型 | 5日 | 微小コロニー | 2.5×10 -1 |
| 野生型 | 5日 | 無地の | 4.1×10 -2 |
| Δpel | 3日 | 微小コロニー | 3.6×10 -2 |
| Δpel | 5日 | 微小コロニー | 3.6×10 -2 |
| Δpel | 5日 | 無地の | 3.2×10 -2 |
| Δpsl | 3日 | 無地の | 1.0×10 0 |
| Δpsl | 5日 | 無地の | 1.0×10 0 |
| Δpsl | 5日 | 微小コロニー | 2.8×10 -1 |
表1：バイオフィルムの時代や地域に応じてクリープコンプライアンスと野生型および変異株の推定拡散指数の中央値。
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Discussion
マイクロレオロジーは、微生物バイオフィルムなどの異種システム、で地元のレオロジー測定のための便利なツールです。これは、複数の時点にわたって同じ生物学的サンプル中のレオロジーの変化のリアルタイム監視を可能にする、非破壊的技術です。このプロトコルでは、粒子追跡マイクロレオロジーは、それらが弾力性とバイオフィルムマトリックスの効果的な架橋をどのように影響するかを調べるために、ペルとPSLエキソポリサッカライドの変異体に適用しました。ペルは、粘弾性と緩いバイオフィルムを好むのに対し、PSLは、高い有効な架橋を有する弾性バイオフィルムの開発を促進します。両方のエキソポリサッカライドを製造する場合、バイオフィルムの微小コロニーは、ペル以上のPSLの減少と一致して、バイオフィルムが成熟するにつれて少なく効果的に架橋になります。
異なる細菌種によって形成されたバイオフィルムは、異なるEPS組成を有します。ムコイドPの EPS本研究で用いた緑膿菌の株主consiエキソポリサッカライド16のSTS。他の種は、EPSの彼らの主要な構成要素として大きな細胞外接着タンパク質17とDNA 18を使用することができます。ここで説明する手法は、他のレオロジーEPS成分の寄与および成長に対するそれらの効果を決定するために使用することができます。また、別の設定で成長したバイオフィルムは、それらのレオロジーに影響を与える劇的に異なる物理的性質を有することができます。例えば、Pをムコイドグルコースを補充緑膿菌は、静的条件に比べて流れの下で高度に差別構造を持つ複数のバイオフィルムを形成しています。研究はまた、このようなフローとしてせん断応力にさらさバイオフィルムは、バイオフィルムは、より粘着性と19,20の弾性になることが示されています。次のように成功したバイオフィルムの粒子追跡マイクロレオロジーの研究のために考慮すべき重要なステップと要因は次のとおりであります：
時間と空間に対する関心の調査や規模のシステム寸法
コンテンツ "空間スケールを考えるとき>、一つはシステムの粘弾性特性を生じさせる構造体のサイズを検討する必要があり（私たちの場合には、バイオフィルムマトリックスのポリマー）。プローブ粒子の周囲のポリマーは、中くらい小さくする必要があります粒子より構成し、高分解能イメージングが小さい粒子運動または振動を捕捉するために必要とされる。粒子に等方性の環境を提示するが、遅い示す。時間スケールを考慮して、弾性バイオフィルム同等のファイルサイズに撮像された領域の量を減少させますダイナミクスは、より長い時間スケール（例えば時間）を介してビデオを撮影し、低フレームレート（例えば分）を使用して必要があります。短いビデオは、適切な使用。高速ダイナミクス（分）と粘弾性バイオフィルムにかかったが、より高いフレームレート（秒またはミリ秒）を必要とすることができます各実験のための解像度、フレームレート、ビデオ再生時間は扱いやすい分析のための低ファイルサイズを維持します。バイオフィルムの粘弾性、彼terogeneityと寸法
パーティクルの動きが非常に弾性バイオフィルム（MSD <10 -4）で検出できない場合があります。このような場合には、粒子を変位させる力を加えるアクティブmicrorheological技術が好ましいです。バイオフィルムの異なる領域のレオロジーサンプリングは、バイオフィルムの機械的な不均一性が捕捉されていることを確認するために行われるべきです。異種形態は、しかし、均質な外観にもかかわらず、バイオフィルムとしては、レオロジーに複雑になることがあり、必ずしも機械的な不均一性の良好な指標ではありません：Δpslバイオフィルムは、より多くの形態の均質および分化に遅れているが、複雑な異種レオロジー特性を持っています。これとは対照的に、Δpelバイオフィルムは、高分化型微小コロニーとの異種の外観が、バイオフィルムを通して一定のレオロジーを持っています。大きな微小コロニーの大きさ（直径、高さ例えば、> 50ミクロン）とバイオフィルムの場合、それは意味のあることがあり高さ（微小コロニーの上部と下部）、または微小コロニーエッジからの距離に応じてレオロジーの違いをtudy。
プローブ粒子の選択
上述したように、粒子の大きさは、その粘弾性特性をもたらす材料の構造よりも大きくなければなりません。また、異なる表面化学を有する粒子は、バイオフィルム内の異なる領域とEPSの成分への結合をもたらすことができます。バイオフィルムの不均一性を考慮することができるように、このように異なる表面の化学的性質を有する粒子の影響が検討されるべきです。すべてのプローブ粒子が凝集を最小限に抑えるために高いゼータ電位を持つ必要があります。一緒に結合する粒子は正確なプローブとして使用することができず、解析から除外されるべきです。
ドリフトの最小化
ドリフトは、温度や気圧の変化、（通常はz方向）の顕微鏡ステージ移動、抗Vによって引き起こされる可能性がibrationテーブル不均衡とシステム内の内部流れ。通常の粒子とαの超拡散> 1でα> 1をもたらすドリフトする熱エネルギー以外は、アクティブなプロセスは、粒子および受動マイクロレオロジーが適用されない移動関与していることを示しています。
適切なバイオフィルム培養維持
フローセルが正しく漏れを防ぐために組み立てなければならず、バイオフィルムは、汚染から自由に保たなければなりません。バイオフィルムはまた、静的な培養条件のためのスライドとマイクロウェルのように、フローセルに他のセットアップの代替として成長させることができます。倒立顕微鏡は、マイクロウェルのイメージングのために使用されるべきです。
要約すると、粒子追跡マイクロレオロジーは、生物学的実験室標準顕微鏡を用いて使用することができる有用な技術です。また、粒子のMSDの計算や分析に関わるプログラムはパブリックドメインで容易に入手可能です。例えば、msdanalyzerとTrackArt 21（http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart）は、MATLAB環境で実行するプログラムです。技法は、粒子を移動させるためにのみ熱エネルギーに依存しているしかし、それはより高い弾性率のサンプル間で解決することができません。磁気ピンセットのような能動的な技術は、上で作用し、試料内を移動する粒子に力を適用し、高弾性サンプルの粘弾性を決定することができるであろう。
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Acknowledgments
この研究は優秀プログラムのその研究センターの下で教育シンガポール国立研究財団と省によってサポートされ、スタートアップ助成ナンヤン工科大学から（M4330002.C70）、およびACRFティア2（MOE2014-T2-2-172）教育省、シンガポールから。著者は、このプロトコルのデモに参加するためジョーイヤムクオックHoongに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
