Introduction
Большинство бактериальных клеток способны использовать как планктонные (свободно) и гостиной поверхностно-прилагается (сидячие) режимы роста 1. В поверхностно-прикреплен режиме роста, бактериальные клетки секретируют и закрывать себя в больших количествах внеклеточных полимерных веществ (EPS) с образованием биопленок. САЭ в основном состоит из белков, экзополисахарида, внеклеточной ДНК и имеет важное значение для образования биопленки 2. Она служит в качестве физической эшафот, с помощью которых бактерии могут использовать для дифференциации пространственно и защищает бактерии от вредных условий окружающей среды и ответов хоста. Различные компоненты имеют различные EPS роли в формировании биопленки 3 и изменения в экспрессии EPS компонентов может резко переделывать биопленки структуры 4. EPS компоненты могут также функционировать в качестве сигнальных молекул 5, и недавние исследования показали, определенные EPS компоненты, взаимодействующие с микробными клетками, чтобы направлять их миграции и биопленки различийerentiation 6-8.
Исследования на акцию значительно продвинулся вперед на основе морфологических анализов биопленок, полученных мутантов, дефектных по конкретной составляющей EPS 9,10. Кроме того, EPS обычно характеризуется в макро-масштабе (основная характеристика) 11. Морфологического анализа, однако, может не хватает количественной деталь и навальный характеристику, которая возвращает средние значения, теряет детали, которая существует в неоднородности биопленки. Существует в настоящее время растет тенденция к прогрессу в режиме реального времени характеристике механических свойств пенополистирола на микро-масштабе. Этот протокол показывает, как частица отслеживания микрореология способен определить пространственно-временные эффекты матричные компоненты Пеле и PSL экзополисахариды на вязкоупругости и эффективного сшивания Синегнойной биопленок 4.
Пассивный микрореология простой и недорогой относительной влажностиМетод eology, что обеспечивает высокую пропускную способность пространственного микрореологических выборки материала на сегодняшний день 12,13. В пассивном микрореологии, зонд сферы размещаются в образце и их броуновское движение, движимый тепловых энергий (к Б Т) следует видео микроскопии. Несколько частицы могут быть отслежены одновременно, и зависящие от времени координаты частиц следовать обычной случайное блуждание. Таким образом, в среднем, частицы остаются в том же положении. Тем не менее, стандартное отклонение смещений или средний квадрат смещения (MSD) частиц, не равна нулю. Так поступать вязких жидкостей, частица МСД в вязкой жидкости линейно возрастает с течением времени. В противоположность этому, полимерный сшивающий найти в вязкоупругих или эластичные вещества помогают им противостоять поток, и частицы становятся ограничены в своих перемещений, что приводит к плато на кривой MSD (1А). Это наблюдение следует соотношение MSDαt
Размер, плотность и химии поверхности частицы имеют решающее значение для правильного применения микрореологических эксперимента и выбраны по отношению к изучаемой системе (в данном случае полимеры по биопленки матрицы см Фигура 1В). Во-первых, частицы измеряет реологию вещества со структурами, которые намного меньше, чем самой частицы. Если структуры вещества являются подобного масштаба в частицы, движение от номиналачастица возмущается по форме и ориентации отдельных структур. Тем не менее, если структуры, окружающие частицы гораздо меньше, этот эффект мал и усреднены, представляя однородной среде с частицей (Фиг.1В). Во-вторых, плотность частицы должны быть аналогичны среды (1,05 г мл -1 для сред на основе воды), так что осаждение и избежать силы инерции можно пренебречь. Большинство частиц полистирола решеток соответствуют указанным выше критериям. В идеале, частица не взаимодействует с полимерами биопленки матрицы, как реологические толкование MSD частиц имеет место только при движении является случайным, что обусловлено тепловой энергии и столкновения с веществом структур. Это можно наблюдать, проверяя стремится ли зонд частиц, чтобы связать или отскакивать от поверхности предварительно выращенных биопленки. Тем не менее, несмотря на отсутствие притяжения к биопленки, частицы должны иметь возможность быть включены в матрицу.Кроме того, физико-химических неоднородность биопленки может привести к различные частицы быть более подходящим в качестве зондов в различных регионах биопленки. Таким образом, частицы различных размеров и поверхностной химии следует наносить на биопленки.
Таким образом, частица MSD может дать полезную информацию о том, как различные компоненты вносят вклад в реологические свойства и распространение биопленки. Кроме того, использование различных зондов позволяет извлекать информацию о пространственном физико-химической неоднородности биопленки. Этот метод может быть использован для тестирования эффекта антибактериальной терапии на механические свойства биопленки, или применительно к биопленок смешанных видов, чтобы исследовать, как механические свойства биопленки меняются от внедрения других видов. Частица паспорт безопасности также могут быть полезны для характеристики биопленки разгон. Такие исследования будут полезны в нашем понимании биопленок, потенциально улучшая биопленки процедуры вй инженерно биопленок для полезной деятельности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивание биопленки
- Приготовление бактериальных штаммов
- 1 день до культивирования биопленки, подготовки планктонные бактериальные культуры путем посева 2 мл соответствующего ростовой среде из замороженных бактериальной культуры. Использование Лурии-среды с бульоном (10 г L -1 NaCl, 10 г л -1 дрожжевой экстракт и 10 г L -1) триптон для слизистой P. палочки и ее Δ Δ PEL и PSL дефектные мутанты. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С и 200 об условиях тряски. Развести ночных культур с OD 600 0,40 использованием спектрофотометра.
- Сборка установки проточной ячейки, которая была описана ранее 14, предпочтительно от мобильной станции или тележки, которые могут быть приведены в микроскоп комнате для визуализации проточную ячейку без разборки.
- Подготовьте стерильную питательную среду в 2 л или 5 л бутылки для каждой ячейки потока. Используйте минимальное среду M9 (48 мм Na 2 HPO 4, 22 мМКН 2 РО 4, 19 мМ NH 4 Cl, 9 мМ NaCl, 2 мМ MgSO 4, 0,1 мМ и CaCl 2) с добавлением 0,04% глюкозы (вес / объем) и 0,2% (вес / объем) казаминокислот) для P. палочки Проточная ячейка биопленки.
- Алиготе флуоресцентные микросферы в микропробирок и спин вниз в стерильной H 2 O в течение 5 мин в центрифуге при 9,391.2 г. Удалить супернатант и ресуспендируют в 1 мл среды роста, чтобы удалить азида натрия (дезинфицирующее средство) перед добавлением среды роста в 2 л или 5 л средних бутылок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные размеры микросфер бывают разных концентрациях и должны быть разбавлены соответственно с инструкциями. Например, разогнать 120 мкл микросфер диаметром 1,0 мкм, 15 мкл микросфер диаметром 0,5 мкм и 0,96 мкл микросфер диаметром 0,2 мкм в 2 л питательной среды, чтобы дать 2,18 × 10 6 мл микросфер -1 для каждого размера частиц. - Прикрепите средний бутылку upstполосный ячейки потока и позволяют среднего роста течь через всей установки. Остановите поток и придать разводненной ночных культур в клеточных поток камер. Позволить бактериям прикрепиться к покровным субстрата в течение 1 часа, прежде чем продолжить поток ростовой среде при скорости потока приблизительно 5,5 × 10 -3 с -1 м или 8 оборотов в минуту с использованием перистальтического насоса.
Примечание: биопленки обычно выращивают при комнатной температуре (25 ° С) в течение 3-7 дней. - Кроме того, для статического установки культуры, разбавленной в течение ночи культуры в 100 раз в микроцентрифужных пробирках добавлением 10 мкл ночной культуры до 1 мл ростовой среды с частицами. Увеличьте концентрации частиц в среде роста для статического культуры примерно в 500 раз по сравнению с, что используется для биопленки потока (например, мыть и ресуспендируйте 600 мкл сфер диаметром 1,0 мкм в 10 мл ростовой среды,) как сотовые поток биопленки постоянно пополняется с частицы, а статические культуры не являются.
- Добавить 2001; л разбавленного ночной культуры с частицами в камерах 8 а горками. Инкубируют при 37 ° С в статических условиях. Биопленки обычно выращивают в течение 1 дня. Заменить истощенной средой роста ежедневно свежей средой роста с частицами, если биопленки выращивают в течение более 1 дня.
2. Микроскопия
- На 3-й день и 5, выключить поток от перистальтического насоса и привести установку потока клеток в микроскопии комнате. Зажим трубки возле входа и выхода из клеток поток камер, чтобы предотвратить дрейф (систематический причину ошибки по изменениям в окружающей среде) из потока. Поместите измерительную ячейку на столике микроскопа в вертикальном микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инвертированный микроскоп для визуализации лунок. - Используйте флуоресцентной микроскопии с 40X нефти целью принимать видео движения микросфер, встроенные в биопленки в различных местах (микроколоний и плоских слоев недифференцированных) и в разные дни (день 3 и 5) длявременные и пространственные исследования. Возьмите короткие видео с большей частотой кадров, чтобы исследовать события, происходящие в течение короткого времени весы (например, 1,5-3 мин видео на частоте кадров 25-50 кадров в секунду для быстрых динамики), и длинных видео с меньшим числом кадров для расследования событий в течение длительного времени весы (например 15-30 мин видео на скорости кадров 2,5-5 кадров / с для медленных динамики).
ПРИМЕЧАНИЕ: видео обычно содержит 5-10 частиц, и, как правило, из 1,0-2,5 ГБ файлов. Большие микроколонии может провести больше частиц. Возьмите 5-10 видео для каждой категории (например, 5-10 видео различных микроколоний и различных местах в плоских слоев недифференцированных). Биопленка имеет гетерогенную архитектуру, который может состоять из микроколоний, каналов, полостей и плоских недифференцированных слоев. - Сохранить видео в соответствующем формате, которые можно читать с помощью Фиджи / ImageJ (например, Ракоци, TIF).
- Проверьте видео для дрейфа, прокручивая готовой VIDEO и наблюдения, что частицы не перемещаются в одном направлении одновременно. Дрейф может быть вызван движения г стадии, токов в проточную кювету, дисбаланс таблицы анти-вибрации, давления воздуха или изменения температуры. Правильное незначительные дрейфующих использованием методов пост-обработки, как правило, предоставляемые с микроскопом программного обеспечения. Откажитесь от любых видео, в котором дрейф не может быть исправлено. Запишите следующие параметры, которые требуются в течение частиц отслеживания анализа: Разрешение (пикс / мкм), количество кадров, продолжительность.
- Удалить ячейку потока из стадии микроскопа и перезагрузите перистальтический насос, чтобы продолжить выращивание биопленки.
3. Отслеживание частиц Анализ
- Получить траектории частиц с помощью плагина TrackMate в программном обеспечении с открытым исходным кодом (ImageJ). Скачать Фиджи в http://fiji.sc/Fiji. Откройте видео с Фиджи и под меню Plugins, выберите Отслеживание и TrackMate.
- Проверьте настройки параметров или в гое окно с предложением начальные параметры калибровки, чтобы соответствовать видео параметры, как записано в шаге 2.4.
- Обнаружение частицы в TrackMate помощью ImageJ.
- Выбрать '' войти детектор, вход диаметр частиц и порогового значения (например, 1000). Прокрутите видео пока нажав на кнопку "Просмотр" для проверки, что фиолетовые круги следовать частиц по всему видео. Отрегулируйте значения диаметра и пороговые как надо: повысить пороговое значение, если фиолетовые круги появляются в пустом пространстве. Уменьшение порогового значения, если не хватает будут обнаружены частицы. Нажмите кнопку Далее, чтобы завершить Обнаружение частиц.
- Когда представлены с возможностью добавления или удаления частиц, обнаруженных в "Начальной пороговой», «Выбрать вид» и «выбрать фильтр 'окна, чтобы продолжить без регулировки, если начальная регистрации частиц удовлетворительным нажмите кнопку Далее.
- Выберите "Простой LAP трекер" в Optiна баре 'Выберите метод трекер «окно в виде частиц редко выйти из фокуса в биопленки и легко отслеживаются. Используйте значения Максимальное расстояние предложил или низкой связей и разрыв-закрытия, и нажмите кнопку Далее.
- Убедитесь, что отслеживание частиц удовлетворительным прокрутки видео, чтобы увидеть, что частицы по следу нарисованные TrackMate, и что нет нежелательных или отсутствующие треки. Перейти различные этапы фильтрации. Перейти к окончательному окне "Выберите действие". Выберите "Экспорт треков в формате XML файла" из выпадающего меню и нажмите кнопку "Выполнить". Выберите папку для сохранения треков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть различные программы, доступные в общественном достоянии по анализу траекторий частиц и использования микрореологии. msdanalyzer и TrackArt примеры программ частиц отслеживания анализа, которые работают в среде Matlab в.
- Подготовка Matlab импортировать траектории частиц в XML файлов, выбрав в менюMatlab Файл> Установить путь ... и добавить папку сценарии доступны с пакетом Фиджи.
- Для анализа траекторий частиц с msdanalyzer, скачать ссылку на файл почтового или файла tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Извлеките папкуmsdanalyzer 15 и поместите его в папку, которая принадлежит к пути Matlab (например, C: Documents и Settings <Имя пользователя> Мои документы Matlab). Начните Matlab и инициировать анализатор, набрав:
MA = msdanalyzer (2, 'гм', 'сек')
где мкм и сек физические пространства и времени единицы в видео.- Импорт траектории частиц, набрав:
[треки, MD] = importTrackMateTracks ('filename.xml', 'Clipz "; "Scalet ')
MA = ma.addAll (треки);
где 'Clipz "удаляет размерность г для 2D видео, и' 'Scalet. - Участок траектории на графике с помощью:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Вычислить СМН частиц с использованием:
MA = ma.computeMSD;
ma.msd - Изобразите СМН каждой частицы:
фигура
ma.plotMSD - Комбинат частиц траектории из других видео того же categery (например частиц, внедренных в микроколоний дикого типа на 3-й день), повторяя 3.5.1.1 для 3.5.1.4).
- Участок ансамбль среднее или среднее по всем кривым:
ma.plotMeanMSD
Измените у и оси х от линейного к логарифмической шкале. При больших временах запаздывания, кривые MSD стать шумным из-за недостаточных статистических данных на более длительных временных рамок. Кривые MSD также может резко возрастать из-за динамической ошибки. Эти области кривой могут быть удалены при помощи функции кистивыбрать конец кривой и выбрав "Чистка"> "Удалить Unbrushed" в меню Сервис.
- Импорт траектории частиц, набрав:
- Скачать Ezyfit на http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ и добавить Ezyfit в папку, принадлежащего пути Matlab (например, C: Documents и Settings <Имя пользователя> Мои документы Matlab). Установите меню Ezyfit набрав в Matlab рабочей efmenu установки. Перезапуск MATLAB с меню Ezyfit в окне фигуры. Установите кривые MSD степенному закону, выбрав в меню Ezyfit "Показать Fit '>' Power '>' а * х ^ п 'были п по оценкам диффузная показатель α.
ПРИМЕЧАНИЕ: msdanalyzer требует подгонки кривой Toolbox в Matlab для подгонки кривых MSD. Ezyfit является альтернативой и бесплатное программное обеспечение, которое может выполнять построения кривой. - Очистить текущие траектории частиц и паспорт безопасности для расчета новых СМН частиц в других местах или времени:
Чисто После расчета различных средних MSD кривых частиц в среде (контроль), и микроколоний и недифференцированных области различных штаммов, скопируйте и вставьте кривые в одном графике для сравнения. Образец жесткость и сшивания увеличение с низких значений MSD. Плоские кривые имеют более низкие альфа и образец более эластичен, чем круче кривых с высшим а. - Выделите кривую и перейти к меню "Инструменты", чтобы посмотреть на данные статистики, такие как медиана и диапазон. Базе МСД борта пропорциональна соответствии ползучести, J (т) материала, в котором шарик встроенного в соответствии с соотношением,
где J = ползучести соблюдение, д = диаметр частиц, к B = постоянная Больцмана, Т = температура и т = время.
- Извлеките папкуmsdanalyzer 15 и поместите его в папку, которая принадлежит к пути Matlab (например, C: Documents и Settings <Имя пользователя> Мои документы Matlab). Начните Matlab и инициировать анализатор, набрав:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исследованы местные вязкоупругих свойств биопленки в различных регионах биопленки, которая включала пустоты (средний выше биопленки), равнины (недифференцированные плоский слой клеток) и микроколонии (см этикетки на рисунке 2а). Временные изменения в вязко-упругих свойств биопленки во время созревания от дней от 3 до 5 были также определены. Базе МСД частиц в пустотах был использован в качестве контроля и сравнимы с МСД частиц в чистой среде. В противоположность этому, частицы, захваченные в биопленки вибрации в фиксированных позициях и значения MSD варьировались от типичных вязкоупругих материалов с сильно эластичных гелей (фиг.3).
Мукоидные П. палочки дикого типа и его мутантные штаммы Δ PEL (рис 2a и 2b) разработали микроколонии разбросанные по равнине тонкой по 3-й день в их биопленок. Равнина на 3 день был слишком тонкий дляИсследование реологических свойств. В обоих биопленок, образованных слизистой P. штаммы палочки дикого типа и Δ PEL, то СКО частиц в день 3 микроколоний не зависит от времени, в течение времени отстает от 0,1 сек до 10 сек (α = 0), что указывает на микроколонии были упругие (Рисунок 4, таблица 1) , Средние ползучести податливости, рассчитанные из соответствующих опорно частиц были 4,3 х 10 -2 Па -1 и 3,6 х 10 -2 Па -1 соответственно. К 5 день ползучести соблюдению микроколоний в слизистой P. палочки штамма дикого типа увеличен до 2,5 х 10 -1 Па -1, что указывает на снижение эффективного поперечного сшивания в матрице. В день 5 микроколонии еще упругой a = 0. Д ПЭЛ не изменится в реологии от 3 дней до 5. равнины в слизистой P. палочки дикого типа и штаммов PEL А были СимиLAR эластичности (α = 0) и эффективная сшивка в день 3 микроколоний, которые могут быть отражением их погашения (недифференцированные структуры).
Биопленки образованные Д PSL мутантного штамма (рис 2С) были менее дифференцированы и с задержкой в развитии. Это привело к биопленок с толстыми равнин, которые развивались после микроколонии День 3. значений МСД показали, что биопленки были гораздо менее эффективно, чем сшитый P. палочки дикого типа и штамма А PEL (фиг.4, таблица 1). Равнины были вязкоупругая, с а = 0,12 и 0,26 на дни 3 и 5 соответственно. Средний ползучести соответствие день 3 и 5 равнинах составляет 1,0 Па -1. При микроколонии разработал в 5-й день, соблюдение ползучести уменьшилась до 2,8 х 10 -1 Па -1, что указывает порог сшивки, необходимое для микроколонии дифференциации. Howeveг, соблюдение ползучести по-прежнему больше, чем ползучести соответствии младшего 3 день слизистая П. палочки дикого типа и Δpel микроколонии. В день 5 микроколонии были вязкоупругого с а = 0,34. Таким образом, П. палочки биопленки является эластичным и высоко сшитый в отсутствие Пеле. При отсутствии PSL, биопленка стал вязкоупругого и менее сшитый. В зрелых биопленки структур, таких как микроколоний, выражение как Пеле и PSL экзополисахаридов привело различных реологических различия с течением времени. Уменьшение сшивки может быть связано с уменьшением PSL к Pel экзополисахаридов в биопленки матрицы во время созревания.
Рисунок 1:. Частиц отслеживания микрореология в биопленки (A) Серые круги изображают частицы МСД в вязкой субстанции, которая растет линейно со временем иα = 1. Черные треугольники изображают частицы MSD из эластичного вещества, которое не зависит от времени и = 0. (B) схема пробной частицы вибрировать в ЭЭС биопленки. Частица моделируется как бактерии и клетки подобно в диаметре. Матричные полимеры, которые обволакивают частицы гораздо меньше, чем частицы.
Рисунок 2: P erspecti л е и в разрезе VI е ж д а в у 5 биопленки (зеленый) б у кон е OCAL microsco р у п после Конти рывна < сильный> е eeding 1,0 μ м (фиолетовый), 0,5 μ м (красный) и 0,2 μ м (оранжевый) годовых г цами с отрицательно заряженной поверхности карбоксилированного. Биопленки формируется из (A) слизистой P. палочки, и мутанты (В) Δ PEL и (С) Δ PSL штаммы. Частицы включены во всех регионах биопленки. Примеры микроколоний, равнины и пустот помечены (А). Измененный Чу и др., 2014, mBio 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
fig3.jpg "/>
Рисунок 3:. Траектории частиц Сравнение трека частицы, совершающей броуновское движение в среде роста (разноцветные) по сравнению с треков частиц в колеблющихся биопленки микроколоний (темно-синий). Сегментированные цвета указывают на перерывы в слежения из-за частицы, движущейся в фокусе в плоскости г.
Рисунок 4:. Паспорт безопасности по 1,0 мкм частиц в биопленки мукоидные П. палочки эластичный и микроколонии сводятся к эффективному сшиванию от 3 дней до 5; Δ пел эластична и не изменяется в реологии от дней от 3 до 5; Δ PSL является вязкоупругой и в основном состоит из равнин, которые существенно не изменяют в реологии от дней от 3 до 5.
| Напряжение | День | Регион </ TD> | Медиана ползучести соблюдению (Па -1) |
| дикий тип | 3 день | Микроколонии | 4,3 х 10 -2 |
| дикий тип | 5 день | Микроколонии | 2,5 х 10 -1 |
| дикий тип | 5 день | Обычная | 4,1 х 10 -2 |
| Δpel | 3 день | Микроколонии | 3,6 х 10 -2 |
| Δpel | 5 день | Микроколонии | 3,6 х 10 -2 |
| Δpel | 5 день | Обычная | 3,2 х 10 -2 |
| Δpsl | 3 день | Обычная | 1.0 х 10 0 |
| Δpsl | 5 день | Обычная | 1.0 х 10 0 |
| Δpsl | 5 день | Микроколонии | 2,8 х 10 -1 |
Таблица 1: Средние ползучести податливости и оценочные показатели диффузные дикого типа и мутантные штаммы по биопленки возраста и региона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микрореология является полезным инструментом для местных реологических измерений в гетерогенных системах, таких как микробные биопленки. Это неразрушающий метод, позволяющий в режиме реального времени мониторинг реологических изменений в той же биологической пробы через различные моменты времени. В этом протоколе, частица отслеживания микрореология был применен к Пеле и PSL экзополисахарид мутантов, чтобы исследовать, как они влияют на эластичность и эффективное сшивание биопленки матрицы. PSL способствует развитию эластичных биопленки с высокой эффективной сшивания, в то время как Пел способствует вискоэластик и слабее биопленки. Когда оба экзополисахариды производятся, биопленки микроколонии становится менее эффективно сшивают, как биопленка созревает, в соответствии с уменьшением PSL над Pel.
Биопленки образованные различными видами бактерий имеют различные EPS композиции. САЭ мукоидного P. штаммы палочка, используемые в данном исследовании, в основном, consi ГНС экзополисахаридов 16. Другие виды могут использовать большие внеклеточные адгезионные белки 17 и 18 ДНК как их основных компонентов EPS. Описанный здесь подход может быть использован для определения реологических вклад других компонентов EPS и их воздействие на рост. Кроме того, биопленки, выращенных в различных установках может иметь совершенно разные физические свойства, которые влияют на их реологические свойства. Например, мукоидные P. палочки с добавлением глюкозы образует биопленку с более высокой дифференцированной структуры в токе по сравнению с статических условиях. Исследования также показали, что биопленки подвергается напряжению сдвига, такие как поток делает биопленки более связным и упругой 19,20. Важные шаги и факторы, чтобы рассмотреть для успешного биопленки частиц отслеживания микрореология исследования заключаются в следующем:
Размеры системы для расследования или шкале интересов в отношении времени и пространстве
Содержание "> При рассмотрении пространственные масштабы, необходимо учитывать размер структур, которые приводят к вязко-упругих свойств системы (в нашем случае, полимеры биопленки матрицы). Полимеры вокруг пробной частицы должна быть намного меньше, в Структура, чем частицы и представить изотропное среду с частицей. изображений с высоким разрешением требуется, чтобы захватить небольшой движение частиц или вибрации, но уменьшить количество области изображенную на эквивалентного размера файла. При рассмотрении временных характеристик, эластичные биопленки, которые обладают медленным Динамика требуют принятия видео в течение длительных временных масштабах (например, час) и используя низкие цены кадров (например, мин). Более короткие видео могут быть приняты для вязкоупругих биопленок с быстрыми динамики (мин), но требуют более высокую частоту кадров (сек или миллисекунд). Используя подходящий разрешение, частоту кадров, продолжительность видео для каждого эксперимента будет держать размер файла низкой для послушный анализа.Биопленки вязкоупругость, онterogeneity и размеры
Движение частиц может быть незаметным в очень упругих биопленок (MSD <10 -4). В таких случаях, активные методы, которые микрореологических применять силу для вытеснения частицу, являются предпочтительными. Реологические выборки различных регионах биопленки должны быть направлены на обеспечение механической неоднородности биопленки в плен. Гетерогенных морфология, однако, не обязательно является хорошим показателем механической неоднородности, так как, несмотря однородных выступлений биопленки может быть сложным в реологии: Δpsl биопленки более однородны по морфологии и задержка в дифференциации, но имеют сложную гетерогенную и реологические анкету. В отличие от этого, Δpel биопленки имеют гетерогенную вид с хорошо дифференцированных микроколоний но постоянный реологические свойства на протяжении биопленки. Для биопленок с большими размерами (например микроколонии> 50 мкм в диаметре и высотой), может иметь смысл сTudy реологические различия по высоте (сверху и снизу микроколоний), или расстояние от края микроколонии.
Выбор пробных частиц
Как описано выше, размер частиц должен быть больше, чем в структурах материалов, которые приводят к ее вязкоупругих свойств. Кроме того, частицы с разной химии поверхности может привести к связыванию с различными областями и EPS компонентов в биопленки. Таким образом, эффекты частиц с различной химии поверхности должны быть изучены, чтобы биопленки неоднородность может быть рассмотрен. Все частицы зонд должен иметь высокую дзета-потенциал, чтобы минимизировать агломерацию. Частицы, которые связываются вместе, не могут быть использованы в качестве зондов точных и должны быть исключены из анализа.
Минимизация дрейфа
Дрейф может быть вызван температуры или давления воздуха, изменения движения столике микроскопа (обычно в направлении оси г), анти-Vibration дисбаланс стол и внутренний поток в системе. Сугробы, как правило, приводят к супердиффузии частицы и а> 1. α> 1 указывает, что кроме тепловой энергии, активные процессы участвуют движущаяся частица и пассивный микрореология не применяется.
Техническое обслуживание культура Правильное биопленки
Flow клетки должны быть собраны правильно, чтобы предотвратить утечку и биопленки должны быть от загрязнения бесплатно. Биопленки также могут быть выращены в другие установки альтернативы в проточную ячейку, например, слайдов и лунки для статических условий культивирования. Инвертированный микроскоп должен быть использован для визуализации лунок.
Таким образом, отслеживание частиц микрореология является полезным методом, который может быть использован с помощью микроскопа стандартные к биологической лаборатории. Кроме того, программы, участвующие в расчете и анализе опорно частиц легко доступны в общественное достояние.Например, msdanalyzer и TrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) программы, которые выполняются в среде Matlab в. Однако, поскольку способ основан только на тепловой энергии для перемещения частиц, не может решить между образцами более высокой эластичностью. Активные методы, такие как магнитный выщипывания, приложить усилие на частицы действовать от перемещения и внутри образца, и сможет определить вязкоупругости высокоэластичных образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование проводится при поддержке Национального исследовательского фонда и Министерства образования Сингапура под его научно-исследовательского центра Программы совершенства, СНВ-гранты (M4330002.C70) из Технологического университета Наньян, и ACRF Уровень 2 (MOE2014-T2-2-172) от Министерства образования, Сингапур. Авторы благодарят Джои Ям Куок Хун для участия в демонстрации этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
