Introduction
רוב תאי חיידקיים יכולים להעסיק שני הפלנקטון (חיים-חינם) ומצבים-מצורף פני השטח (נייחים) של 1 צמיחה. במצב של צמיחה המצורפת המשטח, תאי חיידקים מפרישים ולשים בארגז את עצמם בכמויות גדולות של חומרים פולימריים תאיים (EPS) כדי ליצור biofilms. EPS מורכב בעיקר חלבונים, exopolysaccharide, DNA תאי וחיוני להיווצרות biofilm 2. היא משמשת כפיגום פיזי שבו חיידקים יכולים להשתמש בו כדי להבחין במרחב ובמגנים על החיידקים מהתנאים סביבתיים מזיקים ותגובות מארחות. יש מרכיבים שונים של EPS תפקידים שונים בbiofilm היווצרות 3 ושינויים בביטוי של רכיבי EPS באופן דרמטי יכול לשפץ מבני biofilm 4. רכיבי EPS יכולים גם לתפקד כמולקולות איתות 5, ומחקרים שנעשה לאחרונה הראו רכיבי EPS מסוימים אינטראקציה עם תאי חיידקים כדי להדריך את הבדל ההגירה וbiofilmerentiation 6-8.
מחקר על הרווח למניה שמאוד מתקדם, המבוסס על הניתוח מורפולוגי של biofilms מיוצר על ידי מוטציות פגומות ברכיב ספציפי של EPS 9,10. בנוסף, EPS מאופיין בדרך כלל במאקרו בקנה המידה (אפיון תפזורת) 11. מורפולוגיים מנתח זאת יכול חסר פירוט כמותי ואפיון בתפזורת, אשר מחזיר ערכים ממוצע, מאבד את הפירוט שקיים בתוך ההטרוגניות של biofilm. יש עכשיו מגמה גוברת כדי להתקדם לאפיון תכונות המכונאי של EPS בזמן אמת במייקרו בקנה המידה. פרוטוקול זה מדגים כיצד microrheology חלקיקי המעקב הוא מסוגל לקבוע את השפעות spatiotemporal של רכיבי מטריצת פל וexopolysaccharides PSL על crosslinking viscoelasticity והיעיל של biofilms aeruginosa Pseudomonas 4.
microrheology הפסיבי הוא RH פשוט וזולשיטת eology המספקת את התפוקה הגבוהה ביותר של דגימת microrheological המרחבי של חומר לתאריך 12,13. בmicrorheology הפסיבי, תחומי בדיקה ממוקמים במדגם והתנועה בראונית, מונעת על ידי אנרגיות תרמיים (B T k) ואחריו על ידי מיקרוסקופ וידאו. ניתן לעקוב כמה חלקיקים בו זמנית, ואת הקואורדינטות של החלקיקים תלויי הזמן לעקוב אחרי הליכה אקראית קונבנציונלית. לכן, בממוצע, החלקיקים להישאר באותה התנוחה. עם זאת, סטיית התקן של ההתקות או הממוצעת בריבוע העקירה (MSD) של החלקיקים, הוא לא אפס. מאז נוזלים צמיגים הזרימה, החלקיקים MSD בנוזל צמיג גדל באופן ליניארי ככל שזמן מתקדם. לעומת זאת, crosslinking פולימרים מצא בviscoelastic או חומרים אלסטיים לעזור להם להתנגד לזרימה, והחלקיקים להיות מוגבלים בעקירתם, שהובילו למישורים בעקומת MSD (איור 1 א). תצפית זו כדלקמן ביחס MSDαt
הכימיה גודל, הצפיפות ופני שטח של החלקיקים הן קריטיות ליישום הנכון של ניסוי microrheological ונבחר ביחס למערכת למדה (במקרה זה הפולימרים של מטריצת biofilm, ראו איור 1). ראשית, החלקיקים מודד את rheology של החומר עם מבנים שהם הרבה יותר קטנים מאשר החלקיקים עצמו. אם המבנים של החומר הם בקנה מידה דומה לחלקיקים, התנועה של נקובticle הוא מוטרד על ידי הצורה והכיוון של המבנים הבודדים. עם זאת, אם המבנים המקיפים את החלקיקים קטנים בהרבה, השפעה זו קטנה וממוצע החוצה, הצגת סביבה הומוגנית לחלקיקים (איור 1). שנית, צפיפות החלקיקים צריכה להיות דומה למדיום (1.05 גר 'מיליליטר -1 למדיומים על בסיס מים) באופן שהשקיעה הוא נמנעה וכוחות אינרציה הם זניחים. רוב החלקיקים עם סורגי קלקר עומדים בקריטריונים לעיל. באופן אידיאלי, החלקיקים אינו אינטראקציה עם הפולימרים של מטריצת biofilm כפרשנות rheological של MSD חלקיקים תקף רק אם התנועה היא אקראית, מונע על ידי אנרגיה והתנגשות תרמית עם מבני חומר. זה יכול להיות שנצפה על ידי בדיקה אם חלקיק הבדיקה נוטה להיקשר או להקפיץ את פני השטח של biofilm מראש מבוגר. עם זאת, למרות חוסר המשיכה לbiofilm, החלקיקים חייבים להיות מסוגלים להיות משולב לתוך המטריצה.בנוסף, ההטרוגניות physiochemical של biofilm עלולה לגרום לחלקיקים שונים להיות יותר מתאימים כמו בדיקות באזורים שונים של biofilm. כך, חלקיקים בגדלים שונים וכימיה של פני השטח צריכים להיות מוחלים על biofilm.
ככזה, חלקיקי MSD הוא מסוגל לספק מידע שימושי על מרכיבים שונים תורמים לrheology והפצה של biofilm. יתר על כן, השימוש בבדיקות שונות מאפשרים להפיק מידע על ההטרוגניות physiochemical המרחבי של biofilm. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון את הטיפול אנטי-מיקרוביאלי השפעה על התכונות מכאניות של biofilm, או להחיל biofilms מינים המעורב לחקור כיצד התכונות מכאניות של biofilm משתנות מהקדמה של מין אחר. החלקיקים MSDS יכול להיות גם שימושי לאפיון פיזור biofilm. מחקרים כאלה יהיו מועילים בהבנה של biofilms, פוטנציאל שיפור טיפולי biofilmהנדסת nd של biofilms לפעילות מועילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טיפוח Biofilm
- הכנה של זני חיידקים
- יום 1 לפני טיפוח biofilm, להכין תרבויות חיידקי פלנקטון על ידי inoculating 2 מיליליטר של מדיום גידול מתאים מתרבות חיידקים קפואה. השתמש בינוני לוריא-מרק (10 L ז -1 NaCl, 10 גרם L -1 תמצית שמרים, ו -10 גרם L -1 tryptone) לפ הרירי aeruginosa והמוטציות פגומות PEL Δ Δ וPSL. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס ו -200 תנאי סל"ד רועדים. לדלל תרבויות הלילה לOD 600 של 0.40 באמצעות ספקטרופוטומטר.
- להרכיב התקנת תא זרימה, אשר תוארה בעבר 14, עדיף על תחנה ניידת או עגלה שניתן להביא לחדר מיקרוסקופ הדמיה תא הזרימה ללא פירוק.
- הכן מדיום גידול סטרילי ב 2 L או 5 בקבוקי ליטר לכל תא זרימה. השתמש בינוני מינימאלי M9 (48 מ"מ Na 2 HPO 4, 22 מ"מKH 2 PO 4, 19 מ"מ NH 4 Cl, 9 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgSO 4, ו -0.1 מ"מ CaCl 2) בתוספת גלוקוז 0.04% (WT / כרך) ושל 0.2% (WT / כרך) casamino חומצות) לפ aeruginosa לזרום biofilms תא.
- microspheres ניאון Aliquot לתוך צינורות microcentrifuge ספין למטה בסטרילי H 2 O למשך 5 דקות בצנטריפוגות ב9,391.2 ז. הסר supernatant וגלול במדיום 1 מיליליטר צמיחה להסיר נתרן אזיד (חיטוי) לפני הוספה למדיום גידול ב2 L או 5 בקבוקים בינוניים L.
הערה: בגדלים שונים של microspheres לבוא בריכוזים שונים וצריכים להיות מדולל בהתאם להוראות. לדוגמא, לפזר 120 μl של 1.0 מיקרומטר microspheres קוטר, 15 μl של 0.5 מיקרומטר microspheres קוטר 0.96 וμl של 0.2 מיקרומטר microspheres קוטר לתוך 2 ליטר של מדיום גידול לתת 2.18 × 10 6 מיליליטר microspheres -1 לכל גודל חלקיקים. - צרף בקבוק בינוני עד upstלקדד של תא זרימה ולאפשר צמיחה בינונית לזרום דרך כל התקנה. לעצור זרימה ולהזריק תרבויות לילה בדילול לתאי תא זרימה. לאפשר לחיידקים לצרף לתשתית coverslip עבור שעה 1 לפני שימשיך זרימה של מדיום גידול בקצב זרימה של כ 5.5 x 10 -3 שניות מ '-1, או סל"ד 8 עם משאבת peristaltic.
הערה: Biofilms גדלים בדרך כלל בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) במשך 3-7 ימים. - לחלופין, להגדרת תרבות סטטי, לדלל תרבויות לילה בצינורות microcentrifuge 100 לקפל על ידי הוספת 10 μl של תרבות הלילה עד 1 מיליליטר מדיום גידול עם חלקיקים. להגדיל את ריכוז החלקיקים במדיום הגידול לתרבות סטטית של כ 500-פי השוואה לזה המשמש לזרימה biofilms (למשל לשטוף וresuspend 600 μl של 1.0 מיקרומטר תחומי קוטר 10 מיליליטר של מדיום גידול) כbiofilms תא זרימה כל הזמן מתחדש עם חלקיקים אבל תרבויות סטטי הם לא.
- הוסף 2001; l של תרבות הלילה מדוללת עם חלקיקים לתאי של 8 מגלשות גם. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים. Biofilms גדלים בדרך כלל ליום 1. החלף בינוני צמיחה מותשת יומי עם מדיום גידול טרי עם חלקיקים אם biofilm הוא גדל ליותר מיום 1.
2. מיקרוסקופית
- ביום 3 ו -5, לכבות את הזרימה ממשאבת peristaltic ולהביא התקנת תא זרימה לחדר מיקרוסקופי. צינורות מהדק בסמוך לכניסה והיציאה של תאי תא זרימה כדי למנוע סחף (סיבת שגיאה שיטתית על ידי שינויים בסביבה) מזרימה. מניחים את תא הזרימה על הבמה מיקרוסקופ של מיקרוסקופ זקוף.
הערה: השתמש במיקרוסקופ הפוכה להדמיה של microwells. - השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 40X אובייקטיבי שמן לקחת קטעי וידאו של תנועת microsphere המשובץ בbiofilm במקומות שונים (microcolonies ושכבות מובחנים שטוחות) ובימים שונים (יום 3 ו -5) לחקירות של זמן ומרחב. קח קטעי וידאו קצרים עם קצב פריימים גבוה יותר כדי לחקור את האירועים המתרחשים בתוך קשקשי זמן קצרים (למשל 1.5-3 סרטוני דקות בקצב פריימים של 25-50 פריימים לשניה לדינמיקה מהירה), וקטעי וידאו ארוכים יותר עם קצב פריימים נמוך כדי לחקור את האירועים לאורך זמן ארוך יותר קשקשים (קטעי וידאו 15-30 דקות למשל במסגרת שיעור של 2.5-5 מסגרות / שנייה לדינמיקה איטית יותר).
הערה: וידאו בדרך כלל מכיל 5-10 חלקיקים, והוא בדרך כלל מ1.0-2.5 GB בגודל קובץ. microcolonies הגדול יותר עשוי להחזיק יותר חלקיקים. קח 5-10 קטעי וידאו לכל קטגוריה (למשל 5-10 קטעי וידאו של microcolonies שונה ומקומות שונים בשכבות מובחנים שטוחות). יש biofilm ארכיטקטורה הטרוגניות שעשויות להיות מורכבת של microcolonies, ערוצים, חללים ושכבות מובחנים שטוחות. - שמור את הסרטונים בפורמט מתאים שניתן לקרוא על ידי פיג'י / ImageJ (למשל czi, TIF).
- בדקו קטעי וידאו ללהיסחף על ידי הגלילה בvid המוגמראיו והתבוננות שהחלקיקים לא זזים באותו הכיוון בו-זמנית. הסחף יכול להיגרם על ידי תנועת z שלבים, זרמים בתא הזרימה, חוסר איזון של שולחן נגד רעידות, לחץ אוויר או שינויי טמפרטורה. נסחף קטין נכון תוך שימוש בטכניקות שלאחר העיבוד בדרך כלל מסופקות עם תוכנת מיקרוסקופ. לבטל את כל קטעי וידאו שבו להיסחף לא ניתן לתקן. רשום את הפרמטרים הבאים, הנדרשים בחלקיקי מעקב ניתוח: הרזולוציה (פיקסלים / אום), מספר מסגרות, משך.
- הסר תא זרימה מבמת מיקרוסקופ ולהפעיל מחדש את משאבת peristaltic להמשיך ולעבד את biofilm.
3. חלקיקים מעקב ניתוח
- להשיג מסלולי חלקיקים באמצעות התוספת TrackMate בתוכנת קוד פתוחה (ImageJ). הורד פיג'י בhttp://fiji.sc/Fiji. פתח את הווידאו עם פיג'י ותחת תפריט התוספים, בחר מעקב וTrackMate.
- בדוק או להתאים את הגדרות בהחלון הדואר מציע הגדרות כיול ראשוניות כדי להתאים את הפרמטרים וידאו כפי שנרשם בשלב 2.4.
- לזהות חלקיקים בTrackMate באמצעות ImageJ.
- בחירה 'גלאי יומן', קוטר חלקיקי קלט וערך סף (למשל 1000). גלול בווידאו בזמן לחיצה על הכפתור 'התצוגה המקדימה' כדי לבדוק שהחוגים הסגולים לעקוב אחרי החלקיקים בכל הווידאו. התאם את הקוטר וסף הערכים בהתאם לצורך: להגדיל את ערך הסף אם עיגולים סגולים מופיעים בחלל הריק. להפחית את ערך הסף אם לא מספיק חלקיקים מזוהים. לחץ על הכפתור הבא כדי להשלים גילוי החלקיקים.
- לחץ על הכפתור הבא כאשר מוצג עם האפשרות להוסיף או להסיר חלקיקים שהתגלו ב'thresholding הראשונית ',' בחר תצוגה 'ו' בחר מסנן 'חלונות להמשיך ללא התאמה אם גילוי חלקיקים ראשוני היה משביע רצון.
- בחירה 'גשש LAP פשוט' בoptiעל הבר של 'בחר שיטת גשש' חלון כחלקיקים לעתים רחוקות לצאת מהפוקוס בbiofilm ולעקוב בקלות. השתמש בערכי מרחק מקסימום המקשר הציעו או נמוך ופער-סגירה, ולחץ על הבא.
- בדוק שמעקב החלקיקים הוא משביע רצון על ידי גלילה בווידאו כדי לראות שחלקיקים על פי המסלולים שצוירו על ידי TrackMate, ושאין מסלולים לא רצויים או חסרים. דלג על צעדי סינון השונים. עבור לחלון הסופי "בחר פעולה". בחירת 'מסלולי יצוא לקובץ XML' מתפריט הנפתח ולחץ על 'ביצוע'. בחר תיקייה כדי לשמור את המסלולים.
הערה: ישנן תוכניות שונות הזמינים בתחום הציבורי לניתוח מסלולי חלקיקים ושימוש בmicrorheology. msdanalyzer וTrackArt הם דוגמאות לתוכניות ניתוח חלקיקי מעקב הפועלות בסביבת Matlab.
- הכן Matlab לייבא מסלולי חלקיקים בקבצי XML על ידי בחירה בתפריט שלקובץ Matlab> נתיב הגדר ... ולהוסיף סקריפטים תיקייה זמינים עם חבילת פיג'י.
- כדי לנתח את מסלולי חלקיקים עם msdanalyzer, להוריד את הקישור לקובץ zip או קובץ tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- לחלץ את תיקייתmsdanalyzer 15 ושחרר אותו בתיקייה ששייכת לנתיב Matlab (למשל C: Documents and Settings <שם משתמש> המסמכים שלי Matlab). התחל Matlab וליזום את המנתח על ידי הקלדה:
ma = msdanalyzer (2, 'אום', 'שניות')
שבו אום ושניות הן יחידות הזמן והמרחב הפיזיות בווידאו.- ייבא את מסלולי חלקיקים על ידי הקלדה:
[שירים, MD] = importTrackMateTracks (, 'clipZ' 'FileName.xml';, 'ScaleT')
ma = ma.addAll (מסלולים);
איפה clipZ 'מסיר את ממד Z לוידאו 2D, ו'scaleT'. - עלילה המסלולים על שימוש בגרף:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - לחשב את MSDS של החלקיקים באמצעות:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - עלילה MSDS של כל חלקיק:
דְמוּת
ma.plotMSD - לשלב מסלולי חלקיקים מסרטונים אחרים של אותו categery (למשל חלקיקים המוטבעים בmicrocolonies wild-type ביום 3) על ידי חזרה 3.5.1.1 ל3.5.1.4).
- עלילה מרושעת הרכב או ממוצע על כל הקימורים:
ma.plotMeanMSD
לשנות את y- וציר x ליניארי לסולם לוגריתמים. לעתים פיגור ארוך, עקומות MSD להיות רועשות בשל סטטיסטיקה די בלוחות זמנים ארוכים יותר. עקומות MSD יכולות גם לעלות בתלילות עקב שגיאה דינמית. אזורים אלה של העקומה ניתן להסיר על ידי שימוש בכלי המברשתכדי לבחור את הסוף של העקומה ובחירה 'צחצוח'> 'הסר לא מוברש' בתפריט כלים.
- ייבא את מסלולי חלקיקים על ידי הקלדה:
- הורד Ezyfit בhttp://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ ולהוסיף Ezyfit לתיקייה השייכים לדרך Matlab (למשל C: Documents and Settings <שם משתמש> המסמכים שלי Matlab). התקן את תפריט Ezyfit על ידי הקלדה בסביבת עבודת Matlab efmenu להתקין. הפעל מחדש MATLAB עם תפריט Ezyfit בחלון הדמות. להתאים את קימורי MSD לחוק החשמל על ידי בחירה בתפריט Ezyfit 'הצג Fit'> 'הכוח'> '* x ^ n' היו n הוא α המעריך diffusive המוערך.
הערה: msdanalyzer דורש Curve Fitting ארגז כלים ב- Matlab להתאמה של עקומות MSD. Ezyfit היא אלטרנטיבה ותוכנה חופשית שיכול לבצע עקומה הולמת. - מסלולים ברורים הנוכחיים חלקיקים וMSDS לחשב MSDS חלקיקים החדש במקומות או זמן אחרים:
בָּרוּר לאחר החישוב של עקומות שונות ממוצע MSD של חלקיקים במדיום (שליטה), וmicrocolonies ואזורים מובחנים של זנים שונים, להעתיק ולהדביק את העקומות לתוך גרף אחד להשוואה. נוקשות מדגם ועליית crosslinking עם ערכי MSD נמוכים יותר. יש עקומות שטוחים α נמוך ומדגם הוא גמיש יותר מאשר עיקולים תלולים יותר עם α גבוה יותר. - בחר את העקומה וללכת "כלים" להסתכל על סטטיסטיקת נתונים, כגון חציון וטווח. MSD של חרוז הוא פרופורציונאלי לעמידת השרץ, J (t) של החומר שבו חרוז מוטבע על פי היחס,
שבו J = ציות השרץ, קוטר d = חלקיקים, k B = T = טמפרטורה קבועה בולצמן, וt = זמן.
- לחלץ את תיקייתmsdanalyzer 15 ושחרר אותו בתיקייה ששייכת לנתיב Matlab (למשל C: Documents and Settings <שם משתמש> המסמכים שלי Matlab). התחל Matlab וליזום את המנתח על ידי הקלדה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאפייני viscoelastic המקומיים של biofilm באזורים שונים של biofilm, שכלל החללים (בינוני מעל biofilm), מישורים (שכבה שטוחה של תאים שלא עברה התמיינות) וmicrocolonies (ראה תוויות באיור 2 א) נחקרו. השינויים זמניים בנכסי viscoelastic של biofilm במהלך התבגרות מימים 3 עד 5 היו גם נקבעו. MSD של החלקיקים בחללים שימש כביקורת והשוואה לMSD של חלקיקים במדיום טהור. לעומת זאת, חלקיקים שנלכדו בbiofilm רטט בעמדות קבועות וערכי MSD נעו בין אלה אופייניים לחומרי viscoelastic לג'לי מאוד אלסטי (איור 3).
הרירי פ aeruginosa wild-type וזניה PEL Δ מוטציה (איור 2 א ו -2 ב) פיתחו microcolonies פזורים על מישור דק ביום 3 בbiofilms. רגיל ביום 3 היה רזה מדי לחקירה של מאפייני rheological. בשני biofilms נוצר על ידי פ הרירי זני aeruginosa wild-type וPEL Δ, MSD של חלקיקים ביום 3 microcolonies היה תלוי בזמן לזמן של 0.1 שניות מפגר עד 10 שניות (α = 0), מצביע על כך שmicrocolonies היה אלסטי (איור 4, טבלת 1) . התאמות השרץ החציון מחושבות מMSDS החלקיק המקביל היו 4.3 x 10 -2 אבא -1 ובהתאמה 3.6 x 10 -2 אבא -1. ביום 5 ציות השרץ של microcolonies בפ הרירי זן פראי סוג aeruginosa עלה ל 2.5 x 10 -1 אבא -1, המצביע על ירידה בcrosslinking היעיל בתוך המטריצה. 5 microcolonies היום היה עדיין אלסטי עם α = 0. PEL Δ לא שינה בrheology מימים 3 עד 5. מישורים בפ הרירי aeruginosa wild-type וזני PEL Δ היו סימיLar בגמישות (α = 0) וcrosslinking היעיל ליום 3 microcolonies, אשר יכול להיות רעיוני של בשלותם (מבנה מובחן).
Biofilms נוצר על ידי זן המוטציה PSL Δ (איור 2 ג) היו פחות מובחן ועיכב בפיתוח. זה הביא biofilms עם מישורים עבים שהתפתחו לאחר microcolonies 3. ערכי MSD היום הראה כי biofilms היה הרבה פחות יעיל מאשר crosslinked פ aeruginosa wild-type וזני PEL Δ (איור 4, טבלת 1). המישורים היו viscoelastic, עם α = 0.12 0.26 ובימים 3 ו -5 בהתאמה. עמידת השרץ החציוני של יום 3 ו -5 מישורים הייתה 1.0 אבא -1. כאשר microcolonies פיתח ביום 5, עמידת השרץ שירדה ל 2.8 x 10 -1 אבא -1, המציין כי crosslinking סף נדרש לבידול microcolony. However, עמידת השרץ הייתה עדיין גדולה יותר מעמידת השרץ של יום צעיר 3 פ הרירי aeruginosa wild-type וmicrocolonies Δpel. 5 microcolonies היום היה viscoelastic עם α = 0.34. לפיכך, פ biofilm aeruginosa הוא אלסטי וcrosslinked מאוד בהעדר פל. בהעדר PSL, biofilm הפך viscoelastic ופחות crosslinked. במבני biofilm הבוגרים כגון microcolonies, ביטוי של שני פל וexopolysaccharides PSL הביא הבדלי rheological מובהקים על פני זמן. הירידה בcrosslinking יכולה להיות כתוצאה מהירידה של PSL לexopolysaccharides פל במטריצת biofilm במהלך התבגרות.
איור 1:. Microrheology מעקב חלקיקים בbiofilm () מעגלי גריי מתארים חלקיק MSD בחומר צמיג, אשר גדל באופן ליניארי עם זמן וα = 1. משולשים שחורים מתארים חלקיק MSD של חומר אלסטי, שאינו תלוי בזמן ו= 0. (ב) תרשים של חלקיק בדיקה רוטטת ברווח למניה של biofilm. החלקיקים הוא מודל כמו תא חיידקים ודומה בקוטר. הפולימרים המטריצה שעוטפים את החלקיקים קטנים בהרבה מאשר החלקיקים.
איור 2: דואר P v erspecti וחתך vi ה W של ד y y 5 biofilms (ירוק) ב y ו con עמ microsco מהספריה לאחר n קונטי uous < strong> ו eeding עם 1.0 מ 'μ (סגול), 0.5 מ' μ (אדום) ו -0.2 מ 'μ r (הכתום) הרשות ticles עם משטח carboxylated טעון שלילי. Biofilms נוצר מ() פ הרירי aeruginosa, ומוטציות PEL (B) Δ ו- (ג) Δ PSL זנים. חלקיקים משולבים בכל האזורים של biofilm. דוגמאות של microcolonies, מישורים וחללים מסומנות ב (א). שונה מet al צ'ו., MBio 2014 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
fig3.jpg "/>
איור 3:. מסלולי חלקיקים השוואה של מסלול של חלקיק ביצוע התנועה בראונית במדיום גידול (צבעוני) בהשוואה למסלולים של חלקיקים הרוטטים בmicrocolonies biofilm (כחול כהה). הצבעים מפולחים מצביעים הפסקות במעקב בשל חלקיקים נעו מחוץ לפוקוס בZ-המטוס.
איור 4:. MSDS של 1.0 מיקרומטר חלקיקים בbiofilms פ הרירי aeruginosa הוא אלסטי וmicrocolonies מופחת בcrosslinking היעיל מימים 3 עד 5; PEL Δ הוא אלסטי ולא משנה בrheology מימים 3 עד 5; PSL Δ הוא viscoelastic ומורכב בעיקר מישורים שאינם משתנים באופן משמעותי בrheology מימים 3 עד 5.
| זן | יְוֹם | האזור </ Td> | חציון זחילה תאימות (אבא -1) |
| טיפוס פראי | 3 ימים | Microcolony | 4.3 x 10 -2 |
| טיפוס פראי | 5 ימים | Microcolony | 2.5 x 10 -1 |
| טיפוס פראי | 5 ימים | מִישׁוֹר | 4.1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 ימים | Microcolony | 3.6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 ימים | Microcolony | 3.6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 ימים | מִישׁוֹר | 3.2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 ימים | מִישׁוֹר | 1.0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 ימים | מִישׁוֹר | 1.0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 ימים | Microcolony | 2.8 x 10 -1 |
טבלת 1: התאמות חציון השרץ ומעריכי diffusive משוערות של wild-type וזנים מוטנטים בהתאם לגיל biofilm ואזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microrheology הוא כלי שימושי למדידות rheological מקומיות במערכות הטרוגניות, כגון biofilms חיידקים. זוהי טכניקה שאינה הרסנית, המאפשרת ניטור של שינויי rheological בתוך המדגם זהה ביולוגי על נקודות זמן מרובות בזמן אמת. בפרוטוקול זה, microrheology מעקב חלקיקים היה מוחל על פל ומוטציות exopolysaccharide PSL כדי לחקור כיצד הם משפיעים על הגמישות וcrosslinking היעיל של מטריצת biofilm. PSL מעדיף את ההתפתחות של biofilms אלסטי עם crosslinking היעיל גבוה, ואילו פל מעדיף viscoelastic וbiofilms הרופף יותר. כאשר שני exopolysaccharides מיוצר, microcolonies biofilm הופך פחות יעיל crosslinked כbiofilm מתבגר, עולה בקנה אחד עם ירידה בPSL על פל.
יש לי biofilms נוצר על ידי מיני חיידקים שונים קומפוזיציות EPS נפרדות. EPS של פ הרירי זני aeruginosa שימשו במחקר זה בעיקר consi STS של exopolysaccharides 16. מינים אחרים עשויים להשתמש בחלבוני הדבקה תאיים גדולים 17 ו- DNA 18 כמרכיבים העיקריים שלהם EPS. הגישה שתוארה כאן יכולה לשמש כדי לקבוע את תרומת rheological של רכיבי EPS אחרים והשפעתם על צמיחה. בנוסף, biofilms גדל בהגדרות שונות עשוי להיות בעלי תכונות פיזיות שונות באופן דרסטי המשפיעות rheology. לדוגמא, רירי פ aeruginosa בתוספת גלוקוז יוצר יותר biofilm עם מבנים מובחנים מאוד בהשוואה לתזרים תנאי סטטי. מחקרים הראו גם כי biofilms נחשף למאמץ גזירה כגון זרימה הופכת את biofilms יותר מלוכדת וגמיש 19,20. צעדים וגורמים חשובים להביא בחשבון לצורך מחקר microrheology חלקיקי מעקב biofilm מוצלח הם כדלקמן:
ממדי המערכת לחקירה או בקנה מידה של עניין ביחס לזמן ולמרחב
תוכן "> כאשר שוקלים קשקשים מרחבית, יש לקחת בחשבון את הגודל של המבנים שיוצרים את מאפייני viscoelastic של המערכת (במקרה שלנו, הפולימרים של מטריצת biofilm). הפולימרים המקיפים את חלקיקי הבדיקה צריך להיות הרבה יותר קטנים ב מבנה מהחלקיקים ולהציג סביבת איזוטרופיים לחלקיקים. הדמיה ברזולוציה גבוהה נדרש כדי ללכוד תנועת חלקיקים קטנה או רעידות, אבל יפחית את כמות השטח צילמה לגודל קובץ שווה ערך. כאשר שוקלים קשקשים זמניים, biofilms אלסטי כי התערוכה איטית דינמיקה דורשת לוקחת קטעי וידאו על סולמות זמן ארוכים יותר (למשל HR) ושימוש במסגרת שיעורים נמוכים (למשל דקות). קטעי וידאו קצרים שניתן לנקוט לbiofilms viscoelastic עם דינמיקה מהירה (דקות), אך דורשת שיעורים גבוהים מסגרת (שניות או millisec). שימוש מתאים רזולוציה, מסגרת הדולר, וידאו משך עבור כל ניסוי ישמור קובץ בגדלים נמוך לניתוח צייתן.viscoelasticity biofilm, הואterogeneity וממדים
תנועת חלקיקים עשויה להיות בלתי ניתנת לגילוי בbiofilms מאוד אלסטי (MSD <10 -4). במקרים כאלה, טכניקות microrheological פעילה שתפעלנה כוח כדי לעקור את החלקיקים עדיפות. דגימת rheological של אזורים השונים של biofilm צריכה להיעשות כדי להבטיח את ההטרוגניות המכנית של biofilm הוא נתפסה. מורפולוגיה הטרוגנית, לעומת זאת, אינה בהכרח אינדיקציה טובה של הטרוגניות מכאנית, כלמרות הופעות הומוגנית biofilm יכול להיות מורכב בrheology: biofilms Δpsl יותר הומוגנית במורפולוגיה ועיכב בבידול, אבל יש לי פרופיל rheological מורכב והטרוגנית. לעומת זאת, יש לי biofilms Δpel מראה הטרוגנית עם microcolonies המובחן היטב אבל rheology קבוע לאורך biofilm. לbiofilms עם ממדים גדולים של microcolony משמעותי, זה יכול להיות (> 50 מיקרומטר בקוטר וגובה למשל)Tudy הבדלי rheological לפי גובה (עליון ותחתון של microcolonies), או מרחק מקצה microcolony.
בחירה של חלקיקי בדיקה
כפי שתואר לעיל, בגודל של חלקיקים צריך להיות גדול יותר מהמבנים של החומרים שיוצרים מאפייני viscoelastic. בנוסף, חלקיקים עם כימיה של פני השטח שונה עלולים לגרום למחייבים רכיבי אזורים וEPS שונים בתוך biofilm. כך ההשפעות של חלקיקים עם כימיה של פני השטח שונה צריכים להיחקר כך שההטרוגניות biofilm יכולה להיחשב. כל חלקיקי הבדיקה צריכים להיות פוטנציאל זטה גבוה כדי למזער מסכת. חלקיקים שקושרים יחד לא יכולים לשמש כבדיקות מדויקות וצריכים להיות מחוץ ניתוח.
מזעור של סחיפה
הסחף יכול להיגרם על ידי טמפרטורה או לחץ אוויר שינויים, תנועת הבמה מיקרוסקופ (בדרך כלל בZ-הכיוון), אנטי-Vחוסר איזון ibration שולחן וזרימה פנימית בתוך המערכת. מרחף בדרך כלל התוצאה של superdiffusion של החלקיקים וα> 1. α> 1 מצביע על כך שמלבד אנרגיה תרמית, תהליכים פעילים הם חלקיק נע מעורב וmicrorheology הפסיבי אינו ישים.
תחזוקת תרבות biofilm הנכון
תאי זרימה חייבים להיות התאספו כראוי כדי למנוע דליפות וbiofilms חייב להיות נקי מזיהום. ניתן גם גדל biofilms בחלופה הגדרות אחרות לתא הזרימה, כגון מגלשות וmicrowells לתנאי culturing סטטי. מיקרוסקופ הפוך צריך לשמש הדמיה של microwells.
לסיכום, microrheology מעקב חלקיקים הוא טכניקה שימושית שיכול להיות מועסק באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים למעבדה ביולוגית. בנוסף, תוכניות מעורבות בחישוב והניתוח של MSDS חלקיקים היא זמינה בתחום הציבורי.לדוגמא, msdanalyzer וTrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) הן תוכניות הפועלות בסביבת Matlab. עם זאת, בגלל הטכניקה מסתמכת רק על אנרגיה תרמית כדי להעביר את החלקיקים, אין ביכולתה לפתור בין הדגימות של גמישות גבוהה יותר. טכניקות פעילים, כגון tweezing המגנטי, להפעיל כוח על החלקיק לפעול ובלנוע בתוך המדגם ויהיה מסוגל לקבוע את viscoelasticity של דגימות אלסטיות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למחקר ומשרד החינוך סינגפור תחת מרכזו המחקר של אקסלנס תכנית, המענקים הזנק (M4330002.C70) מהאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג, וAcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) ממשרד החינוך, סינגפור. המחברים מודים ג'ואי ים Kuok הונג להשתתפות בהפגנה של פרוטוקול זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
