Introduction
La plupart des cellules bactériennes sont en mesure d'employer planctoniques (sans vie) et (sessiles) modes de croissance de 1 attaché de surface. Dans le mode de croissance fixé en surface, les cellules bactériennes sécrètent et se envelopper dans de grandes quantités de substances polymériques extracellulaires (EPS) à former des biofilms. Les EPS se compose principalement de protéines, de l'ADN, exopolysaccharide extracellulaire et est essentielle à la formation de biofilm 2. Il sert d'échafaudage physique par lequel les bactéries peuvent utiliser pour différencier spatialement et protège les bactéries de conditions environnementales nuisibles et les réponses de l'hôte. Différents composants de l'EPS ont des rôles distincts dans la formation de biofilm 3 et les changements dans l'expression des composants EPS peut considérablement remodeler les structures de biofilm 4. Composants EPS peuvent également fonctionner comme des molécules de signalisation 5, et des études récentes ont montré certains composants EPS qui interagissent avec des cellules microbiennes pour guider leurs diff de migration et de biofilmérentiation 6-8.
La recherche sur l'EPS a considérablement avancé, basé sur les analyses morphologiques des biofilms produites par mutants défectueux dans un composant spécifique des EPS 9,10. En outre, l'EPS est généralement caractérisée à la macro-échelle (caractérisation vrac) 11. Morphologique analyse ne peut cependant manquer de précision quantitative et la caractérisation vrac, qui retourne des valeurs moyennes, perd le détail qui existe au sein de l'hétérogénéité du biofilm. Il ya maintenant une tendance croissante à progresser à la caractérisation en temps réel des propriétés mécaniques des EPS à la micro-échelle. Ce protocole montre comment particule de suivi microrhéologie est capable de déterminer les effets spatio-temporelle des composants de la matrice et des exopolysaccharides Pel Psl sur la viscoélasticité et la réticulation efficace de biofilms de Pseudomonas aeruginosa 4.
Microrhéologie passive est une rh simple et peu coûteuxméthode de eology qui fournit le plus haut débit de l'échantillonnage microrhéologiques spatiale d'un matériau à ce jour 12,13. Dans microrhéologie passif, des sphères de sondes sont placés dans l'échantillon et leur mouvement brownien, grâce à des énergies thermiques (k B T) est suivie par microscopie vidéo. Plusieurs particules peuvent être suivis en même temps, et les coordonnées dépendantes du temps des particules suivent une marche aléatoire classique. Par conséquent, en moyenne, les particules restent à la même position. Cependant, l'écart-type des déplacements ou le déplacement quadratique moyenne (MSD) des particules, est non nulle. Depuis fluides visqueux coulent, la particule MSD dans un fluide visqueux croît linéairement avec le temps. Par contre, la réticulation polymérique viscoélastique trouve dans ou substances élastiques aider à résister à l'écoulement, et les particules deviennent limitées dans leur déplacement, ce qui conduit à des plateaux de la courbe MSD (figure 1A). Cette observation suit la relation MSDαt
La chimie taille, la densité et la surface de la particule sont essentiels à l'application correcte de l'expérience microrhéologiques et sont choisis par rapport au système étudié (dans ce cas, les polymères de la matrice du biofilm, voir figure 1B). Tout d'abord, la mesure de la rhéologie des particules de la substance avec des structures qui sont beaucoup plus petites que la particule elle-même. Si les structures de la substance sont d'ampleur similaire à la particule, le mouvement de la nominaleticle est perturbé par la forme et l'orientation des structures individuelles. Toutefois, si les structures environnantes de la particule sont beaucoup plus petits, cet effet est faible et moyenne, à présenter un environnement homogène à la particule (figure 1B). D'autre part, la densité de la particule doit être similaire à la moyenne (1,05 g ml -1 pour les médiums à base d'eau) de manière que la sédimentation est évitée et les forces d'inertie sont négligeables. La plupart des particules avec treillis polystyrène répondent aux critères ci-dessus. Idéalement, la particule ne pas interagir avec les polymères de la matrice du biofilm que l'interprétation rhéologique de MSD de particules est valable uniquement si le mouvement est aléatoire, entraînée par l'énergie thermique et de collision avec les structures de la substance. Ceci peut être observé en vérifiant si la particule sonde tend à lier ou rebondir sur la surface d'un biofilm pré-adulte. Toutefois, malgré le manque d'attirance pour le biofilm, les particules doivent pouvoir être incorporés dans la matrice.De plus, l'hétérogénéité physico-chimique du biofilm peut se traduire par des particules différentes étant mieux adaptée en tant que sondes dans les différentes régions du biofilm. Ainsi, des particules de différentes tailles et la chimie de surface devraient être appliqués au biofilm.
En tant que tel, le MSD particule est en mesure de fournir des informations utiles sur la façon dont différents composants contribuent à la rhéologie et la propagation du biofilm. En outre, l'utilisation de différentes sondes permet d'obtenir des informations sur l'hétérogénéité spatiale physico-chimique du biofilm. Ce procédé peut être utilisé pour tester l'effet d'un traitement antimicrobien sur les propriétés mécaniques du biofilm, ou appliqué sur les biofilms d'espèces mélangées pour étudier la façon dont les propriétés mécaniques du film biologique sont modifiés à partir de l'introduction d'une autre espèce. Particules TMS peut aussi être utile pour la caractérisation de la dispersion du biofilm. Ces études seraient utiles dans notre compréhension des biofilms, potentiellement améliorer les traitements des biofilms une génie des biofilms pour des activités utiles.
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Protocol
1. biofilm Culture
- Préparation de Souches bactériennes
- 1 jour avant la culture du biofilm, préparer des cultures bactériennes planctoniques par inoculation de 2 ml de milieu de croissance approprié de culture bactérienne congelé. Utilisez milieu Luria-Broth (10 g L -1 NaCl, 10 g d'extrait de levure L -1, et 10 g L -1 tryptone) pour mucoïde P. aeruginosa et ses Δ pel et Δ PSL mutants défectueux. Incuber une nuit à 37 ° C et 200 rpm conditions secouant. Diluer cultures d'une nuit à une DO 600 de 0,40 à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Assembler configuration de cellule d'écoulement, ce qui a été décrit précédemment 14, de préférence sur une station ou un chariot mobile qui peut être amené dans la chambre de microscope pour l'imagerie de la cellule d'écoulement sans démontage.
- Préparer un milieu de croissance stérile dans L 2 ou L 5 bouteilles pour chaque cellule d'écoulement. Utilisez milieu minimal M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH 4 Cl, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO 4, et 0,1 mM de CaCl2) supplémenté avec 0,04% de glucose (poids / volume) et 0,2% (poids / volume) casaminoacides) pour P. aeruginosa biofilms flux de cellules.
- Microsphères fluorescentes aliquote dans des microtubes et filent dans H 2 O stérile pendant 5 min dans la centrifugeuse à 9,391.2 g. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de milieu de croissance pour supprimer l'azide de sodium (désinfectant) avant d'ajouter à un milieu de croissance dans 2 L ou L 5 bouteilles de taille.
NOTE: Différentes tailles de microsphères viennent dans différentes concentrations et doivent être dilués en conséquence les instructions. Par exemple, disperser 120 ul de 1,0 um microsphères de diamètre, 15 ul de 0,5 um microsphères de diamètre et 0,96 pi de 0,2 um microsphères de diamètre dans 2 L de milieu de croissance pour donner 2,18 × 10 6 microsphères ml -1 pour chaque taille de particule. - Fixer la bouteille moyenne à UPSTrame de cellule d'écoulement et permettre milieu de croissance de circuler à travers toute l'installation. Arrêter l'écoulement et injecter cultures de la nuit dilué dans des chambres de la cellule d'écoulement. Permettre aux bactéries de se fixer au substrat de lamelle couvre-objet pendant 1 heure avant de continuer l'écoulement de milieu de croissance à un taux d'environ 5,5 x 10 -3 m s -1, ou 8 tours par minute avec une pompe péristaltique écoulement.
NOTE: Les biofilms sont généralement cultivées à la température ambiante (25 ° C) pendant 3-7 jours. - En variante, pour la configuration de culture statique, diluer 100 fois cultures d'une nuit dans des tubes de microcentrifugation en ajoutant 10 ul d'une culture d'une nuit de milieu de croissance ml de particules. Augmenter la concentration des particules dans le milieu de croissance de culture statique d'environ 500 fois par rapport à celle utilisée pour les films biologiques d'écoulement (par exemple, laver et remettre en suspension 600 ul de 1,0 um sphères d'un diamètre dans 10 ml de milieu de croissance) comme biofilms de cellules d'écoulement sont constamment réapprovisionné avec particules, mais les cultures ne sont pas statiques.
- Ajouter 2001; l de culture de nuit diluée avec des particules dans les chambres de 8 diapositives ainsi. Incuber à 37 ° C dans des conditions statiques. Les biofilms sont généralement cultivées pendant 1 nuit. Remplacer milieu de croissance journalier passé avec le milieu de croissance frais avec des particules si biofilm est cultivée pour plus de 1 jour.
2. Microscopie
- Le jour 3 et 5, éteignez débit de la pompe péristaltique et mettre la configuration de la cellule d'écoulement dans la salle de microscopie. Tube de serrage près de l'entrée et la sortie des chambres de cellules de flux pour éviter la dérive (une cause d'erreur systématique par des changements dans l'environnement) de flux. Placer la cellule d'écoulement sur la platine du microscope de un microscope droit.
REMARQUE: Utilisez un microscope inversé pour l'imagerie de micropuits. - Utilisez la microscopie à fluorescence avec 40X objectif d'huile de prendre des vidéos du mouvement de microsphères embarqués dans le biofilm à divers endroits (microcolonies et couches indifférenciées plat) et à des jours différents (jour 3 et 5) pourenquêtes temporelles et spatiales. Prenez des vidéos courtes avec un taux de trame plus élevée pour enquêter sur les événements qui se produisent au sein de courtes échelles de temps (par exemple 1,5-3 min vidéos à taux de 25-50 images par seconde pour la dynamique rapide de trame), et des vidéos plus longues avec un taux de cadre inférieur pour enquêter sur les événements de plus de plus de temps échelles (par exemple des vidéos de 15-30 min à taux de 2,5-5 images / sec pour une dynamique plus lente cadre).
NOTE: Une vidéo contient généralement 5-10 particules, et est typiquement de 1,0-2,5 Go en taille de fichier. Grandes microcolonies peuvent détenir plus de particules. Prenez 5-10 vidéos pour chaque catégorie (par exemple 5-10 vidéos de différents microcolonies et de différents endroits dans les couches plates indifférenciées). Le biofilm a une architecture hétérogène qui peut consister en microcolonies, des canaux, des vides et des couches plates indifférenciées. - Enregistrer des vidéos en format approprié qui peut être lu par les Fidji / ImageJ (par exemple CZI, TIF).
- Vérifiez vidéos pour la dérive en faisant défiler vid finieo et en observant que les particules ne se déplacent pas dans le même sens en même temps. La dérive peut être provoquée par le mouvement z-étape, les courants dans la cellule d'écoulement, le déséquilibre de table anti-vibration, pression d'air ou des variations de température. Corriger mineure à la dérive en utilisant des techniques de post-traitement généralement fournis avec le logiciel de microscope. Jeter toutes les vidéos dans lequel la dérive ne peut pas être corrigée. Enregistrer les paramètres suivants, qui sont nécessaires lors de repérage et d'analyse de particules: Résolution (px / um), Number of Frames, Durée.
- Retirez la cellule de flux de platine du microscope et de redémarrer la pompe péristaltique continuer à cultiver le biofilm.
3. particules repérage et d'analyse
- Obtenir les trajectoires des particules en utilisant le plug-in TrackMate dans les logiciels open source (ImageJ). Télécharger Fidji au http://fiji.sc/Fiji. Ouvrez la vidéo avec les Fidji et sous le menu Plugins, sélectionnez Suivi et TrackMate.
- Vérifiez et ajustez les paramètres dans THfenêtre e suggérant réglages initiaux d'étalonnage pour correspondre aux paramètres vidéo comme enregistré dans l'étape 2.4.
- Détecter des particules dans TrackMate utilisant ImageJ.
- Sélectionnez 'détecteur Log', le diamètre des particules d'entrée et la valeur de seuil (par exemple 1000). Faites défiler la vidéo tout en cliquant sur le bouton Aperçu pour vérifier que les cercles pourpres suivent les particules tout au long de la vidéo. Ajustez les valeurs de diamètre et de seuil que nécessaire: augmenter la valeur de seuil si cercles pourpres apparaissent dans l'espace vide. Réduire la valeur de seuil si pas assez de particules sont détectées. Cliquez sur le bouton Suivant pour terminer la détection des particules.
- Cliquez sur le bouton à côté lorsqu'ils sont présentés avec la possibilité d'ajouter ou de retirer les particules détectées dans «seuil initial», «Choisissez une vue 'et' sélectionner un filtre« fenêtres de continuer sans ajustement si la détection de particule initiale était satisfaisante.
- Sélectionnez 'LAP Tracker Simple' dans le optisur la barre de «Sélectionnez une méthode de suivi" fenêtre particules se déplacent rarement de mise au point dans le biofilm et sont facilement suivis. Utilisez les valeurs de distance max suggéré ou faible liaison et de l'écart à la clôture, et cliquez sur suivant.
- Vérifiez que le suivi de particules est satisfaisante en faisant défiler la vidéo pour voir ce que les particules suivent les pistes tracées par TrackMate, et qu'il n'y a pas de pistes non désirées ou manquants. Passer les différentes étapes de filtrage. Aller à la dernière fenêtre «Sélectionner une action». Sélectionnez 'pistes Exporter vers un fichier xml' du menu déroulant et cliquez sur «Exécuter». Choisissez un dossier pour enregistrer les pistes.
NOTE: Il existe divers programmes disponibles dans le domaine public pour l'analyse des trajectoires des particules et de l'utilisation des microrhéologie. msdanalyzer et TrackArt sont des exemples de suivi des particules programmes d'analyse qui fonctionnent dans l'environnement Matlab.
- Préparer Matlab pour importer les trajectoires des particules dans les fichiers xml en sélectionnant dans le menu deMatlab Fichier> Définir le chemin ... et ajoutez les scripts dossier disponible avec le paquet Fidji.
- Pour analyser les trajectoires des particules avec msdanalyzer, le lien pour télécharger le fichier zip ou le fichier tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Extraire le dossiermsdanalyzer 15 et déposez-le dans un dossier qui appartient à la trajectoire Matlab (par exemple C: Documents and Settings <Nom d'utilisateur> Mes Documents Matlab). Commencez Matlab et de lancer l'analyseur en tapant:
MA = msdanalyzer (2, «euh», «sec»)
où um et sec sont les unités de temps et d'espace physique dans la vidéo.- Importez les trajectoires des particules en tapant:
[pistes, MD] = importTrackMateTracks ('filename.xml', 'CLIPZ';, 'Scalet')
MA = ma.addAll (pistes);
où «CLIPZ 'supprime la dimension z une vidéo 2D, et' scalet '. - Tracer les trajectoires ONTO graphique à l'aide:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Calculer les TMS des particules à l'aide:
MA = ma.computeMSD;
ma.msd - Tracer les TMS de chaque particule:
figure
ma.plotMSD - Combinez les trajectoires des particules d'autres vidéos du même categery (par exemple des particules intégrées dans microcolonies de type sauvage au jour 3) en répétant 3.5.1.1 à 3.5.1.4).
- Tracer la moyenne de l'ensemble ou de la moyenne sur toutes les courbes:
ma.plotMeanMSD
Changez le Y et l'axe x de linéaire à échelle logarithmique. Au temps de latence longs, les courbes de TMS deviennent bruyant à cause de manque de statistiques à plus longue échéance. Les courbes de TMS peuvent également augmenter fortement en raison d'une erreur dynamique. Ces régions de la courbe peuvent être retirés à l'aide de l'outil pinceaupour sélectionner la fin de la courbe et en sélectionnant «brossage»> «Retirer non gratté» dans le menu Outils.
- Importez les trajectoires des particules en tapant:
- Télécharger EzyFit au http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ et ajoutez EzyFit à un dossier appartenant à la voie Matlab (par exemple C: Documents and Settings <Nom d'utilisateur> Mes Documents Matlab). Installez le menu EzyFit en tapant dans Matlab espace de travail efmenu installation. Redémarrez MATLAB avec le menu EzyFit dans la fenêtre de figure. Monter les courbes MSD à la loi de puissance en sélectionnant dans le menu EzyFit 'Show Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' étaient n est l'exposant de diffusion α estimé.
REMARQUE: msdanalyzer nécessite l'ajustement de courbe Toolbox dans Matlab pour le montage de courbes MSD. EzyFit est une alternative du logiciel libre et qui peut effectuer l'ajustement de courbe. - Les trajectoires des particules actuelles clair et TMS pour calculer de nouvelles TMS de particules d'autres endroits ou le temps:
clair Après le calcul des diverses courbes moyennes de TMS de particules dans un milieu (contrôle), et microcolonies et zones indifférenciées de diverses souches, copier et coller les courbes dans un graphique pour la comparaison. Raideur échantillon et réticulation augmentation avec des valeurs inférieures de TMS. Courbes plat inférieurs α et l'échantillon est plus élastique que les courbes raides avec plus α. - Sélectionnez la courbe et cliquez sur "Outils" de regarder les données statistiques, telles que la médiane et la gamme. La MSD de la bille est proportionnelle à la compliance de fluage, J (t) de la matière dans laquelle est noyée la bille en fonction de la relation,
où J = respect de fluage, d = diamètre de particule, k B = constante de Boltzman, T = température et t = temps.
- Extraire le dossiermsdanalyzer 15 et déposez-le dans un dossier qui appartient à la trajectoire Matlab (par exemple C: Documents and Settings <Nom d'utilisateur> Mes Documents Matlab). Commencez Matlab et de lancer l'analyseur en tapant:
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Representative Results
Les propriétés viscoélastiques locaux du biofilm dans différentes régions du biofilm, qui comprenait les vides (moyennes au-dessus du biofilm), des plaines (couche de cellules indifférenciées plat) et microcolonies (voir les étiquettes de la figure 2A) ont été étudiés. Les changements temporels de propriétés viscoélastiques de la maturation du biofilm pendant 3 jours à 5 ont également été déterminés. La MSD des particules dans les vides a été utilisé comme témoin et comparable à la MSD de particules dans un milieu pur. En revanche, les particules piégées dans le biofilm en vibration à des positions fixes et les valeurs de TMS allaient de celles qui sont typiques des matériaux viscoélastiques à des gels fortement élastiques (Figure 3).
Mucoïde P. de type sauvage aeruginosa et ses souches mutantes Δ de PEL (Figure 2a et 2b) développés microcolonies éparpillés sur une plaine mince par jour 3 dans leurs biofilms. La plaine le jour 3 était trop mince pour leétude des propriétés rhéologiques. Dans les deux biofilms formés par le P. mucoïde souches de type sauvage aeruginosa et Δ pel, le MSD de particules dans la journée 3 microcolonies était indépendante du temps pour les décalages dans le temps de 0,1 s à 10 s (α = 0), ce qui indique que les microcolonies étaient élastiques (figure 4, tableau 1) . Les conformités de fluage médianes calculées à partir des TMS de particules correspondantes étaient de 4,3 x 10 -2 Pa -1 et 3,6 x 10 -2 Pa -1 respectivement. Le jour 5, le respect de fluage des microcolonies en mucoïde P. aeruginosa souche de type sauvage a augmenté à 2,5 x 10 -1 Pa -1, indiquant une réduction de réticulation efficace au sein de la matrice. Le jour 5 microcolonies étaient encore élastique avec α = 0. Δ pel n'a pas changé en rhéologie de jours 3 à 5. Les plaines mucoïde P. de type sauvage aeruginosa et souches de pixels ô étaient SimiLAR de l'élasticité (α = 0) et la réticulation efficace pour jour 3 microcolonies, qui pourrait être le reflet de leur maturité (structure indifférenciée).
Les biofilms formés par Δ souche mutante PSL (figure 2C) étaient moins différenciée et un retard de développement. Il en est résulté des biofilms avec plaines épaisses qui se sont développées microcolonies après jour 3. Les valeurs de TMS a montré que les biofilms étaient beaucoup moins efficace réticulé que P. de type sauvage aeruginosa et souches de pixels ô (figure 4, tableau 1). Les plaines étaient viscoélastique, avec α = 0,12 et 0,26 aux jours 3 et 5 respectivement. Le respect de fluage médian de jour 3 et 5 plaines était de 1,0 Pa -1. Lorsque microcolonies ont mis au point en jours 5, la compliance de fluage avait diminué à 2,8 x 10 -1 Pa -1, indiquant qu'un seuil de reticulation est requis pour la différenciation des microcolonies. However, le respect de fluage était encore supérieure à la compliance au fluage de la jeune jour 3 mucoïde P. de type sauvage aeruginosa et microcolonies Δpel. Le jour 5 microcolonies étaient viscoélastique avec α = 0,34. Ainsi, le P. aeruginosa biofilm est élastique et hautement réticulé en l'absence de Pel. En l'absence de Psl, le biofilm est devenu moins viscoélastique et réticulé. Dans les structures de biofilms matures tels que les microcolonies, l'expression de deux exopolysaccharides Psl Pel et a donné lieu à des différences distinctes rhéologiques au cours du temps. La réduction de la reticulation peut être dû à la réduction de Psl à exopolysaccharides Pel dans la matrice du biofilm pendant la maturation.
Figure 1:. Particules suivi microrhéologie dans un biofilm (A) cercles gris représentent particules TMS dans une substance visqueuse, qui croît linéairement avec le temps etα = 1. Les triangles noirs représentent MSD particules d'une substance élastique, qui est indépendant du temps et a = 0. (B) Schéma de particule sonde vibrante dans les EPS du biofilm. La particule est modélisée comme une cellule de bactéries et est similaire en diamètre. Les polymères de la matrice qui enveloppent les particules sont plus petites que la particule.
Figure 2: P erspecti v e et VI e w coupe de d Y 5 biofilms (vert) b y con f Ocal microsco p y après conti n ue < strong> f eeding avec 1,0 μ m (violet), 0,5 μ m (rouge) et 0,2 μ m (orange) pa r ticles avec une surface carboxylée chargé négativement. Les biofilms formés à partir de (A) mucoïde P. aeruginosa, et des mutants (B) de l'élément d'image et Δ (C) Δ souches psl. Les particules sont incorporées dans toutes les régions du biofilm. Exemples de microcolonies, les plaines et les vides sont marqués en (A). Modifié à partir de Chew et al., MBIO 2014 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
fig3.jpg "/>
Figure 3:. Trajectoires de particules Comparaison d'une piste d'une particule exécution mouvement brownien dans un milieu de croissance (multicolore) par rapport aux pistes de particules vibrant en microcolonies biofilm (bleu foncé). Les couleurs segmentés indiquent une rupture dans le suivi par des particules en mouvement de mise au point dans le plan z.
Figure 4:. TMS de 1,0 um particules dans les biofilms mucoïde P. aeruginosa est élastique et microcolonies sont réduits à une réticulation efficace de jours 3 à 5; Δ pel est élastique et ne modifie pas la rhéologie à jour à partir de 3 à 5; Δ PSL est viscoélastique et se compose principalement de plaines qui ne changent pas de manière significative en rhéologie de 3 à 5 jours.
| Fatigue | Jour | Région </ td> | Median Creep conformité (Pa -1) |
| type sauvage | 3 jours | Microcolonie | 4,3 x 10 -2 |
| type sauvage | 5 jours | Microcolonie | 2,5 x 10 -1 |
| type sauvage | 5 jours | Plaine | 4,1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 jours | Microcolonie | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 jours | Microcolonie | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 jours | Plaine | 3,2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 jours | Plaine | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 jours | Plaine | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 jours | Microcolonie | 2,8 x 10 -1 |
Tableau 1: conformités de fluage médians et des exposants de diffusion estimées de type sauvage et des souches mutantes selon l'âge du biofilm et la région.
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Discussion
Microrhéologie est un outil utile pour les mesures rhéologiques locales dans les systèmes hétérogènes, tels que les biofilms microbiens. Il est une technique non destructive, ce qui permet la surveillance en temps réel des changements rhéologiques sein d'un même échantillon biologique sur plusieurs points temporels. Dans ce protocole, microrhéologie de traces de particules a été appliqué à Pel et mutants exopolysaccharide Psl afin d'enquêter sur la façon dont ils affectent l'élasticité et la réticulation efficace de la matrice du biofilm. Psl favorise le développement de biofilms élastiques à forte réticulation efficace, alors que Pel favorise viscoélastique et biofilms plus lâches. Lorsque les deux exopolysaccharides sont produites, les microcolonies biofilm devient moins efficace réticulés comme le biofilm mûrit, compatible avec une diminution de plus de Psl Pel.
Les biofilms formés par différentes espèces bactériennes ont des compositions EPS distinctes. Les EPS de mucoïde P. aeruginosa souches utilisées dans cette étude principalement consi m de exopolysaccharides 16. D'autres espèces peuvent utiliser de grandes protéines d'adhésion extracellulaires 17 et 18 ADN que leurs principaux composants de l'EPS. L'approche décrite ici pourrait être utilisée pour déterminer la contribution rhéologique des autres composants EPS et de leur effet sur la croissance. En outre, les biofilms cultivés dans des configurations différentes peuvent avoir radicalement différentes propriétés physiques qui affectent leur rhéologie. Par exemple, mucoïde P. aeruginosa complété avec du glucose formes plus biofilm avec des structures très différenciées sous écoulement par rapport aux conditions statiques. Des études ont également montré que les biofilms exposés aux contraintes de cisaillement tels que le flux rend les biofilms plus cohésif et élastique 19,20. Des mesures importantes et les facteurs à considérer pour biofilm réussie étude particules suivi microrhéologie sont comme suit:
Les dimensions du système d'enquête ou à l'échelle d'intérêt par rapport à temps et l'espace
contenu "> Lors de l'examen des échelles spatiales, il faut tenir compte de la taille des structures qui donnent lieu à des propriétés viscoélastiques du système (dans notre cas, les polymères de la matrice du biofilm). Les polymères entourant la particule de la sonde devrait être beaucoup plus faible dans la structure de la particule et de présenter un environnement isotrope à la particule. Imagerie à haute résolution est nécessaire pour capter les mouvements de petites particules ou de vibrations, mais permettra de réduire la quantité de zone imagée pour la taille de fichier équivalent. Lors de l'examen des échelles temporelles, biofilms élastiques qui présentent lente dynamiques nécessitent de prendre des vidéos sur des échelles de temps plus longues (par exemple h) et à l'aide des taux de trame faible (par exemple min). vidéos courtes peuvent être prises pour les biofilms viscoélastiques avec des dynamiques rapides (min), mais exigent des taux plus élevés de châssis (sec ou millisecondes). Utilisation appropriée la résolution, le frame rate, durée de la vidéo pour chaque expérience va garder une taille de fichier faible pour l'analyse traitable.Biofilm viscoélasticité, ilterogeneity et dimensions
Le mouvement des particules peut être indétectable dans les biofilms très élastiques (MSD <10 -4). Dans de tels cas, les techniques microrhéologiques actifs qui correspondent à la force déplacer la particule sont préférables. Rhéologique échantillonnage de différentes régions du biofilm doit être fait pour assurer l'hétérogénéité mécanique du biofilm est capturé. Morphologie hétérogène, cependant, ne sont pas nécessairement un bon indicateur de l'hétérogénéité mécanique, que malgré les apparences homogènes biofilm peut être complexe en rhéologie: biofilms Δpsl sont plus homogènes dans la morphologie et retardé dans la différenciation, mais ils ont un profil rhéologique complexe et hétérogène. En revanche, les biofilms Δpel ont un aspect hétérogène avec microcolonies bien différenciées mais une rhéologie constante tout au long du biofilm. Pour biofilms de grandes dimensions de microcolonie (par exemple> 50 m de diamètre et hauteur), il peut être s significatifstudy les différences rhéologiques selon la hauteur (haut et bas de microcolonies), ou la distance de bord microcolonies.
La sélection des particules de la sonde
Comme décrit ci-dessus, la taille des particules doit être plus grand que les structures des matériaux qui donnent lieu à ses propriétés viscoélastiques. En outre, les particules avec la chimie de surface différent peuvent entraîner dans la liaison aux zones et aux EPS différentes composantes au sein du biofilm. Ainsi, les effets de particules avec la chimie de surface différente devraient être explorées afin que biofilm hétérogénéité peut être envisagée. Toutes les particules de la sonde doit avoir un fort potentiel de Zeta à minimiser l'agglomération. Les particules qui se lient ensemble ne peuvent pas être utilisés comme sondes précises et doivent être exclus de l'analyse.
Minimisation de la dérive
La dérive peut être provoquée par la température ou de pression d'air, les changements de mouvement platine du microscope (généralement dans la direction z), anti-vibrations déséquilibre de table et le flux interne au sein du système. Dérives aboutissent généralement à superdiffusion de la particule et α> 1. Un α> 1 indique que d'autres que l'énergie thermique, les processus actifs sont particule en mouvement impliqué et microrhéologie passive est pas applicable.
L'entretien de la culture de biofilm bon
Cellules de débit doivent être correctement montés pour éviter les fuites et les biofilms doivent être exempts de toute contamination. Les biofilms peuvent également être cultivées dans d'autres configurations alternative à la cellule d'écoulement, tels que des diapositives et des micropuits pour des conditions de culture statique. Un microscope inversé doit être utilisé pour l'imagerie de micropuits.
En résumé, le suivi des particules microrhéologie est une technique utile qui peut être employée en utilisant des microscopes classiques à un laboratoire biologique. En outre, les programmes intervenant dans le calcul et l'analyse des TMS de particules est facilement disponible dans le domaine public.Par exemple, msdanalyzer et TrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) sont des programmes qui fonctionnent dans l'environnement Matlab. Cependant, comme la technique repose uniquement sur l'énergie thermique pour déplacer les particules, il est incapable de résoudre entre des échantillons de plus grande élasticité. Techniques actives, tels que l'épilation magnétique, appliquent une force sur la particule d'agir sur et se déplacer au sein de l'échantillon et seraient en mesure de déterminer la viscoélasticité d'échantillons hautement élastiques.
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Acknowledgments
Cette recherche est soutenue par la Fondation Nationale de la Recherche et de l'Education de Singapour Ministère en vertu de son Centre de recherche du Programme d'excellence, les subventions de démarrage (M4330002.C70) de l'Université technologique de Nanyang, et ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) du Ministère de l'Education, à Singapour. Les auteurs remercient Joey Yam Kuok Hoong pour participer à la manifestation de ce protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
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