在生物膜的力学性能原位制图粒子追踪Microrheology

Introduction

大多数细菌细胞能够同时使用浮游（自由生活的），并生长¹面接合（固着）模式。在成长的表面附着模式下，细菌细胞分泌，并包住自己在大量的胞外聚合物（EPS），形成生物膜。所述EPS主要由蛋白质，胞外多糖，胞外DNA，并且对生物膜形成^2。它作为一个物理支架通过该细菌可以用于区分空间上和防止有害的环境条件和宿主反应的细菌。 EPS为不同的组件有生物膜形成³和改变EPS成分的表达不同的角色，可以极大地重塑生物膜结构^4。车部件也可以作为信号分子^5，最近的研究已经显示出一定的EPS部件与微生物细胞相互作用来引导它们的迁移和生物膜的differentiation ^6-8。

研究EPS显着促进了基于由突变体缺陷在EPS ^9,10的特定组件所产生生物膜的形态分析。此外，EPS的特点通常是在宏观尺度（散装特征^）11。形态学分析可以然而缺乏定量细节和散装表征，它返回平均值，失去生物膜的异质性内存在的细节。现在有越来越多的趋势发展到了EPS的力学性能的实时特性，在微观尺度。这个协议演示如何粒子追踪microrheology能够确定的基质组分贝利上的铜绿假单胞菌生物膜⁴的粘弹性和有效交联的时空效果和PSL胞外多糖。

被动microrheology是简单且廉价的rh的eology方法，提供了通过的材料制成的空间微观流变采样的最高迄今为止^12,13。在被动microrheology，探针球体放置在样品中与他们的布朗运动，通过热能量_{（K（B T））}驱动的后跟视频显微镜。几个颗粒可以同时被跟踪，和颗粒的时间依赖性坐标遵循常规随机游走。因此，平均来说，粒子保持在同一位置。然而，位移的标准偏差或均方的颗粒位移（MSD），不为零。由于粘性流体流动，在粘性流体粒子MSD线性增长随着时间的推移。与此相反，聚合物的交联存在于粘弹性或弹性物质有助于他们抵抗流动，颗粒变得有限在他们的位移，导致在MSD曲线（图1A）的高原。这个观察如下的关系MSDαt >α，其中 ，α是相关的物质的弹性和粘性的贡献率的扩散指数。为粒子朝着粘性流体α= 1，在粘弹性物质0 <α<1，并且在弹性物质α= 0。MSD还可以用于计算蠕变柔量，它是该材料的倾向永久过度变形时间并估计多么容易的材料价差。

颗粒的尺寸，密度和表面化学是微观流变试验的正确应用关键和被选择相对于所研究的系统（在此情况下，生物膜基质的聚合物中，参见图1B）。首先，粒子测量物质与结构，是比颗粒本身小得多的流变性。如果该物质的结构是相似的规模到颗粒，票面的运动视察由各个结构的形状和取向扰动。然而，如果包围粒子的结构是要小得多，这效果小，平均掉，呈现均匀的环境到粒子（图1B）。其次，该粒子的密度应类似于介质（1.05克毫升^-1用于水性介质），使得沉降避免和惯性力是可以忽略不计。大多数颗粒聚苯乙烯晶格符合上述标准。理想的情况下，该颗粒不与生物膜基质的聚合物相互作用作为粒子的MSD的流变解释才有效，如果运动是随机的，具有物质结构从动通过热能和碰撞。这可以通过检查是否在探头颗粒趋于结合或反弹的预生长的生物膜的表面被观察到。然而，尽管缺乏吸引力的生物膜中，颗粒必须能够被并入基质。另外，生物膜的物理化学异质性可能会导致不同的颗粒的更适合作为在生物膜的不同区域的探针。因此，不同大小和表面化学的颗粒应被应用到生物膜。

这样，粒子MSD是能够提供关于组件如何不同向流变性和生物膜的传播有用信息。此外，使用不同的探针的允许一个派生对生物膜的空间异质性理化信息。此方法可用于测试作用抗微生物处理的生物膜的机械性能，或施加到混合物种的生物膜研究如何生物膜的机械性能从引入另一物种的改变。粒子的MSD还可以是用于表征生物膜分散有用。这样的研究将有助于我们生物膜的理解，有可能提高生物膜处理一个生物膜的有益活动的第二工程。

Protocol

1.生物膜栽培

1. 细菌菌株制备
   1. 前1天生物膜培养，接种2毫升合适的生长培养基从冷冻的细菌培养制备的浮游细菌培养物。使用的Luria肉汤培养基（10克^L -1 NaCl的10克L- ^-1酵母提取物，和10g ^L -1蛋白胨）为粘液P.铜绿假单胞菌和Δ 像素和ΔPSL缺陷的突变体。孵育过夜，在37℃和200 rpm振摇条件。稀释过夜培养物，以使用分光光度计的OD ₆₀₀的0.40。
   2. 装配流动池设置，已经描述先前^14，最好是在移动台或台车，可以被带入显微镜室成像流动池无需拆卸。
   3. 在2升或5升瓶的每个流动池准备无菌生长培养基中。使用最少的培养基M9（48毫_的 Na 2 _HPO 4，22毫KH _{2 PO 4，19} mM的_氯化铵 ，9毫摩尔NaCl，2mM的_硫酸镁 ，和0.1mM的CaCl _2）补充有0.04％葡萄糖（重量/体积）和0.2％（重量/体积）酪蛋白氨基酸）的P.铜绿假单胞菌流细胞生物膜。
   4. 分装荧光微球进入离心管，并在无菌_H 2 O的5分钟，在离心机降速为9,391.2克除去上清，重悬在1ml的生长培养基以除去叠氮化钠（消毒剂）添加到生长培养基在2L或5L的介质瓶之前。
      注意：不同尺寸的微球有不同的浓度，应作相应稀释到指示。例如，分散120微升1.0微米直径的微球，15微升0.5微米直径的微球和0.96微升0.2微米直径的微球体的成2升生长培养基，得到^2.18×10 6个微球毫升^-1每个粒子大小。
   5. 安装介质瓶upst流动池的铰孔和允许生长培养基流过整个设置。停止流动，并注入稀释过夜培养成流动池室。使细菌持续流动生长培养基以约^5.5×10 -3米^秒 -1，或8的转速用蠕动泵的流速之前附加到盖玻片基底1小时。
      注：生物膜通常生长在室温（25℃）下3-7天。
   6. 另外，对于静止培养设置，通过加入10微升过夜培养物到1ml生长培养基与颗粒稀释过夜培养100倍在微量离心管中。大约500倍相比，用于流量生物膜增加颗粒浓度在静态培养生长培养基（例如，清洗并重悬600微升1.0微米直径球在10ml生长培养基），为流动池生物膜不断地与补充粒子，但静态的文化不是。
      1. 加入2001，L稀释过夜培养具有颗粒8以及幻灯片室。在37℃静态条件下孵育。生物膜通常生长1天。每日与颗粒新鲜生长培养基更换废生长培养基如果生物膜生长超过1天。

2.显微镜

1. 在第3天及5中，关闭流量从蠕动泵和使流通池设置成显微镜室。附近的流动池室的入口和出口夹紧管道，以防止漂移从流量（通过在环境中的变化的系统误差的原因）。将流动池到直立显微镜的显微镜载物台。
   注：使用倒置显微镜的微孔成像。
2. 使用荧光显微镜用40X油浸物镜采取微球运动的嵌入在生物膜在各个位置（小菌落和平坦未分化层）（第3天及5），用于视频和在不同的日子时间和空间的调查。以短视频具有更高的帧速率，以调查在短的时间尺度上发生的事件（ 如 1.5-3分钟视频以每秒25-50帧的快速动态的帧速率），以及更长的视频以较低的帧速率来调查过较长时间的事件尺度（ 如 15-30分钟的视频在2.5-5帧/秒的速度较慢动态帧速率）。
   注：视频通常包含5-10个粒子，一般是1.0〜2.5 GB的文件大小。较大的菌落可以容纳更多的颗粒。以5-10的影片为每个类别（平层分化不同的地点不同的菌落和如 5-10视频）。生物膜具有异质结构，可能包括小菌落，通道，空隙和平面未分化层。
3. 保存为相应格式的视频，可以通过斐济/ ImageJ的读取（ 如 CZI，TIF）。
4. 检查视频漂移通过成品VID滚动EO和观察到的颗粒不会在相同的方向同时移动。漂移可以通过z台运动，在流动池中的电流，抗振动台，空气压力或温度变化的不平衡引起的。使用通常设有显微镜软件的后处理技术正确轻微漂移。丢弃任何影片，其中漂移不能纠正。记录以下参数，其中粒子跟踪分析过程中是必需的：分辨率（像素/ UM），帧数，持续时间。
5. 从显微镜阶段卸下流通池，并重新启动蠕动泵，继续培养生物膜。

3.粒子跟踪分析

1. 通过使用插件TrackMate开源软件（ImageJ的）获取粒子轨迹。下载斐济在http://fiji.sc/Fiji。打开与斐济和在插件菜单中选择视频，请选择跟踪和TrackMate。
2. 检查或调整日的设置Ë窗口提示初始校准设置，记录在步骤2.4匹配视频参数。
3. 使用ImageJ在TrackMate检测颗粒。
   1. 选择“数检测器”，输入粒径和阈值（ 如 1000）。通过视频滚动而点击“预览”按钮，检查紫圆跟随整个视频的颗粒。调整直径和阈值作为必要的：提高阈值，如果紫色圆圈出现在空的空间。降低阈值，如果检测到没有足够的颗粒。点击下一步按钮即可完成检测的颗粒。
   2. 与选项呈现给添加或删除的“初始阈值”检测到的粒子，“选择视图”和“选择过滤器”窗口，而不调整继续，如果初始粒子探测是令人满意的，当单击下一步按钮。
   3. 在OPTI选择“简单LAP跟踪器”对吧“选择跟踪方法”窗口中的粒子很少迁出焦点生物膜，很容易跟踪。使用建议或低链接和缺口闭合的最大距离值，然后单击下一步。
   4. 检查粒子跟踪是通过视频滚动地看到，粒子遵循TrackMate绘制的轨道，并没有多余的或丢失的轨道满意。跳过各种过滤步骤。进入到最后的窗口“中选择一个动作”。选择从下拉菜单中选择“导出曲目xml文件”，然后单击“执行”。选择一个文件夹保存的曲目。
      注：有在公共领域的粒子运动轨迹和使用microrheology的分析提供各种方案。 msdanalyzer和TrackArt是，在Matlab环境下运行的粒子跟踪分析程序的示例。
4. Matlab的准备通过选择菜单导入粒子轨迹中的XML文件matlab文件>设置路径...并添加脚本文件夹中与斐济包。
5. 为了分析的粒子轨迹与msdanalyzer，下载链接，压缩文件或tar.gz文件at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
   1. 提取@msdanalyzer文件夹^，15拖放一个属于Matlab的路径的文件夹中（ 例如C： Documents和Settings <用户名> 我的文档 Matlab的）。启动Matlab和启动分析仪通过键入：
      MA = msdanalyzer（2，'嗯'，'秒'）
      其中微米和秒是物理的空间和时间单元中的视频。
      1. 导入粒子轨迹通过键入：
         [曲目，MD] = importTrackMateTracks（'filename.xml中'，'clipZ“;，“scaleT”）
         MA = ma.addAll（轨道）;
         其中“clipZ”删除Z尺寸为2D视频，和'scaleT“。
      2. 画出轨迹图上使用：
         ma.plotTracks;
         ma.labelPlotTracks;
      3. 计算使用粒子的MSDS：
         MA = ma.computeMSD;
         ma.msd
      4. 绘制每个粒子的MSDS：
         数字
         ma.plotMSD
      5. 通过重复3.5.1.1至3.5.1.4）组合来自同一categery的（嵌入在野生型小菌落在第3天，例如颗粒）的其他视频粒子轨迹。
      6. 绘制集合平均或平均值的所有曲线：
         ma.plotMeanMSD
         从线性的Y轴和X轴改变为对数刻度。在很长的滞后时间，MSD的曲线变得嘈杂，由于统计不足，在较长的时间尺度。 MSD的曲线也急剧上升，由于动态误差。曲线的这些区域可以通过使用刷子工具被移除选择曲线的末端，选择'刷牙'>'删除Unbrushed“在工具菜单中。
   2. 下载Ezyfit在http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/并添加Ezyfit属于Matlab的路径的文件夹（ 如 C： Documents和Settings <用户名> 我的文档 Matlab的）。通过键入Matlab的工作空间efmenu安装安装Ezyfit菜单。重新启动的MATLAB与图中窗口Ezyfit菜单。通过选择Ezyfit菜单“显示适合'>'力量'>'A * X ^ N'装上MSD曲线的功法是n是估计的扩散指数α。
      注：msdanalyzer需要的曲线在Matlab拟合工具箱MSD曲线的拟合。 Ezyfit是一种替代和免费的软件，可以进行曲线拟合。
   3. 清除当前粒子运动轨迹和MSDS来计算新粒子的MSD在其他地点或时间：
      明确颗粒的介质（对照组）各平均MSD曲线和菌落和各种品系的未分化的区域，复制并粘贴曲线到一个图进行比较计算后。样品刚度和交联的增加与较低的MSD值。平曲线具有较低的α和样品比用更高的α陡峭的曲线更富有弹性。
   4. 选择曲线进入“工具”来看看数据统计，如中位数和范围。胎圈的MSD正比于蠕变柔，J其中珠被根据关系嵌入材料（吨），
      
      其中 J =蠕变柔，D =粒径，K _{B =}玻尔兹曼常数 ，T =温度和 t =时间。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™	50 x 24 mm
Syringe 3 ml	Terumo
27  G Needle	Terumo
2  L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup