Abstract
Crônica, estresse não resolvido é um importante fator de risco para o desenvolvimento de depressão clínica. Enquanto muitos modelos pré-clínicos de depressão induzida pelo estresse têm sido relatados, o estresse leve crônico imprevisível (UCMS) protocolo é um estabelecido modelo traducionalmente relevante para induzir sintomas comportamentais comumente associados com a depressão clínica, como anedonia, o comportamento de limpeza alterada, e desamparo aprendido em roedores. O protocolo UCMS também induz fisiológico (por ex., Hipercortisolemia, hipertensão) e neurológico (por exemplo, anedonia, desamparo aprendido) as alterações que são clinicamente associados com a depressão. É importante ressaltar que os sintomas depressivos induzidos por UCMS podem ser melhorados através crônica, mas não aguda, o tratamento com ISRS comuns. Como tal, o protocolo UCMS oferece muitas vantagens sobre os protocolos de tensão aguda ou protocolos que utilizam factores de stress mais extremas. Nosso protocolo envolve, exposições diárias randomizados para 7 stre distintassors: cama úmida, remoção de roupas de cama, gaiola de inclinação, alteração dos ciclos de luz / escuridão, tensões sociais, de banho em águas rasas, e predador sons / odores. Submetendo roedores 3-4 horas por dia para esses estressores suaves durante 8 semanas, demonstramos as duas mudanças comportamentais significativas e maus resultados de saúde para o sistema cardiovascular. Esta abordagem permite interrogatório em profundidade das alterações neurológicas, comportamentais e fisiológicos associados com a depressão induzida pelo estresse crônico, bem como para os testes de novos agentes terapêuticos potenciais ou estratégias de intervenção.
Introduction
Doença mental depressivo é uma desordem neurológica complexa que é atualmente reconhecido como uma das principais causas de incapacidade e doença carga em todo o mundo. O NIMH relata que cerca de 12% dos americanos sofrem de depressão clínica, com o dobro de mulheres afectadas contra homens 1. Em os EUA sozinhos, a depressão é responsável por bilhões de dólares os custos diretos de cuidados de saúde e um valor estimado de $ 193.000.000.000 mais em custos indiretos (lucro reduzido e perda de produtividade) 2. Os sintomas da depressão incluem anedonia, mudanças nos ciclos de peso e sono, diminuição da atividade física e higiene pessoal, sentimentos de desesperança ou culpa, e / ou pensamentos recorrentes de morte ou suicídio. Durante a última década, estudos epidemiológicos e clínicos indicaram que a depressão é um fator de risco independente para doenças cardiovasculares (DCV) morbidade e mortalidade 3, e é preditivo de prognóstico mais grave de patologias cardiovasculares, incluindo umtherosclerosis, hipertensão, infarto do miocárdio e doença arterial coronariana, independentemente da história prévia de DCV ostensiva 4. Apesar do aumento da prevalência e impacto adverso para a saúde pública da depressão, a etiologia e relacionado fisiopatologia da doença é mal compreendida ea heterogeneidade da doença devido a vários fatores (por exemplo,,, e componentes ambientais biológicas genéticas) fez o diagnóstico clínico difícil definir.
As evidências indicam que o estresse psicológico irresolvable é um fator importante que contribui para o desenvolvimento de doenças depressivas e também pode ser um fator potente patogénico que liga depressão e doenças cardiovasculares, em parte devido ao rompimento e desregulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) 5,6. A disfunção do eixo HPA é um dos principais mecanismos que tem sido associada às alterações fisiológicas e comportamentais observados na depressão e o desenvolvimento de diversos factores de risco de DCV, incluindodislipidemia, obesidade e diabetes 7. Vários modelos pré-clínicos de depressão têm sido desenvolvidos na tentativa de replicar o mecanismo de alteração HPA atividade do eixo característica de depressão clínica; tais modelos fornecem um meio para investigar validadas as mudanças comportamentais, neurológicas e fisiológicas associadas ao estresse crônico e agudo em animais. A validade de um modelo animal da doença é baseado na relevância de a etiologia e progressão do design do modelo e sua capacidade de recapitular anatômico, neurofisiológica, e características comportamentais observadas na doença humana. Além disso, as respostas aos tratamentos pré-clínicos (tais como SSRIs) devem produzir resultados semelhantes aos observados em situações clínicas.
Diversos modelos animais de depressão induzida pelo estresse são atualmente utilizados em pesquisa, tais como o desamparo aprendido, estresse precoce, estresse e derrota social. No entanto, cada um destes modelos tem desvantagens inerentesque diminuir sua eficácia translacional 8. Nas últimas décadas, o estresse leve (UCMS) protocolo crônico imprevisível surgiu como um dos modelos mais traducionalmente relevantes para o estudo da fisiopatologia da depressão em roedores 9. Este modelo baseia-se no conceito fundamental que a exposição crónica a estressores interrompe sistemas de resposta ao stress e, finalmente, conduz ao desenvolvimento de distúrbios depressivos. Durante o protocolo UCMS, os animais são expostos a uma série de factores de stress ambientais randomizados e sociais suaves numa base diária. Um factor importante que aumenta a relevância deste modelo para situações humanos reside no alto grau de imprevisibilidade e incontrolabilidade dos factores de stress, bem como o momento em que eles são introduzidos. Além disso, o protocolo UCMS usa apenas estressores suaves, em vez de confiar no início da vida ou estímulos físicos agressivos. Ao longo de um período de exposição UCMS, comportamentos depressivos desenvolver e são comparáveis aos clinsintomas iCal, incluindo diminuição de resposta às recompensas (anedonia), mudanças na atividade física e comportamento investigativo (desamparo e desespero), a deterioração do estado casaco e atividade sexual alterada 10. Quase todos os sintomas de depressão demonstráveis foram reportados utilizando este modelo, e estudos têm demonstrado que estes comportamentos persistem por várias semanas após a cessação do sofrimento. Além disso, esses comportamentos depressivos induzidos por UCMS pode gradualmente ser reverenciado pelas crônica, mas não aguda, o tratamento com antidepressivos específicos, sugerindo efeitos neurológicos semelhantes de melhoria terapêutica que espelha de perto a ação e eficácia clínica variável destes agentes nos seres humanos 11,14- 18. Aqui, nós relatamos uma descrição detalhada do protocolo UCMS e descrever resultados típicos de comportamento e vasculares em ratos.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos a seguir foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional da West Virginia University Health Sciences Center.
1. Selecção do Modelo Animal
NOTA: espécies mais utilizadas no modelo UCMS incluem Sprague Dawley, e ratos Wistar e da BALB / cJ rato; outros modelos de murino demonstraram eficácia limitada (DBA / 2, C57BL / 6). No entanto, a consideração cuidadosa deve ser dada ao mouse particular ou estirpe de rato de escolha, como a herança genética e susceptibilidade ao estresse ambiental variam muito entre as espécies e foram mostrados para ser fatores críticos que afetam os resultados do estudo 11,14,15, 19.
- Use animais da idade adequada (por exemplo, se o ponto final desejado deve ser avaliada em um de 17 semanas velho rato, em seguida, os ratos devem começar o protocolo UCMS em ~ 9 semanas de idade) como este protocolo leva pelo least 7-9 semanas para induzir totalmente sintomas depressivos.
- Animais submetidos a única casa UCMS em gaiolas IACUC-aprovado e instalações, com alimentos e ração padrão ad libitum disponíveis (salvo outra indicação protocolo específico).
- Tome especial cuidado para garantir controles estão alojados em uma sala silenciosa com atividade mínima para reduzir os efeitos de eventuais estressores ambientais desconhecidos.
2. crônico imprevisível Protocolo de estresse leve
NOTA: Os animais submetidos a UCMS são transportados diariamente (> 5 dias por semana) para um quarto limpo usadas para manipulações UCMS. Os animais são expostos a 1 ou 2 dos factores de stress listados abaixo de cada dia. Estressores são executados em uma programação randomizado, e cada stress é administrado por um período mínimo de 3-4 horas (ver Tabela 1).
- Umedeça a roupa de cama por vazamento 10-20 onça de água limpa em cada gaiola padrão. Ajustar a quantidade de água de acordo com o tamanho dogaiola, a fim de amortecer completamente a roupa de cama, mas não causar acumulação de água. Residem os animais na gaiola úmido para 3-4 horas.
- Remova roupas de cama de cada gaiola para 3-4 horas, após o qual os animais são transferida para outro estressor exigindo uma gaiola vazia (banho superficial, gaiola de inclinação) ou colocado em uma gaiola limpa com camas frescas.
- Gaiolas de inclinação para aproximadamente 45 ° (sem cama) durante 3-4 horas. As gaiolas podem ser inclinado com um objecto resistente que permanecerá no lugar enquanto o animal se move em torno da gaiola.
- Alter normais / ciclos escuros de 12 horas de luz / 12 h em sucessões de 30 mínimo de períodos com duração de 8 horas. Depois, os animais voltar para o ciclo normal.
- Transferir cada animal da sua gaiola para que a gaiola de animais de um vizinho que tenha sido removido durante 3 horas.
- Remover todas as camas de cada gaiola e adicionar água a uma profundidade de 0,25 polegadas ~ para ratos ou ~ 0,5 polegadas para ratos durante aproximadamente 4 h. Usar a água que é mais quente que a temperatura ambiente (~ 30 ° C) para minimizar hypothermpotencial ia. Resumidamente animais secos com uma toalha macia na conclusão da exposição à água antes da colocação em gaiolas limpas.
- Expor animais para predador cheira / sons adicionando tufos de amostras distribuídas aleatoriamente de pele ou urina (10-20 ml) de uma espécie de predadores naturais na gaiola por 3-4 horas. Alternativamente, jogar rosnar ou ruídos predatórias de espécies de predadores naturais nas proximidades de gaiolas para 3 hr.
- No final de cada período de stress diário, colocar todos os animais em gaiolas limpas e devolvê-las para a instalação de alojamento.
3. Monitoramento animal / Beleza Pontuações
- Inspeccionar cada animal diariamente para o desenvolvimento de feridas ou feridas que podem exigir o tratamento veterinário. Animais que desenvolvem lesões leves podem continuar no protocolo UCMS sobre o consentimento do médico veterinário.
- Dois investigadores treinados na avaliação casaco aliciamento inspecionar cada animal e atribuir uma pontuação casaco semanal em uma escala de 0-1. Esta pontuação é dissuadirminado, atribuindo notas individuais (0- limpo, 1-sujo) para cada um dos cabeça 8 regiões- corpo, pescoço, revestimento dorsal, casaco ventral, cauda, membros anteriores, membros posteriores, e na região genital. Os mesmos investigadores estão a realizar esta tarefa ao longo do protocolo UCMS para manter a consistência na atribuição de escores casaco.
- Qualquer animal que experimenta uma forte redução no peso corporal (ou seja,> 15%) devem ser relatados ao pessoal veterinário e deve ser removido a partir do protocolo.
4. Behavioral Testes e avaliações de resultados
NOTA: Vários métodos de avaliação pode ser utilizado para quantificar as alterações comportamentais do protocolo UCMS em roedores.
- Cumulativa Score Brasão Grooming.
- Como descrito acima, uma preparação semanal pontuação revestimento é atribuído para cada animal.
- Sacarose respingo Teste:
- Colocar o animal em uma gaiola limpa forrado com uma almofada de algodão ou uma toalha para evitar camade aderir ao seu casaco. Pulverize uma solução a 10% de sacarose na cabeça e casaco dorsal de cada animal e registrar o comportamento total de aliciamento por 5 min.
- Actividade (definida como a limpeza da pele ao lamber ou coçar) Grooming é medido pela latência (tempo ocioso entre o primeiro spray e início de aliciamento) ea freqüência (número de vezes que preparam uma parte específica do corpo).
- Sacarose teste de preferência:
- Animais habituar a beber a solução de sacarose a 1% (w / v) 72 h antes do ensaio e, em seguida, fornecer a exposição para duas garrafas (solução de sacarose a 1% em relação a água da torneira em garrafas diferentes). Depois de habituação, fornecer animais com acesso ad libitum a solução e torneira de água de sacarose durante 3 horas. Após 3 h recorde o volume de consumo de solução de sacarose e água da torneira e calcular a preferência da sacarose como: [(consumo de sacarose) / (consumo de água + consumo de sacarose)] × 100.
- Cauda Teste de suspensão (Só Mice):
- Supassar pela cauda os ratos a partir de uma haste estável (20 cm do chão) utilizando uma fita adesiva (2 cm da ponta da cauda). Tempo de imobilidade Grave mais de 5 min. Camundongos são considerados imóvel apenas quando eles ficam passivamente e completamente imóvel.
- O Teste de Natação Forçada:
- Animais coloque em um recipiente (~ 15-20 cm de diâmetro para os ratos; ~ 55-60 cm de diâmetro para ratos) enchidos com água a uma temperatura de 26 ± 0,5 ° C. Grave a latência para o primeiro turno de mobilidade eo tempo gasto imóvel durante o período de teste de 5 min. No final de um ensaio, colocar o animal por via húmida numa gaiola de retenção numa almofada de aquecimento (30-35 ° C) com roupa de cama normal, coberta por uma toalha de papel absorvente até à secura.
- Labirinto em cruz elevado:
- Permitir que cada animal para explorar livremente o labirinto durante 5 min. Entradas totais registro em cada braço, e tempo total gasto em cada braço, de acordo com um critério a priori 20.
- Locomotor Atividade:
- Níveis de atividade de registro, definido como o movimento global, movimentos de belas artes, movimentos de criação, e inatividade, tanto aguda (30 min) e / ou crônica (12 hr) períodos de tempo. Faça isso usando a gaiola casa ou um novo ambiente, dependendo do ambiente indivíduo (embora coerência deve ser mantida) em tempo real por um observador ou post-hoc por repetir e analisar imagens da câmera.
5. Expansão / Variação do Protocolo UCMS
- Administrar agentes ou desafios terapêuticos adequados para estudar a sua capacidade de atenuar tanto o desenvolvimento de resultados induzidas UCMS (se iniciado mais cedo) ou para inverter gravidade dos resultados induzidas UCMS estabelecidos (se iniciado tarde). Isto é dependente do laboratório individual ou protocolo 11.
6. As avaliações resultado final
- Na sequência da celebração de protocolos UCMS e testes comportamentais, utilizar animais em exper subsequenteiments de uma forma que aborda as hipóteses específicas, objetivos ou metas do laboratório individual.
NOTA: Como exemplos, o que pode incluir, respostas inflamatórias ou endócrinas cardiovasculares ao estresse crônico. Como alternativa, intervenções terapêuticas podem ser introduzidas neste momento a avaliar a sua eficácia e bases mecanicistas.
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Representative Results
Um exemplo de agendamento para uma semana após o procedimento UCMS é mostrada na Tabela 1. A cada semana, factores de stress foram randomizados para evitar aclamação e para assegurar imprevisibilidade do desafio estresse cada dia.
Medidas de Depressive como Comportamentos
Seguindo 8 semanas de UCMS, houve alterações significativas para ambos os resultados fisiológicos e comportamentais em roedores cronicamente estressados em relação aos seus estirpes de controlo não-forçados. Desenvolvimento de sintomas depressivos como seguintes UCMS foi a avaliação através de pontuação casaco, teste respingo sacarose, e suspensão pela cauda (apenas camundongos; referencia 12,13). Um declínio progressivo nos escores de higiene casaco foi observado em todos os animais UCMS (Figura 1, painel A), e isto marcou a degradação do estado físico do casaco sugere a diminuição da atividade aliciamento. Esse comportamento pode paralela a falta de motivação ou perda de interesse em performing tarefas diárias, tais como a manutenção da higiene pessoal mínima.
Animais UCMS também demonstrado um aumento da latência para preparar e redução do tempo total de preparação no teste inicial de sacarose (Figura 1, painéis B e C). Aumento do tempo para iniciar o comportamento de limpeza, juntamente com a diminuição do tempo gasto preparação está associada com motivação reduzida e um declínio no comportamento estimulador eu, ou diminuição da sensibilidade ao prazer. Isto é representativo do núcleo sintoma de depressão, anedonia. Além disso, houve um aumento significativo no tempo de imobilidade durante o ensaio de suspensão da cauda em ratinhos. Como afirmado anteriormente, este comportamento é uma medida de desespero comportamental com maior imobilidade representando um depressivo mais grave como sintoma.
Medidas de alterações fisiológicas
MAP pode ser significativamente elevados, como resultado do protocolo de UCMS, mas esta não é consistentemente observada (
UCMS ratinhos manifestada aumento dos níveis plasmáticos de cortisol, um marcador de stress fisiológico crónica, e nitrotirosina, um marcador de estresse oxidativo crónica (Tabela 2).
Além disso, os ratinhos UCMS mostraram níveis significativamente elevados de marcadores da pró-inflamatórias TNF-α e MCP-1. Juntos, estes resultados sugerem que os animais stressados desenvolver um perfil de doença patofisiológica na sequência de 8 semanas de UCMS (Tabela 2).
Divergência com sexo
Evidências recentes sugerem que existe uma divergen quantitativa substancialce nas respostas aos UCMS entre machos e ratos fêmeas (13). Especificamente, os dados sugerem que os ratos do sexo feminino, expostos ao protocolo UCMS idêntica como os machos da mesma idade, desenvolver respostas comportamentais mais graves com o protocolo do que os homens (Tabela 3 e Figura 3), com níveis elevados de cortisol, nitrotirosina e marcadores de inflamação .
No entanto, apesar desta divergência entre os sexos seguindo o protocolo UCMS, a vasculopatia que se desenvolve como um resultado parece ser arredondada no sexo feminino em comparação com os machos, o que sugere fortemente uma manutenção superior de função endotelial, apesar do ambiente comprometida (Figura 4) .
Para as Figuras 1 e 3, os resultados foram obtidos utilizando as técnicas descritas acima, com a aplicação de ANOVA e testes t como apropriado. Para as Figuras 2 e 4, os resultados foram obtidos u cante relações concentração-resposta ex vivo em preparações do anel aórtico. As curvas foram se encaixam com uma equação logística de três parâmetros, com t-testes ANOVA e conforme apropriado para os limites inferiores das curvas. Por favor, consulte as referências 12,13 para detalhes.
Figura 1. Sintomas depressivos após oito semanas de UCMS em ratos. Os dados são apresentados para o status de revestimento (Painel A), a latência (Painel B) e freqüência (Painel C) de preparação facial na sequência de um spray de solução de sacarose 10%, eo total período de imobilidade durante o teste de suspensão pela cauda (Painel D) para controle e ratos UCMS. * P <0,05 em relação control.Please ver referência 12 para mais detalhes.lank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Respostas vasodilatadores à metacolina de ratos após oito semanas de UCMS. Os dados são apresentados para os ratos sob condições de controle (controle limite inferior = 10,3 ± 2,4%) e na sequência de oito semanas do protocolo UCMS imposta (UCMS limite inferior = 33,6 ± 4,4 %). * P <0,05 contra respostas em anéis vasculares não tratadas provenientes de ratinhos de controlo. Re-impresso a partir da referência 12, com autorização prévia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. As diferenças de sintomas depressivos Folmugindo oito semanas de UCMS macho e fêmea Mice. Os dados são apresentados para o status de revestimento (A), a latência (B) e freqüência (C) de preparação facial na sequência de uma solução de sacarose de pulverização 10%, e no período total de imobilidade durante o teste de suspensão pela cauda (D) para controle e ratos UCMS. * P <0,05 versus controlo no sexo; † p <0,05 em relação UCMS-Male. Re-impresso a partir da referência 13, com autorização prévia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. As diferenças nas respostas vasodilatadoras de masculino e fêmea ratos após oito semanas de UCMS. Respostas dilatador de anéis de aorta para aumentar ConcentraçãNS de metacolina (painel superior) e nitroprussiato de sódio (painel inferior) de ratinhos, em condições de controlo e após oito semanas de UCMS. * P <0,05 versus controlo no sexo; † p <0,05 em relação UCMS-Male. Re-impresso a partir da referência 13, com autorização prévia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| domingo | Segunda-feira | Terça-feira | Quarta-feira | Quinta-feira | Sexta-feira | sábado | |
| Estressor 1 | Alterar Claro / Escuro | O stress social | Sem roupa de cama | Cama Damp | Alterar claro / escuro | Sons de predadores | O stress social |
| Estressor 2 | Alterar Claro / Escuro | Gaiola Tilt | A falta de Bath | GaiolaInclinar | O stress social | A falta de Bath |
Tabela 1. Duas semanas de exemplo para imposição de protocolo imprevisível estresse leve crônico (UCMS).
| Ao controle | UCMS | |
| Massa (g) | 31 ± 2 | 29 ± 4 |
| MAP (mm Hg) | 84 ± 5 | 93 ± 4 |
| A insulina no plasma (ng / ml) | 1,3 ± 0,2 | 3,9 ± 0,6 * |
| De glicose no sangue (mg / dl) | 102 ± 8 | 104 ± 7 |
| Cholesterolplasma (mg / dl) | 75 ± 8 | 81 ± 8 |
| Os triglicéridos do plasma (mg / dl) | 102 ± 8 | 128 ± 10 * </ td> |
| Nitrotirosina no plasma (ng / ml) | 17 ± 2 | 27 ± 4 * |
Tabela 2. As características basais entre os grupos de ratinho sob condições de controle e seguintes 8 semanas de UCMS. Todos os ratinhos têm idades 17-18 semanas. * P <0,05 versus controlo. Modificado de referência 12.
| Os machos | As fêmeas | UCMS-Males | UCMS-Feminino | |
| Massa (g) | 29 ± 2 | 28 ± 3 | 30 ± 3 | 29 ± 4 |
| MAP (mm Hg) | 87 ± 4 | 91 ± 4 | 94 ± 5 | 90 ± 5 |
| A insulina no plasma (ng / ml) | 1,1 ± 0,3 | 1,2 ± 0,4 | 4,1 ± 0,7 * | 4,5 ± 0,5 * |
| De glicose no sangue (mg / dl) | 82 ± 7 | 80 ± 8 | 94 ± 8 | 101 ± 10 |
| O colesterol no plasma (mg / dl) | 71 ± 7 | 68 ± 8 | 78 ± 6 | 77 ± 10 |
| Os triglicéridos do plasma (mg / dl) | 94 ± 6 | 101 ± 8 | 109 ± 8 | 116 ± 12 |
| Nitrotirosina no plasma (ng / ml) | 12 ± 3 | 11 ± 4 | 29 ± 5 * | 36 ± 6 * |
| O cortisol no plasma (pg / ml) | 12 ± 3 | 14 ± 4 | 29 ± 5 * | 44 ± 4 * |
| O TNF-a no plasma (pg / ml) | 2,3 ± 0,3 | 2,0 ± 0.2 | 4,1 ± 0,4 * | 6.4 ± 0.4 * † |
| MCP-1 no plasma (pg / ml) | 2,8 ± 0,3 | 3,3 ± 0,5 | 10,2 ± 1,0 * | 14,8 ± 1,3 * † |
Tabela 3. As características basais entre os grupos de fêmeas de rato sob condições de controle masculino e e após 8 semanas de UCMS. Todos os ratos são envelhecidos 17-18 semanas. * P <0,05 versus controlo. Modificado de referência 13.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Temporary animal cages with lids | Provided by your animal care facility | ||
| Rodent bedding | Provided by your animal care facility | ||
| Predator fur or urine | Provided by your animal care facility | ||
| Rodent cage drinking bottles | Provided by your animal care facility | ||
| 1,000 ml graduated cylinder | variable | variable | This is optional. Any container from which a known quantiity of water can be poured will be appropriate |
| Wooden blocks cut from 2x4 | variable | variable | 8 inch sections are cut to facilitate cage tilt procedures |
| Soft paper towels | Provided by your institution | ||
| Small spray bottle | Walmart | 100-200 ml volume is sufficient, used for sucrose splash test | |
| Medium (mice) or large (rats) plastic tubs for swim testing | Walmart | variable | Should be of sufficient depth that the animals cannot touch bottom (e.g., 2 feet) |
References
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