Abstract
الثقافات عضوي النمط تسمح إعادة تشكيل بيئة 3D الحرجة للاتصال خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات التي يحاكي وظيفة وظائف أعضاء في الجسم الحي نظرائهم الأنسجة. ويتمثل ذلك من خلال الجلد الثقافات عضوي النمط الذي يلخص بأمانة التمايز البشرة وبرنامج الطبقية. الكيراتينية البشرة الإنسان الأساسية هي للتلاعب وراثيا من خلال الفيروسات القهقرية حيث الجينات يمكن overexpressed بسهولة أو طرقت إلى أسفل. ويمكن بعد هذه الخلايا الكيراتينية المعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتجديد البشرة الإنسان في الثقافات الجلد عضوي النمط تقديم نموذج قوي لدراسة مسارات الوراثية نمو الارتطام البشرة، والتمايز، وتطور المرض. البروتوكولات المعروضة هنا تصف أساليب لإعداد الأدمة البشرية الميتة فضلا عن التلاعب وراثيا الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية من أجل توليد الثقافات الجلد عضوي النمط. جلد الإنسان مجدد يمكن استخدامها في downstrتطبيقات زير الشئون الخارجية مثل التنميط التعبير الجيني، المناعية، وimmunoprecipitations لونين تليها عالية الإنتاجية التسلسل. وهكذا، فإن جيل من هذه الثقافات الجلد عضوي النمط المعدلة وراثيا تسمح تحديد الجينات التي تعتبر بالغة الأهمية للحفاظ على توازن البشرة.
Introduction
البشرة الإنسان هو ظهارة طبقية الذي يصل إلى الأدمة الكامنة من خلال المصفوفة خارج الخلية يعرف باسم الغشاء القاعدي البشرة zone.The يخدم ليس فقط بمثابة حاجز كتيمة لمنع فقدان الرطوبة ولكن أيضا باعتبارها خط الدفاع الأول لحماية الجسم من المواد الغريبة والسامة 1. الطبقة القاعدية، وهو أعمق طبقة من البشرة، ويحتوي على الخلايا الجذعية البشرة والسلف التي تؤدي إلى ذرية المتباينة التي تشكل بقية البشرة 2. كما الخلايا الاصلية البشرة تفرق تهاجر صعودا لتشكيل الطبقة الأولى من الخلايا المتمايزة المعروفة باسم طبقة الشائكة 3. في الطبقة الشائكة، والخلايا تتحول على التعبير عن keratins 1 و 10، والذي ثم توفير القوة لتحمل الإجهاد البدني للطبقات متباينة من البشرة. كما خلايا الطبقة الشائكة مزيد من التمييز، وأنها تتحرك صعودا في البشرة للم الطبقة الحبيبية التي تتميز تشكيل كيراتوهيالينية ورقائقي حبيبات وكذلك البروتينات الهيكلية التي يتم تجميعها تحت غشاء البلازما. كما الخلايا المضي قدما في عملية التمايز، والبروتينات تحت غشاء البلازما عبر ربطها بعضها البعض في حين تنبثق حبيبات رقائقي من الخلايا لتشكيل الدهون يسمى حاجز الغنية الطبقة القرنية 4.
الأمراض التي تنطوي على تغييرات في نمو البشرة وأثر التمايز ~ 20٪ من السكان 5. وبالتالي، فهم آليات هذه العملية هو من أهمية كبيرة. منذ مظهر من مظاهر العديد من هذه الأمراض يتوقف على خلية خلية أو خلايا مصفوفة الاتصال والثقافات عضوي النمط حيث يتم إعادة تشكيل البشرة الإنسان في بيئة 3D تم إنشاء 10/06. هذه الطرق تشمل عادة استخدام الخلايا الكيراتينية الأولية أو تحويلها المصنف على المصفوفة خارج الخلية مثل الإنسان مماتالأدمة، Matrigel، أو الكولاجين.
لفهم الآليات التنظيمية الجينات التي تعتبر مهمة في نمو البشرة والتمايز، الخلايا الكيراتينية يمكن التلاعب بها وراثيا من خلال ناقلات فيروسات لضربة قاضية أو بإفراط عن الجينات في الثقافة 2D ثم إعادة تشكيل في 3D. وقد استخدمت هذه الأساليب على نطاق واسع لوصف الجينات المسؤولة عن الجذعية البشرة والخلايا الاصلية تجديد الذات والتمايز، وكذلك التقدم إلى الأورام 11-21. هنا، يتم توفير بروتوكول معمقة حول كيفية تغيير التعبير الجيني في الثقافات عضوي النمط البشرة من خلال استخدام الفيروسات القهقرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ بروتوكول جلد الإنسان وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة كاليفورنيا، جنة أخلاقيات البحوث سان دييغو. ويمكن الحصول على جلد الإنسان من العينات الجراحية التخلص منها أو شراؤها من البنوك الجلد (يتم سرد بنك الجلد في جدول المواد / المعدات). الموقع حيث يتم اشتقاق الجلد من أو سن المتبرع ليست حرجة إلى التجربة طالما أن البروتينات منطقة الغشاء القاعدي (الكولاجين / laminin) في الأدمة ليست متدهورة.
1. إعداد ممات الأدمة الإنسان
- عند استلام جلد الإنسان، ووضع الأنسجة في نسيج الثقافة هود لذوبان الجليد (~ 3-5 دقيقة). اعتمادا على حجم الجلد، ووضع الأنسجة إذابة في التخلص منها 50 مل أنبوب مخروطي معقمة أو 125 مل زجاجة. حجم نموذجية من الجلد من البنك الجلد هو 0.75 قدم مربع.
- ملء حاوية 75٪ كاملة مع البنسلين والستربتومايسين 4X (القلم / بكتيريا) في برنامج تلفزيوني 1X. هزة بقوة ل5 دقائق والتخلص من السائل. كرر هذه الخطوة 3 مرات أكثر.
- بعد غسل الماضي، ونقل الأنسجة لأنبوب جديد / زجاجة وإضافة 4X جديد القلم / بكتيريا / PBS لملء 75٪ من الحاويات. احتضان هذا الخليط في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع للسماح للفصل الأدمة من البشرة.
- تحت ظروف معقمة، واستخدام ملقط لقشر بعيدا البشرة من الأدمة. الأدمة بيضاء تماما في حين أن البشرة سيكون التلوين اعتمادا على السباق من الجهة المانحة (الشكل 1A). تجاهل البشرة وفقا لبروتوكول المؤسسة للتعامل مع الأنسجة البشرية.
- وضع الأدمة في أنبوب أو زجاجة، وأغسلها في 4x والقلم / بكتيريا مخففة في برنامج تلفزيوني 1X مع قوية تهز (5 دقائق يغسل لمدة 4 مرات). بعد غسل الماضي، ونقل الأدمة إلى أنبوب جديد / زجاجة في 4X القلم / بكتيريا مخففة في برنامج تلفزيوني 1X وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. ويمكن تخزين الأدمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى عام. 2. وراثيا التعديل الابتدائية الخلايا الكيراتينية الإنسان
- اليوم 1: قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، وخلايا طائر الفينيق البذور في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 800،000 الخلايا لكل بئر في كامل وسائل الاعلام DMEM.
- يوم 2: يوم ترنسفكأيشن، استخدام 3 ميكروغرام من ناقلات فيروسات لكل بئر. قسامة 3 ميكروغرام من ناقلات فيروسات في أنبوب 1.5 مل. استخدام مزيج من 100 μ؛ ل DMEM زائد 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن لكل 3 ميكروغرام من ناقلات. مزيج 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع 100 ميكرولتر DMEM في أنبوب 1.5 مل. (يتم سرد ناقلات فيروسات التي تستخدم في الجدول المعدات / المواد).
- احتضان لمدة 5 دقائق ويضاف خليط 106 ميكرولتر في الأنبوب قبل aliquoted تحتوي على ميكروغرام 3 ناقلات فيروسات. خلط واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة. إضافة هذه قطرة قطرة الخليط كله إلى كل بئر من الخلايا طائر الفينيق.
- يوم 3: بعد يوم واحد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام من الخلايا طائر الفينيق وإضافة 2 مل من اكتمال جديدة وسائل الاعلام DMEM. وفي اليوم نفسه، البذور الكيراتينية الإنسان الأساسية في 6 لوحات جيدة في كثافة 75،000 الخلايا لكل بئر. الحفاظ على الخلايا الكيراتينية في وسط مصل خلية كيراتينية مجانا (KCSFM) مع المضادات الحيوية (القلم / بكتيريا).
ملاحظة: تم شراؤها الكيراتينية الإنسان الأساسية. الخلايا يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من البائعين (المدرجة في جدول المواد / المعدات). - اليوم 4: هارسترة وسائل الإعلام من الخلايا transfected طائر الفينيق، الذي يحتوي الآن الجسيمات الفيروسية. تمر وسائل الإعلام من خلال 0.45 ميكرون التصفية باستخدام حقنة (لإزالة أي خلايا طائر الفينيق تلويث) وضعت 2 مل على الخلايا الكيراتينية (مطلي على 75000 خلية / جيدا في اليوم السابق: راجع الخطوة 2.3). إضافة بروميد hexadimethrine (5 ميكروغرام / مل) إلى وسائل الإعلام للمساعدة في التوسط في عملية العدوى. التتر الفيروسية ~ 1 × 10 7 TU / مل.
- تدور 6 لوحات جيدا في جهاز للطرد المركزي في 200 x ج لمدة 1 ساعة على RT. بعد زيادة ونقصان، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات وغسل خلايا مرة واحدة مع 1X PBS قبل إضافة KCSFM.
- اليوم 5: تصيب نفس دفعة من الخلايا القرنية مرة أخرى كما في الخطوة 2.4.
ملاحظة: حدد الخلايا القرنية باستخدام دواء إذا كان هناك علامة اختيار على ناقلات فيروسات وتوسيع لاستخدامها في تحليل المصب أو التطبيقات مثل الثقافات عضوي النمط. - بناءكاسيت عضوي النمط من المواد شيوعا وجدت في المختبر أو الأشرطة يمكن أن يكون العرف من خلال متجر تصنيع المعادن (الشكل 2A - F). لجعل هذه الأشرطة من 3.5 سم لوحة زراعة الأنسجة، استخدام الكي لإزالة 1.0 سم × 1.0 سم مربع من وسط غطاء من صحن 3.5 سم (الشكل 2A-B). القيام بذلك تحت ظروف معقمة.
- إرفاق أوتاد مربع في الجزء السفلي من الكاسيت (غطاء 3،5 سم الطبق) باستخدام طلاء الأظافر واضحة (الشكل 2C). سماح 5 دقائق لطلاء الأظافر لتجف والوجه الكاسيت أكثر بحيث يوضع على أوتاد مربع (الشكل 2D). وضع الكاسيت في طبق 6 سم.
ملاحظة: ساحة تربط يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الفنون والحرف اليدوية المخازن.
- إرفاق أوتاد مربع في الجزء السفلي من الكاسيت (غطاء 3،5 سم الطبق) باستخدام طلاء الأظافر واضحة (الشكل 2C). سماح 5 دقائق لطلاء الأظافر لتجف والوجه الكاسيت أكثر بحيث يوضع على أوتاد مربع (الشكل 2D). وضع الكاسيت في طبق 6 سم.
- إعداد نمو الخلايا الكيراتينية المتوسطة (KGM) تتألف من 66٪ DMEM، و 22٪ F12 هام، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 10٪ FBS، 2.67 ميكروغرام / مل الأدنين، 40 نز / مل الهيدروكورتيزون، 10 نانوغرام / مل السم الكوليرا، 4.94 ميكروغرام / مل الأنسولين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 1.36 نانوغرام / مل Triiodo-L-ثيرونين، 10 نانوغرام / مل EGF، و 10 ميكروغرام / مل هيدروكلوريد السيبروفلوكساسين. تصفية وسائل الإعلام من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
- اتخاذ الأدمة من 4X القلم / بكتيريا + حل PBS ويغسل 2 مرات في KGM ثم احتضان في KGM عند 37 درجة مئوية لمدة يومين قبل استخدامها.
- قطع الأدمة باستخدام مشرط إلى 1.5 سم × 1.5 سم قطعة الحجم ثم ضع على كاسيت عضوي النمط. وضع الأدمة مع الجزء العلوي من الأدمة مواجهة. والجزء العلوي من الأدمة يكون الجانب الذي يأتي في اتصال مع الخلايا القرنية (الشكل 1B).
- وضع قبل قطع الأدمة على حفرة مربعة من الكاسيت عضوي النمط مع الجانب العلوي من الأدمة مواجهة (الشكل 3A).
- الوجه الكاسيت عضوي النمط بأكمله تحتوي الأدمة على استخدام ملقط (الشكل 3B). ذوبان الجليد في حل المصفوفة خارج الخلية على الجليد. استخدام الإبر والمحاقن لاستخلاص 100 ميكرولتر من حل المصفوفة خارج الخلية في شريط كاسيت. إضافة 5 قطرات إلى أسفل الأدمة (الجانب اللامع) ويهز قليلا لضمان حتى التوزيع في جميع أنحاء الأدمة (الشكل 3B).
- سماح 5 دقائق للالتجاري اضافية حل مصفوفة الخلوية ليصلب تماما (الشكل 3C). بعد التصلب، استخدام ملقط لقلب كاسيت على ظهره. إضافة 4 مل من KGM إلى 6 سم الطبق.
- وضع 0،5-1٬000٬000 الكيراتينية المعدلة وراثيا على أشرطة عضوي النمط تحتوي الأدمة (الشكل 3D).
- يعرض للتريبسين الكيراتينية عن طريق وضع 4 مل من 0.05٪ التربسين على 10 سم لوحات لمدة 5 دقائق وإخماد مع 4 مل من وسائل الاعلام DMEM.
- عد الخلايا القرنية باستخدام عدادة الكريات ثم تدور باستمرار في 200 x ج لمدة 5 دقائق. 0،5-1٬000٬000 الخلايا resuspend (اعتمادا على عدد من الخلايا المتاحة) في 90 μلتر من KGM ووضع جميع الخلايا على الأدمة.
ملاحظة: من المهم أن تضع نفس العدد من الخلايا في الأدمة داخل نفس التجربة لضمان أن أي خلافات ينظر في سمك البشرة مجدد ليست بسبب الاختلافات في بدء عدد الخلايا. يمكن وضع أقل من 0.5 مليون خلية في الأدمة تؤدي إلى ضعف التكوين الطبقي والتمايز.
- تغيير وسائل الإعلام KGM على الثقافات عضوي النمط كل يوم. حصاد الأنسجة 1-14 أيام بعد إيداع الخلايا الكيراتينية في الأدمة. التقسيم الكامل والتفريق بين البشرة وعادة ما يحدث بعد يوم 5.
ملاحظة: استخدام الخلايا طائر الفينيق amphotropic تزرع في كامل وسائل الاعلام DMEM [DMEM + 10٪ الجنين مصل بقري (FBS) + القلم / بكتيريا] لإنتاج فيروسات أن تصيب الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية. يتم دمج الجينات التعبئة والتغليف الفيروسية التي ترميز البروتينات مثل هفوة-POL والظرف مستقر في جينوم الخلية طائر الفينيق الذي يسمح لإنتاج فيروس عندما مع transfected متجه فيروسات. خلايا طائر الفينيق يمكن مع transfected كفاءة عالية تتيح لإنتاج عالية عيار الفيروسية. فيروس تنتج من هذا خط التعبئة والتغليف ويمكن أيضا أن تصيب مجموعة كبيرة ومتنوعة من خلايا الثدييات بما فيها الإنسان.
3. إعداد الثقافات الجلد عضوي النمط
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوة الأولى في توليد جلد الإنسان عضوي النمط لإزالة البشرة من الأدمة. حضانة لمدة أسبوعين من الجلد عند 37 درجة مئوية في 4X القلم / بكتيريا / PBS ينبغي أن يسمح للفصل الأدمة من البشرة (الشكل 1A). إذا فصل البشرة والأدمة من الصعب ثم ضع الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 4x والقلم / بكتيريا / برنامج تلفزيوني لمدة أسبوع آخر ثم حاول مرة أخرى تقشير باستخدام ملقط.
واحد من مفاتيح لتجديد البشرة الإنسان في الأدمة مضعف هو التأكد من أن توضع الخلايا الكيراتينية على الجانب الصحيح من الأدمة. الأدمة ديها أعلى وأسفل. الجزء العلوي من الأدمة هو الجانب الذي يأتي في اتصال مع الخلايا الكيراتينية في الجسم الحي، وكذلك في الثقافات عضوي النمط. الجزء العلوي من الأدمة يمكن التفريق بين من أسفل الأدمة نظرا لمعان من القاع (الشكل 1B). إذا وضعت الخلايا الكيراتينية مباشرة على الجزء السفليالجانب (لامع) من الأدمة، فإن البشرة لا تفرق أو تطبق بشكل صحيح. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن يكون الجزء العلوي من الأدمة (غير لامعة) مواجهة في الكاسيت عضوي النمط. يمكن وضعها الأدمة مباشرة على كاسيت عضوي النمط (الشكل 2A - F). أشرطة مصنوعة من لوحات زراعة الأنسجة وينبغي للأشعة فوق البنفسجية تعقيم حين المعادن المشكلة أشرطة يمكن تعقيمها قبل الأدمة التي توضع على. ويمكن بعد ذلك أن توضع الخلايا الكيراتينية المعدلة وراثيا على الأدمة. وغمرت الخلايا الكيراتينية في البداية في السائل لأنها وضعت على الأدمة معلق في KGM. بعد 24 ساعة من KGM سيكون قد تنتشر من خلال الأدمة التي تسمح للخلايا القرنية إلى أن يتعرض إلى واجهة الهواء السائل الذي يسبب الطبقية والتمايز إلى البشرة 7 (الشكل 3).
RNA والبروتين والحمض النووي / لونين، وكذلك أقسام الأنسجة يمكن أن تحصد من الصورة عضوي النمطثقافات القربى التي يمكن أن تستخدم كل لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. ويمكن استخدام RNA لتحديد الاختلافات التعبير الجيني بين السيطرة وضربة قاضية / الأنسجة overexpression باستخدام RT-QPCR، ميكروأرس، أو RNA تسلسل. DNA / لونين يمكن استخدامها لتطبيقات DNA أو رقاقة وما يليها. الجلد مجدد يمكن تركيبه في أكتوبر والأبواب المجمدة يمكن استخدامها لالمناعية تلطيخ أو الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ لتقييم التشكل الأنسجة، وتعبير البروتين / التعريب في السيطرة والمجموعات التجريبية.
ويرد مثال على ذلك في الشكل 4 مع الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ ثقافة نموذجية الجلد عضوي النمط. لاحظ أن جميع طبقات متميزة أربعة من البشرة تتشكل مع التعبير محدد طبقة من البروتينات المرتبطة تمايز (الشكل 4) 11،12،14،15. هذا النظام يمكن استخدامه لتحديد آثار overexpression أو ضربة قاضية للجينات مختلفة على البشرة. الشكل 5 يظهر مجدد أنسجة البشرة التي تعبر عن السيطرة، LACZ وكذلك الأنسجة overexpressed لSNAI2. أدى overexpression من SNAI2 إلى تثبيط البشرة التمايز كما لاحظت عدم وجود الكيراتين 1 (K1) تلطيخ فضلا عن فقدان التعبير التمايز بفعل الجينات الهيكلية مثل TGM1 وSPRR1A (الشكل 5A - C) 13،22. سمك البشرة هو مبين في الشكل (4) والشكل (5) قد تختلف داخل نفس العينة بسبب تراكم المزيد من الخلايا في وسط الأدمة مقابل المحيط عندما وضعت الخلايا في البداية على الأدمة. وبالتالي، تميل الأقسام الوسطى لبشرة أكثر سمكا في حين محيط يميل إلى أن يكون أرق. وعلى سبيل المقارنة المباشرة بين عينات مختلفة يجب مقارنة بنفس المناطق من القسم. ومع ذلك، ينبغي للتلطيخ لعلامات يبقى ثابت.
"الشكل 1" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
الشكل 1. إعداد الأدمة من الجلد البشري. (A) بعد مرور فترة الحضانة من الجلد البشري عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع، الأدمة يمكن فصلها عن البشرة. يتم استخدام ملقط لقشر البشرة (أسمر اللون) بعيدا عن الأدمة (أبيض). (B) الجزء العلوي من الأدمة يمكن تمييزها عن الجزء السفلي من لمعان من الأنسجة. الجزء العلوي من الأدمة (الجانب التي ستواجه طبيعي للبشرة في الجسم الحي أو حيث سيتم المصنف الخلايا الكيراتينية) هو غير لامع. أسفل الأدمة هو لامع. النسيج وردي بسبب حضانة في KGM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Figure 2. جيل من أشرطة عضوي النمط (A) استخدام الكي لإزالة 1.0 سم × 1.0 سم مربع من وسط غطاء من صحن 3.5 سم. (B) إزالة مربع من مركز 3،5 سم الطبق. (C) استخدام طلاء الأظافر واضحة على الالتزام أوتاد مربع. سماح 5 دقائق لطلاء الأظافر لتجف. (D) فليب غطاء فوق بحيث يوضع على أوتاد مربع. الكاسيت هو الآن على استعداد لاستخدامها. (E) صورة من معدن ملفقة عضوي النمط كاسيت مع أبعادها. (F) صورة ملفقة كاسيت المعادن انقلبت رأسا على عقب لإظهار أوتاد الدعم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توليد organotثقافات الجلد ypic. (A) مكان الأدمة مع الجزء العلوي من الأدمة (الجانب غير لامع) مواجهة على كاسيت عضوي النمط. (B) الوجه الكاسيت مرارا وإضافة Matrigel إلى الجانب اللامع من الأدمة. (C) السماح 5 دقائق لMatrigel لترسيخ والوجه ثم الكاسيت على الظهر. (D) إضافة المعدلة وراثيا الخلايا الكيراتينية إلى الأدمة (ومعلق 0،5-1٬000٬000 الخلايا في 90 ميكرولتر من KGM). حصاد الأنسجة بعد 1-14 أيام البذر من الخلايا الكيراتينية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ الثقافات الجلد عضوي النمط. مجدد جلد الإنسان يحتوي على كل من البشرة والأدمة. وepidermهو غير طبقية بالكامل ومتباينة مع 4 طبقات متميزة. وتشمل هذه الطبقات الطبقة القاعدية غير متمايزة و3 طبقات متباينة بما في ذلك الطبقة الشائكة، الحبيبية والقرنية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تلطيخ المناعي وتحليل التعبير الجيني للبشرة الإنسان المعدلة وراثيا. (A) overexpression من SNAI2 يمنع البشرة التمايز. تلطيخ للبروتين الكيراتين التمايز 1 (K1) يظهر باللون الأخضر ونوى وضعت في الزرقاء (هويشت). (B) تحليل RT-QPCR على مستويات مرنا من SNAI2 في LACZ السيطرة وSNAI2 الأنسجة overexpressing. أشرطة الخطأ = SD، ن = 3. (C) تحليل RT-QPCR على مرنامستويات النصوص التمايز KRT1، TGM1، وSPRR1A في LACZ السيطرة وSNAI2 الأنسجة overexpressing. أشرطة الخطأ = SD، ن = 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التلاعب الجيني في جلد الإنسان الثقافات عضوي النمط توفر العديد من المزايا لدرس عادة 2D الخلايا المستزرعة وكذلك نماذج الماوس. ثقافات 2D تفتقر إلى خلية خلية وخلية الخلية التفاعلات مصفوفة ثلاثية الأبعاد الموجودة في الأنسجة والأعضاء السليمة. وقد وجدت الدراسات الحديثة أيضا اختلافات هائلة بين 2D و 3D خلايا سرطان الجلد مثقف مع الخلايا 3D مثقف تظهر أكثر من ذلك بكثير التشابه التعبير الجيني لجلد الإنسان الأساسي الأورام 16. يكون الجلد الثقافات عضوي النمط الإنسان أيضا العديد من المزايا على نماذج الماوس. نماذج الماوس هي مضيعة للوقت ومكلفة لتوليد فضلا عن العديد من الاختلافات الملحوظة بين الإنسان والجلد الماوس. وتشمل هذه مختلفة معدلات دوران الأنسجة وكذلك سمك البشرة بين الفئران والبشرة الإنسان 8. مع التكنولوجيات الجديدة الناشئة مثل كريسبر-CAS، جينات معينة يمكن تعديلها / تحور لنموذج أمراض الجلد البشري باستخدام عضوي النمط الثقافيه الجلدوفاق 23. وعلاوة على ذلك، الجينات يمكن أن يتم تسليم أو ترسيتها في هذه الخلايا من خلال مجموعة واسعة من الأساليب بالإضافة إلى نقل الجينات فيروسات هو موضح هنا. طالما هناك تسليم قوي من خلال الكفاءة تنبيغ عالية أو اختيار الدواء، ويمكن استخدام هذه الطريقة. وتشمل هذه الأساليب تسليم nucleofection من الرناوات siRNAs، lentiviral، فيروس adenoassociated، والغدة فيروس 11،12،24-26.
ثقافات الجلد عضوي النمط يمكن تعديلها بإضافة أنواع مختلفة من الخلايا إلى النظام. على سبيل المثال، طبيعية أو المعدلة وراثيا الخلايا الليفية الإنسان يمكن أن تضاف إلى الأدمة مضعف لدراسة الوسيطة والحديث المتبادل الظهارية. ويمكن أيضا أن الخلايا المناعية أن تضاف إلى الأدمة لدراسة الاستجابة الالتهابية للاضطرابات في الجلد. واحد الحد من هذا النظام هو أن عملية التقشر الذي يحدث في الجسم الحي لا يحدث في الثقافات عضوي النمط. هذا يمنع استخدام هذه الثقافات على المدى الطويل، ومعظم التحليلاتيتم بين 1-14 أيام بعد البذر من خلايا البشرة. لفحوصات على المدى الطويل، والثقافات عضوي النمط يمكن المطعمة على ظهر الفئران المناعي للخطر 17،27.
ثقافة عضوي النمط الجلد المقدمة هنا هي فريدة من نوعها في أنه يستخدم سليمة الأدمة الإنسان الميتة التي هي الركيزة الطبيعية للبشرة في الجسم الحي في حين معظم الأنظمة الأخرى تستخدم الكولاجين أو Matrigel والركيزة 28. الإعداد للثقافات الجلد عضوي النمط باستخدام ركائز مثل نتائج Matrigel في الطبقات أرق وأقل قوة من البشرة في تجربتنا. تحتوي الأدمة على الطابق السفلي البروتينات منطقة الغشاء بما في ذلك laminin والكولاجين الذي يسمح للخلايا البشرة لنعلق، تتكاثر، تفرق، وتطبق 29. استخدام الأدمة يسمح لجيل من البشرة الذي يحاكي في الجسم الحي نظيرهما. وبالتالي، يمكن أن الثقافات عضوي النمط الجلد تكون ذات قيمة للغاية في الصورة السمية والدوائيةtudies في الحالات التي لا يسمح الدراسات الحيوانية (صناعة مستحضرات التجميل) 30.
عن طريق الأدمة مضعف كما يأتي مع عيوبه الخاصة منذ سمك الأدمة بين مختلف الجهات المانحة أو حتى داخل نفس الجهة المانحة يمكن أن تختلف. خلايا البشرة نمت على الأدمة سميكة تميل إلى عدم تتكاثر وتوليد كما سميكة من البشرة إلى خلايا المزروعة في الأدمة أرق. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن يختار الأدمة سمك مماثلة عند إعداد تجارب لمقارنة عينات متعددة. معلمة هامة أخرى هي البذور على نفس العدد من خلايا البشرة عند المقارنة بين مجموعات مختلفة بحيث أن أي خلافات ينظر ليست بسبب الاختلافات في العدد الأولي من خلايا المصنف.
في الختام، يمكن للثقافة الجلد عضوي النمط بمثابة تقدما وكفاءة في نموذج المختبر للتحقق من صحة المسارات الجزيئية في سياق أكثر الفسيولوجية، مما يعجل في نهاية المطاف فهم الجينات ميكان التنظيميالمذهبين التي تعتبر مهمة في نمو البشرة والتمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وكان هذا العمل supportedby الأمريكية سرطان جمعية أبحاث علماء جرانت (RSG-12-148-01-DDC) وجائزة البيولوجيا CIRM الأساسية (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A.
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E.
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A.
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V.
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
