Abstract
器官培養物は、それらのin vivoでの組織の対応の機能および生理学を模倣する細胞-細胞接触および細胞-マトリックス相互作用のための3D環境の再構成を可能にする重要な。これは、忠実に表皮分化と成層プログラムを再現する器官型皮膚培養が挙げられます。初代ヒト表皮角化細胞は、遺伝子が容易に過剰発現またはノックダウンすることができますレトロウイルスを介して遺伝的に操作可能です。これらの遺伝的に改変されたケラチノサイトは、次に遺伝的経路に衝突上皮細胞増殖、分化、および疾患の進行を研究するための強力なモデルを提供し、皮膚器官培養におけるヒト表皮を再生するために使用することができます。ここで紹介するプロトコルは、失活ヒト真皮を準備するだけでなく、と遺伝的に器官皮膚培養を生成するために、初代ヒトケラチノサイトを操作する方法を説明します。再生した人間の皮膚はdownstrに使用することができますこのような遺伝子発現プロファイリング、免疫染色、及びハイスループットシークエンシングに続いてクロマチン免疫沈降などのEAMアプリケーション。したがって、これらの遺伝的に改変された器官、皮膚培養物の生成は、皮膚恒常性を維持するために重要である遺伝子の決意を可能にします。
Introduction
ヒト表皮基底膜zone.Theの表皮として知られている細胞外マトリックスは、水分の損失を防ぐために、不浸透性の障壁としてだけでなく、保護するための最初の防衛線として機能するだけでなく、を介して基礎となる真皮に接続重層上皮であります外国と有害物質1から体。表皮の最も深い層である基底層は、表皮2の残りの部分を形成する分化した子孫を生じさせる上皮幹細胞および前駆細胞が含まれています。上皮前駆細胞が分化するように、それらは有棘層3として知られている分化した細胞の第1の層を形成するために上方に移動します。棘層では、細胞は、その後、表皮の分化した層のための物理的ストレスに耐える強度を提供する、ケラチン1および10の発現をオンにします。有棘層細胞は、さらに分化するように、それらはのために、表皮中で上方に移動ケラトヒアリンおよびラメラ顆粒の形成と同様に、原形質膜の下に組み立てられている構造タンパク質によって特徴付けられる顆粒層をメートル。細胞は、分化過程に進むように、ラメラ顆粒が細胞から押し出されているが、原形質膜の下のタンパク質は、クロス脂質豊富な障壁を形成するように互いに連結された角質層4と呼ばれます 。
上皮細胞の増殖および分化への影響の変化を伴う疾患人口の5〜20％。したがって、このプロセスのメカニズムを理解することは非常に重要です。これらの疾患の多くの症状は、細胞-細胞または細胞-マトリックス接触時に偶発的であることから、ヒトの表皮は、3D環境で再構成された器官培養物は、6月10日に作成されています。これらの方法は、典型的には、失活ヒトなどの細胞外マトリックス上に播種し、一次または形質転換ケラチノサイトの使用を含みます真皮、マトリゲル、またはコラーゲン。
上皮細胞の増殖および分化において重要な遺伝子調節機構を理解するために、ケラチノサイトを遺伝的に、2D培養での遺伝子ノックダウンまたは過剰発現するようにレトロウイルスベクターを介して操作され、その後、3次元で再構成することができます。これらの方法は、新生物11-21に表皮幹細胞および前駆細胞の自己再生および分化ならびに進行に関与する遺伝子を特徴づけるために広く使用されています。ここでは、レトロウイルスの使用を介して表皮器官培養物中の遺伝子発現を変化させる方法についての詳細なプロトコルが提供されます。
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Protocol
ヒトの皮膚のプロトコールは、カリフォルニア大学サンディエゴ校の研究倫理委員会のガイドラインに従って行いました。ヒトの皮膚は、廃棄された外科的サンプルから得られたか（スキンバンクは材料/機器表に記載されている）は、皮膚の銀行から購入することができます。皮膚が由来されている場所やドナーの年齢は限り真皮における基底膜領域タンパク質（コラーゲン/ラミニン）が分解されないように、実験には重要ではありません。
失活ヒト真皮の調製
- ヒトの皮膚を受信すると、（〜3-5分）を解凍し、組織培養フード内で組織を置きます。皮膚のサイズに応じて、滅菌使い捨て50mlコニカルチューブまたは125ミリリットル瓶で解凍組織を配置します。皮膚バンクからの皮膚の一般的なサイズは、0.75平方フィートです。
- 1×PBSで4倍のペニシリンおよびストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で、75％の完全な容器を満たします。激しく振ります5分とは、液体の処分。このステップを3回繰り返します。
- 最後の洗浄後、新しいチューブ/ボトルに組織を転送し、コンテナの75％を埋めるために、新鮮な4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSを追加します。表皮と真皮の分離を可能にするために2週間、37℃の組織培養インキュベーター中でこの混合物をインキュベートします。
- 無菌条件下で、真皮から表皮を剥がすために鉗子を使用しています。表皮は、ドナー（ 図1A）のレースに応じてカラーリングを持つことになりますしながら、真皮は完全に白です。ヒト組織に対処するための金融機関のプロトコルに従って表皮を廃棄します。
- チューブや瓶の中に真皮を置き、（4回5分間の洗浄）激しく振盪しながら1×PBSで希釈した4倍ペニシリン/ストレプトマイシンでそれを洗います。最後の洗浄後、使用する準備ができるまで4℃で4倍ペン/ 1×PBSで希釈した連鎖球菌およびストアに新しいチューブ/ボトルに真皮を転送します。真皮は今年まで4℃で保存することができます。 2.遺伝的に変更初代ヒトケラチノサイト
- 1日目：トランスフェクションの前日、完全DMEM培地でも80万個の細胞の密度で6ウェルプレートでシードフェニックス細胞。
- 2日目：トランスフェクションの日には、ウェル当たりレトロウイルスベクターの3μgのを使用しています。アリコート1.5mlチューブへのレトロウイルスベクターの3μgの。 100μのミックスを使用します;リットルのDMEMを加えたベクトルのすべての3μgのためのトランスフェクション試薬の6μlの。 1.5mlチューブ中の100μlのDMEMでトランスフェクション試薬の6μLを混ぜます。 （使用されているレトロウイルスベクターは、装置/材料の表に記載されています）。
- 5分間インキュベートし、レトロウイルスベクターの3μgのを含む事前に小分けチューブに106μlの混合物を追加します。混合し、室温で30分間インキュベートします。フェニックス細胞の各ウェルに、この混合物全体を滴下して加えます。
- 3日目：トランスフェクションの翌日、フェニックス細胞から培地を除去し、新鮮な完全DMEM培地2mlのを追加。同じ日に、ウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに初代ヒトケラチノサイトをシード。抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）でケラチノサイト無血清培地（KCSFM）でケラチノサイトを維持します。
注：一次ヒトケラチノサイトを購入しました。細胞は、（材料/機器表に記載されている）、さまざまなベンダーから購入することができます。 - 4日目：ハー今ウイルス粒子を含む、トランスフェクトされたフェニックス細胞から培地を権利が確定します。注射器を用いて0.45μmのフィルターを通してメディアを渡します（任意の汚染フェニックス細胞を除去するため）、ケラチノサイトに2ミリリットルを配置（前日/ウェル75,000細胞で播種：ステップ2.3を参照してください）。感染過程を媒介するために役立つ培地にヘキサジメトリンブロミド（5μg/ ml）を加えます。ウイルス力価は、約1×10 7 TU / mlです。
- RTで1時間、200×gで遠心分離で6ウェルプレートをスピン。スピンした後、ウイルスを含む培地を除去し、KCSFMを追加する前に、1×PBSで細胞を1回洗浄します。
- 5日目：ステップ2.4のように再びケラチノサイトの同じバッチに感染します。
注：レトロウイルスベクターの選択マーカーがある場合、薬物を使用して、ケラチノサイトを選択して、下流の分析や、器官培養などのアプリケーションで使用するために展開します。 - ビルド一般的な実験で見つかった物質またはカセットから器官カセットは、カスタム金属加工工場（ - F図2A）を介して行うことができます。 3.5センチメートル組織培養プレートからこれらのカセットを作るために3.5センチの皿（ 図2A-B）の蓋の中心から1.0センチメートルX 1.0センチメートルの正方形を削除するには、焼灼を使用しています。無菌条件下でこれを行います。
- 明確なマニキュア（ 図2C）を使用して、カセット（3.5センチの皿の蓋）の底部に正方形のペグを取り付けます。マニキュアのための5分を乾燥し、それが正方形のペグ（ 図2D）に載っているように、カセットを裏返しすることができます。 6cm皿にカセットを置きます。
注：スクエアペグは、芸術品や工芸品店の様々なから購入することができます。
- 明確なマニキュア（ 図2C）を使用して、カセット（3.5センチの皿の蓋）の底部に正方形のペグを取り付けます。マニキュアのための5分を乾燥し、それが正方形のペグ（ 図2D）に載っているように、カセットを裏返しすることができます。 6cm皿にカセットを置きます。
- 10％FBS、2.67 / mlのアデニン、40 N、ストレプトマイシン100μg/ mlの、66％DMEM、22％ハムF12、100単位/ mlのペニシリンからなるケラチノサイト増殖培地（KGM）を準備しますグラム/ mlのヒドロコルチゾン、10 ngの/ mlのコレラ毒素、4.94 / mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、1.36 ngの/ mlのトリヨード - L - チロニン、10 ngの/ mlのEGF、および10μg/ mlのシプロフロキサシン塩酸塩。使用する準備ができるまで4℃で0.22μmフィルターとストアを介してメディアをフィルタリングします。
- 4倍ペニシリン/ストレプトマイシン+ PBS溶液から真皮を取り、KGMで2回洗浄した後、使用前に2日間37℃でKGMでインキュベートします。
- 1.5センチメートルX 1.5センチメートルサイズの部分にメスを用いて真皮をカットして、器官カセットの上に置きます。上を向いて真皮の上部と真皮を置きます。真皮の上部には、ケラチノサイト（ 図1B）と接触する側になります。
- （ 図3A）を上に向け、真皮の上部側と器官カセットの角穴にプレカット真皮を置きます。
- 鉗子を使用しての上に真皮を含む全体の器官カセットをフリップ（図3B）。氷上で細胞外マトリックス溶液を解凍します。カセットあたりの細胞外マトリックス溶液100μlを引き出すために、針と注射器を使用してください。真皮（光沢のある側）の底部に5滴を追加し、真皮（ 図3B）全体に均一な分布を確実にするために、わずかに振ります。
- 商業細胞外マトリックス溶液で5分間は完全に（ 図3C）を固化することを許可します。固化した後、バックの上にカセットを反転するために鉗子を使用しています。 6cmディッシュにKGMの4ミリリットルを追加します。
- 真皮（ 図3D）を含む器官カセット上に0.5から1000000遺伝子改変されたケラチノサイトを置きます。
- トリプシン処理を、5分間、10cmのプレートに0.05％の4 mlのトリプシンを配置することにより、ケラチノサイトおよび完全DMEM培地4mlでクエンチしました。
- 血球計数器を使用して、ケラチノサイトをカウントし、その後5分間200×gでスピンダウン。 90μで（利用可能なセルの数に応じて）0.5から1000000細胞を再懸濁しKGMのLと真皮にすべてのセルを配置します。
注：再生表皮の厚さに差が見られる任意の細胞数の開始の違いによるものではないことを保証するために、同じ実験内の真皮に同数の細胞を配置することが重要です。真皮に0.5未満万個の細胞を配置すると、貧しい階層と差別につながることができます。
- 一日おきに器官培養にKGMメディアを変更します。収穫組織真皮のケラチノサイトの配置後1-14日。表皮の完全な層化と分化は、通常は5日後に発生します。
注：初代ヒトケラチノサイトに感染するウイルスを生成するために、完全DMEM培地[DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン/ストレプトマイシン]中で増殖させた使用アンホトロピックフェニックス細胞。このようなGAG-pol及びエンベロープのようなタンパク質をコードするウイルスパッケージング遺伝子を安定的に、レトロウイルスベクターでトランスフェクトされた場合、ウイルス産生を可能にするフェニックス細胞ゲノムに組み込まれています。フェニックス細胞は、高いウイルス力価の産生を可能にする、高効率でトランスフェクトすることができます。この包装ラインから産生されたウイルスは、ヒトを含む哺乳類細胞の多種多様に感染することができます。
3.器官皮膚の文化を設定します
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Representative Results
器官人間の皮膚を生成する最初のステップは、真皮から表皮を除去することです。 37°Cの4倍でペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSの皮膚の2週間のインキュベーションは、表皮（ 図1A）から真皮の分離を可能にする必要があります。表皮と真皮を分離することは困難である場合には、別の週に4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBS中で37℃で組織を配置し、ピンセットを用いて再剥離してみてください。
失活真皮上のヒト表皮を再生するための鍵の一つは、ケラチノサイトが真皮の正しい側に配置されていることを確認することです。真皮は、頂部および底部を有しています。真皮の上部には、インビボで 、ならびに器官培養物でケラチノサイトと接触する側です。真皮の上部起因下部（ 図1B）の光沢度に真皮の下から区別することができます。ケラチノサイトは、底部に直接配置されている場合真皮の側（光沢）、表皮は差別か、正しく階層化しません。したがって、器官カセットに上向き真皮（非光沢）の頂部を有することが重要です。真皮は、器官カセット（ - F図2A）上に直接配置することができます。金属製造されたカセットは真皮の前には、上に配置されているオートクレーブ処理することができますしながら、組織培養プレートから作られたカセットは、UV滅菌する必要があります。遺伝的に改変されたケラチノサイトはその後、真皮の上に配置することができます。それらはKGM中に再懸濁させ、真皮の上に配置したので、ケラチノサイトは当初、液体中に浸漬されています。 24時間後、KGMは、ケラチノサイトは、表皮7（ 図3）への層化および分化を引き起こす気液界面に露出されることを可能に真皮を通って拡散しているであろう。
RNA、タンパク質、DNA /クロマチン、ならびに組織切片は、器官Sから採取することができますすべてのダウンストリームの様々な用途に使用することができる親族培養。 RNAは、対照およびRT-QPCR、マイクロアレイ、またはRNA-配列番号用いてノックダウン/過剰発現の組織間の遺伝子発現の差を決定するために使用することができます。 DNA /クロマチンは、DNAまたはチップのSeq-用途に使用することができます。再生された皮膚は、OCT内に装着することができ、凍結切片は、対照群と実験群に組織形態、タンパク質発現/局在化を評価するために、免疫染色またはヘマトキシリンおよびエオシン染色のために使用することができます。
この例は典型的な皮膚器官培養物のヘマトキシリンおよびエオシン染色を図4に示されています。表皮のすべての4つの別個の層が分化関連タンパク質の層特異的発現（ 図4）11,12,14,15が形成されていることに注意してください。このシステムは、表皮上の異なる遺伝子の過剰発現またはノックダウンの影響を決定するために用いることができる。 図5 SNAI2のために過剰発現制御、LACZならびに組織を表現し、再生表皮組織を示しています。 13,22 -ケラチン1（K1）の染色性の欠如ならびにTGM1やSPRR1Aなどの分化誘導された構造遺伝子（C図5A）の発現の喪失によって示されるようSNAI2の過剰発現は、表皮分化の阻害につながりました。 図4および図5に示した表皮の厚さが原因で、細胞が最初に皮膚上に置かれたときに周囲対真皮の途中で蓄積する複数のセルに同じ試料内で変化し得ます。このように、真ん中のセクションでは、周辺部が薄くなる傾向にあるのに対し、厚い表皮を有する傾向があります。異なるサンプル間の直接比較については、セクションの同じ領域を比較すべきです。しかし、マーカーの染色は、一貫性のある滞在する必要があります。
「図1」SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
ヒトの皮膚の真皮の図1の調製（A）2週間、37℃で、ヒトの皮膚のインキュベーションの後、真皮を表皮から分離することができます。鉗子を離れて、真皮（白）から（茶色）、表皮を剥離するために使用されます。 （B）真皮の上部には、組織の光沢により、底部から区別することができます。真皮の上部（当然、インビボまたはどこケラチノサイトが播種される中で 、表皮に直面することになる側）は非光沢です。真皮の底部は光沢があります。組織は、KGM中でのインキュベーションによるピンク色である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
F器官カセットのigure 2世代。（A）3.5センチメートル皿の蓋の中心から1.0センチメートルX 1.0センチメートルの正方形を削除するには、焼灼を使用してください。 （B）3.5センチメートル皿の中心から四角形を削除します。 （C）は、正方形のペグを接着するために明確なマニキュアを使用してください。マニキュアのための5分乾燥することができます。それは正方形のペグに載っているように、（D）ふたを裏返し。カセットを使用する準備ができました。金属の（E）画像は、その寸法の器官カセットを作製しました。 （F）金属製造されたカセットの画像が、支持ペグを表示するように上下逆さまに反転。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
organotの図3.生成ypic皮膚培養。（A）は、器官カセット上に上向きに真皮の上部（非光沢面）と真皮を置きます。 （B）の上にカセットを反転し、真皮の光沢面にマトリゲルを追加します。マトリゲルが固化した後、バックの上にカセットを反転する（C）が 5分を許可します。 （D）は （0.5〜百万個の細胞をKGM90μlの中に再懸濁されている）真皮に遺伝的に改変されたケラチノサイトを追加します。 1-14日ケラチノサイトの播種後の組織を採取する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.ヘマトキシリンおよび器官皮膚培養のエオシン染色。再生したヒトの皮膚は、表皮と真皮の両方が含まれています。表皮ある4つの異なる層を有する完全に層状と区別されます。これらの層は、未分化の基底層と有棘層、顆粒および角質層を含む3差別の層を含む。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.免疫蛍光染色および遺伝的に改変されたヒト表皮の遺伝子発現解析は、SNAI2の（A）の過剰発現は、表皮の分化を阻害します。分化タンパク質ケラチン1（K1）のための染色は緑色で示されており、核はブルー（ヘキスト）でマークされます。 （B）制御LACZとSNAI2過剰発現する組織でSNAI2のmRNAレベルのRT-qPCR分析。 mRNA上のエラーバー= SD、N = 3（C）RT-QPCR分析制御LACZとSNAI2過剰発現する組織における分化転写KRT1、TGM1、およびSPRR1Aのレベル。エラーバー= SD、N = 3 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ヒト皮膚器官培養における遺伝子操作は、一般的に、2D培養細胞だけでなく、マウスモデルを研究するために多くの利点を提供します。 2D培養物は、無傷の組織および器官に見出される三次元の細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス相互作用を欠いています。最近の研究では、一次ヒト皮膚腫瘍16にはるかに遺伝子発現の類似性を示す3次元培養細胞を用いた2次元および3次元培養皮膚癌細胞との間の多大な違いを発見しました。ヒトの皮膚器官培養物はまた、マウスモデルを超えるいくつかの利点を有します。マウスモデルは、同様に、ヒトおよびマウスの皮膚との間のいくつかの顕著な違いを生成するために時間がかかり、高価です。これらは、異なる組織代謝回転速度、ならびにマウスおよびヒトの表皮8の間に、表皮の厚さがあります。このようなCRISPR-CAS等の新興新技術で、特定の遺伝子は、器官、皮膚culturを用いてヒトの皮膚病をモデル化するために変異さ/変更することができますエス23。さらに、遺伝子は、納入またはここに記載のレトロウイルス遺伝子導入に加えて多種多様な方法を介して、これらの細胞中でノックダウンすることができます。限り高い形質導入効率または薬剤選択を介して強固な配信があるので、この方法を用いることができます。これらの送達方法は、siRNAのヌクレオ、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアデノウイルス11,12,24-26が含まれます 。
器官型皮膚培養物は、システムに異なる細胞型を追加することによって変更することができます。例えば、通常のまたは遺伝的に改変されたヒト線維芽細胞は、間葉系および上皮クロストークを研究するために失活真皮に添加することができます。免疫細胞は、皮膚における摂動に対する炎症応答を研究するために、真皮に添加することができます。システムの1つの制限は、 インビボで起こる落屑プロセスは、器官型培養物では起こらないということです。これは、長期的かつ最も解析のためのこれらの培養物の使用を妨げます表皮細胞の播種後1〜14日の間に行われます。長期的アッセイのために、器官型培養物は、免疫不全マウス17,27の背中に移植することができます。
それは他のほとんどのシステムは、基板28として、コラーゲンまたはマトリゲルを使用するのに対し、in vivoでの表皮の天然基質である無傷の失活ヒト真皮を利用という点で、ここに提示した皮膚器官の文化は独特です。そのような私たちの経験では、表皮の薄く、あまり堅牢な成層でマトリゲル結果として基板を用いた器官皮膚培養のセットアップ。真皮は、表皮細胞は、添付増殖、分化する、と29を層別化することを可能にするラミニンやコラーゲンなどの基底膜領域タンパク質が含まれています。真皮の使用は、 それらのインビボの対応を模倣表皮の生成を可能にします。したがって、器官皮膚培養物は、毒性学的および薬理学の中で非常に貴重なことができ動物実験は、（化粧品業界）30許可されていない場合にtudies。
異なるドナー間で、あるいは同じドナー内の真皮の厚さが異なりますので、失活真皮を使用すると、独自の欠点が付属しています。厚い真皮上に成長した上皮細胞が増殖し、より薄い皮膚上で増殖した細胞、表皮のように厚く生成しない傾向にあります。複数のサンプルを比較する実験を設定する際にこのように、同様の厚さ、真皮を選択することが重要です。別の重要なパラメータは、別のグループを比較する場合に見られる違いが播種した細胞の初期数の違いによるものではないように、表皮細胞の同じ数を播種することです。
結論として、器官型皮膚培養は、最終的には、遺伝子調節mechanの理解を加速され、より生理的な文脈で分子経路を検証するためのインビトロモデルにおける先進的かつ効率的なとして機能することができ上皮細胞の増殖および分化において重要であるISMS。
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Acknowledgments
この作品は、米国癌協会の研究学者グラント（RSG-12-148-01-DDC）とCIRM基本生物学賞（RB4-05779）supportedbyました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A.
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E.
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A.
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V.
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
