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Developmental Biology

Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53280
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

Abstract

Cultures organotypiques permettent la reconstitution d'un environnement 3D critique pour les interactions de contact cellule-cellule et de cellule-matrice qui imite la fonction et la physiologie de leurs homologues in vivo de tissus. Ceci est illustré par des cultures organotypiques de peau qui récapitule fidèlement la différenciation épidermique et le programme de stratification. Kératinocytes primaires épidermiques humains sont génétiquement manipulable par rétrovirus où les gènes peuvent être facilement surexprimés ou renversé. Ces kératinocytes génétiquement modifiées peuvent ensuite être utilisés pour régénérer l'épiderme humain dans des cultures organotypiques de peau qui fournissent un modèle puissant pour étudier les voies génétiques croissance épidermique d'impact, la différenciation et la progression de la maladie. Les protocoles présentés ici décrivent des procédés pour préparer de derme humains dévitalisés ainsi que pour manipuler génétiquement les kératinocytes humains primaires afin de générer des cultures organotypiques de peau. La peau humaine régénéré peut être utilisé dans downstrEAM applications telles que le profilage de l'expression génique, une immunocoloration, des immunoprécipitations et de chromatine suivie de séquençage à haut débit. Ainsi, la production de ces cultures organotypiques de peau génétiquement modifiés permettra à la détermination des gènes qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie de la peau.

Introduction

L'épiderme humain est un épithélium stratifié qui se connecte au derme sous-jacent à travers une matrice extracellulaire connu comme l'épiderme zone.The de la membrane basale sert non seulement une barrière imperméable pour empêcher la perte d'humidité, mais aussi en tant que première ligne de défense pour protéger le le corps des substances étrangères et toxiques 1. La couche de base, qui est la couche la plus profonde de l'épiderme, les cellules épidermique contient souches et progénitrices qui donnent lieu à la descendance différenciée qui forment le reste de l'épiderme 2. Comme les cellules progénitrices de l'épiderme se différencient de leur migration vers le haut pour former la première couche de cellules différenciées connu que la couche épineuse 3. Dans la couche épineuse, les cellules tournent sur l'expression de kératines 1 et 10, qui fournit alors la force de résister à une contrainte physique pour les couches différenciées de l'épiderme. Comme les cellules de la couche épineuses se différencient en outre, ils se déplacent vers le haut dans l'épiderme à dem la couche granulaire qui est caractérisée par la formation de granules de kératohyaline et lamellaires ainsi que des protéines de structure qui sont assemblés en dessous de la membrane plasmique. Comme les cellules passent dans le processus de différenciation, les protéines sous la membrane de plasma sont réticulés les uns aux autres, tandis que les granulés sont extrudés lamellaires à partir des cellules pour former une barrière lipidique riche appelée stratum corneum 4.

Les maladies qui impliquent des altérations de croissance épidermique et de l'impact de la différenciation de ~ 20% de la population 5. Ainsi, la compréhension des mécanismes de ce processus est d'une grande importance. Depuis manifestation de plusieurs de ces maladies est subordonnée à cellule-cellule ou cellule-matrice de contact, cultures organotypiques où l'épiderme humain est reconstitué dans un environnement 3D ont été créés 6-10. Ces procédés impliquent typiquement l'utilisation de kératinocytes primaires ou transformées ensemencées sur la matrice extracellulaire telles que les humains dévitalisésderme, Matrigel, le collagène ou.

Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes qui sont importants pour la croissance et la différenciation de l'épiderme, les kératinocytes peuvent être manipulées génétiquement par des vecteurs rétroviraux pour surexprimer des gènes knockdown ou en culture 2D et ensuite reconstitués en 3D. Ces méthodes ont été largement utilisées pour caractériser les gènes impliqués dans l'épiderme souches et cellules progénitrices auto-renouvellement et de différenciation ainsi que la progression de la néoplasie 11-21. Ici, un protocole en profondeur sur la façon de modifier l'expression génique dans des cultures organotypiques épidermiques par l'utilisation de retrovirus est fourni.

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Protocol

Le protocole de la peau humaine a été réalisée en conformité avec les directives de l'Université de Californie, Comité d'éthique de la recherche de San Diego. La peau humaine peut être obtenue à partir d'échantillons chirurgicaux jetés ou achetés auprès des banques de la peau (banque de peau est listé dans la table Matériel / Equipement). L'endroit où la peau est dérivée de ou âge du donneur est pas critique pour l'expérience, tant que les protéines de la zone de la membrane basale (collagène / laminine) dans le derme sont pas dégradées.

1. Préparation de dévitalisées derme humain

  1. À la réception de la peau humaine, placer le tissu dans la hotte de culture de tissu à décongeler (~ 3-5 min). Selon la taille de la peau, placez le tissu décongelé dans un tube conique de 50 ml stérile à usage unique ou flacon de 125 ml. La taille typique de la peau à partir de la banque de la peau est de 0,75 pieds carrés.
  2. Remplissez le réservoir plein à 75% avec 4x pénicilline et de streptomycine (stylo / angine) dans PBS 1x. Agiter vigoureusement pendant5 min et éliminer le liquide. Répétez cette étape 3 fois de plus.
  3. Après le dernier lavage, transférer le tissu dans un nouveau tube / bouteille et ajouter 4x frais stylo / streptocoque / PBS à combler 75% du récipient. Incuber ce mélange dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C pendant 2 semaines pour permettre la séparation du derme de l'épiderme.
  4. Dans des conditions stériles, utiliser une pince pour décoller l'épiderme du derme. Le derme est complètement blanc tandis que l'épiderme auront coloration en fonction de la course du donneur (figure 1A). Jeter l'épiderme selon le protocole de l'établissement pour le traitement des tissus humains.
  5. Placez le derme dans un tube ou le flacon et le laver à 4x stylo / angine dilué dans PBS 1x avec une agitation vigoureuse (lavages de 5 min pour 4 fois). Après le dernier lavage, transférer le derme pour un nouveau tube / bouteille dans 4x stylo / angine dilué dans PBS 1x et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir. Derme peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à un an.
    6. 2. modifier génétiquement primaire kératinocytes humains

    REMARQUE: utiliser des cellules de Phoenix amphotropes cultivées en milieu DMEM complet [DMEM + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) + stylo / angine] pour produire des virus pour infecter les kératinocytes humains primaires. Gènes d'encapsidation virale qui codent pour des protéines telles que gag-pol et l'enveloppe sont intégrés de manière stable dans le génome de la cellule Phoenix qui permet la production de virus lorsque transfectée avec un vecteur rétroviral. Phoenix cellules peuvent être transfectées avec un rendement élevé permettant une production élevée de titre viral. Virus produite à partir de cette ligne d'emballage peut également infecter une grande variété de cellules de mammifères y compris l'homme.

    1. Jour 1: Le jour avant la transfection, les cellules de Phoenix de semences dans une plaque à 6 puits à une densité de 800.000 cellules par puits dans des milieux DMEM complet.
    2. Jour 2: Le jour de la transfection, utilisez 3 pg de vecteurs rétroviraux par puits. Aliquote 3 pg de vecteur rétroviral dans un tube de 1,5 ml. Utilisez un mélange de 100 μ; l DMEM plus 6 pi de réactif de transfection pour chaque 3 pg de vecteur. Mélanger 6 ul de réactif de transfection avec 100 ul de DMEM dans un tube de 1,5 ml. (Les vecteurs rétroviraux qui sont utilisés sont listés dans le tableau équipement / matériaux).
      1. Incuber pendant 5 min et ajouter le mélange 106 pi dans le tube pré-aliquoté contenant le 3 pg de vecteur retroviral. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Ajouter l'ensemble de ce mélange goutte à goutte dans chaque puits des cellules de Phoenix.
    3. Jour 3: Le jour après la transfection, retirez le support à partir des cellules de Phoenix et ajouter 2 ml de milieu complet frais DMEM. Le même jour, ensemencer les kératinocytes humains primaires dans des plaques 6 puits à une densité de 75.000 cellules par puits. Maintenir les kératinocytes dans un milieu de sérum de kératinocytes libre (KCSFM) avec des antibiotiques (pénicilline / streptomycine).
      REMARQUE: kératinocytes humains primaires ont été achetés. Les cellules peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs (énumérés dans le tableau Matériel / Equipement).
    4. Jour 4: Haracquises les médias à partir des cellules transfectées de Phoenix, qui contient maintenant des particules virales. Passez les médias à travers un filtre de 0,45 um en utilisant une seringue (pour enlever les cellules contaminantes Phoenix) et placer 2 ml sur les kératinocytes (étalées à 75.000 cellules / puits la veille: voir l'étape 2.3). Ajouter le bromure de hexadiméthrine (5 ug / ml) aux médias pour aider à la médiation du processus d'infection. Les titres viraux sont ~ 1 x 10 7 TU / ml.
      1. Faites tourner les plaques à 6 puits dans une centrifugeuse à 200 xg pendant 1 heure à température ambiante. Après le spin, retirez le support contenant le virus et laver les cellules une fois avec PBS 1x avant d'ajouter KCSFM.
    5. Jour 5: Infect le même lot de kératinocytes de nouveau comme dans l'étape 2.4.
      REMARQUE: Sélectionnez les kératinocytes en utilisant un médicament si il est un marqueur de sélection sur le vecteur rétroviral et d'étendre pour une utilisation dans l'analyse ou des applications telles que les cultures organotypiques aval.

    3. Configuration de cultures de peau organotypiques

    1. Construire leCassette organotypique à partir de matières communes trouvées dans le laboratoire ou les cassettes peut être personnalisé grâce à un atelier de fabrication métallique (figure 2A - F). Pour rendre ces cassettes à partir d'une plaque de culture de tissu de 3,5 cm, utiliser un cautère pour enlever un carré 1.0 cm x 1.0 cm du centre du couvercle d'un plat de 3,5 cm (Figure 2A-B). Pour ce faire, dans des conditions stériles.
      1. Fixez des chevilles carrées au fond de la cassette (couvercle de 3,5 cm plat) en utilisant vernis à ongles transparent (figure 2C). Laisser 5 min pour le vernis à ongles de sécher et de retourner la cassette au cours de sorte qu'il repose sur les chevilles carrées (figure 2D). Placez la cassette dans un plat de 6 cm.
        REMARQUE: Square Pegs peuvent être achetés à partir d'une variété de boutiques d'artisanat.
    2. Préparer un milieu de croissance de kératinocytes (KGM) composé de 66% de DMEM, 22% F12 de Ham, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, 10% de FBS, 2,67 pg / ml adenine, 40 ng / ml d'hydrocortisone, 10 toxine ng / ml de choléra, 4,94 pg / ml d'insuline, 5 pg / ml de transferrine, 1,36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml d'EGF, et 10 ug / ml de chlorhydrate de ciprofloxacine. Filtrez les médias à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
    3. Prenez le derme de la plume 4x / streptocoque + solution de PBS et laver 2 fois dans KGM puis incuber dans KGM à 37 ° C pendant deux jours avant de les utiliser.
    4. Couper le derme à l'aide d'un scalpel à 1,5 cm x 1,5 cm de morceaux de la taille et ensuite placer sur la cassette organotypique. Placez le derme avec la partie supérieure du derme vers le haut. La partie supérieure du derme sera le côté qui vient en contact avec les kératinocytes (figure 1B).
    5. Placez le derme prédécoupées sur le trou carré de la cassette organotypique avec le côté supérieur du derme vers le haut (figure 3A).
    6. Retournez la totalité de la cassette contenant organotypique le derme plus de l'aide de pinces (figure 3B). Décongeler la solution de la matrice extracellulaire sur la glace. Utiliser une aiguille et une seringue pour tirer 100 pi de solution de matrice extracellulaire par cassette. Ajouter 5 gouttes au fond du derme (côté brillant) et secouez légèrement pour assurer une distribution uniforme à travers le derme (figure 3B).
    7. Autoriser 5 min pour la solution de la matrice extra-cellulaire commerciale pour solidifier complètement (figure 3C). Après solidification, utiliser une pince pour retourner la cassette terminée. Ajouter 4 ml de KGM à 6 cm plat.
    8. Placez 0,5-1 millions de kératinocytes génétiquement modifiés sur les cassettes contenant les organotypiques derme (figure 3D).
      1. Trypsiniser les kératinocytes en plaçant 4 ml de trypsine à 0,05% sur plaques de 10 cm pendant 5 minutes et éteindre avec 4 ml de milieu DMEM complet.
      2. Comptez les kératinocytes en utilisant un hémocytomètre puis centrifuger à 200 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules de 0,5 à 1 million (en fonction du nombre de cellules disponibles) dans 90 μl de KGM et placez toutes les cellules sur le derme.
        Remarque: il est important de placer le même nombre de cellules de derme dans la même expérience pour s'assurer que les différences observées dans épaisseur de l'épiderme régénéré est pas due à des différences dans le nombre de cellules de départ. Placer moins de 0,5 millions de cellules sur le derme peut conduire à une mauvaise stratification et de différenciation.
    9. Changer de support KGM sur les cultures organotypiques tous les autres jours. Récolte tissus 1-14 jours après le placement des kératinocytes sur le derme. Stratification complète et la différenciation de l'épiderme survient généralement après 5 jours.

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Representative Results

La première étape dans la génération de la peau humaine organotypique est d'enlever l'épiderme du derme. Le 2 semaines d'incubation de la peau à 37 ° C dans 4 x pen / strep / PBS devrait permettre la séparation du derme de l'épiderme (figure 1A). Si la séparation des épiderme et le derme est difficile puis placez le tissu à 37 ° C en 4x stylo / streptocoque / PBS pendant une semaine et puis essayer de nouveau pelage en utilisant une pince.

Une des clés de la régénération de l'épiderme humain sur derme dévitalisées est de veiller à ce que les kératinocytes sont placés sur le bon côté du derme. Le derme a un haut et un bas. La partie supérieure du derme est le côté qui entre en contact avec les kératinocytes in vivo, ainsi que dans les cultures organotypiques. La partie supérieure du derme peut être différenciée à partir de la partie inférieure du derme due à la brillance du bas (figure 1B). Si kératinocytes sont placés directement sur le fondcôté (brillant) du derme, l'épiderme ne seront pas différencier ou stratifier correctement. Ainsi, il est crucial d'avoir le haut du derme (non glacé) vers le haut dans la cassette organotypique. Le derme peuvent être placés directement sur ​​une cassette organotypique (Figure 2A - F). Cassettes fabriqués à partir de plaques de culture de tissus doivent être stérilisés tandis que les cassettes UV en métaux peuvent être passés à l'autoclave avant le derme étant placé sur. Les kératinocytes génétiquement modifiés peuvent ensuite être placés sur le derme. Les kératinocytes sont initialement immergée dans un liquide, car ils ont été placés sur le derme remises en suspension dans KGM. Après 24 heures, le KGM sera diffusé à travers le derme qui permet aux kératinocytes à être exposés à l'interface air-liquide qui provoque la stratification et la différenciation dans l'épiderme 7 (figure 3).

ARN, protéines, ADN / chromatine, ainsi que des sections de tissu peut être récolté à partir des s organotypiquescultures de parenté qui peuvent tous être utilisés pour une variété d'applications en aval. L'ARN peut être utilisée pour déterminer les différences d'expression génique entre le contrôle et knock-down / tissu surexpression RT-QPCR utilisant, puces à ADN, ou l'ARN-Seq. ADN / chromatine peut être utilisé pour des applications d'ADN ou puce Seq. La peau régénérée peut être monté dans des sections congelées octobre et peut être utilisé pour la coloration immuno-ou coloration hématoxyline et de l'éosine pour évaluer la morphologie des tissus, l'expression de la protéine / le contrôle et la localisation dans les groupes expérimentaux.

Un exemple de ceci est représenté sur la Figure 4 avec la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine d'une culture organotypique de peau typique. Notez que toutes les quatre couches distinctes de l'épiderme sont formées d'une couche spécifique de l'expression des protéines de différenciation liés (figure 4) 11,12,14,15. Ce système peut être utilisé pour déterminer les impacts de la surexpression ou inactivation de gènes différents sur l'épiderme. Figure 5 montre tissu épidermique régénérée qui exprime le contrôle, LACZ ainsi que le tissu surexprimé pour SNAI2. La surexpression de SNAI2 conduit à une inhibition de la différenciation épidermique comme l'a noté le manque de kératine 1 (K1) coloration ainsi que la perte de l'expression de gènes induit la différenciation structurels tels que TGM1 et SPRR1A (figure 5A - C) 13,22. L'épaisseur de l'épiderme de la figure 4 et la figure 5 peut varier dans le même échantillon en raison de l'accumulation de plusieurs cellules dans le milieu du derme par rapport à la périphérie lorsque les cellules ont été initialement placées sur le derme. Ainsi, les sections intermédiaires ont tendance à avoir l'épiderme plus épais que la périphérie a tendance à avoir plus mince. Pour la comparaison directe entre les différents échantillons les mêmes régions d'une section doivent être comparés. Cependant, la coloration pour les marqueurs devrait rester cohérent.

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Figure 1. Préparation du derme de la peau humaine. (A) Après une incubation de la peau humaine à 37 ° C pendant 2 semaines, le derme peut être séparée de l'épiderme. Les forceps sont utilisés pour éplucher l'épiderme (couleur marron) de la derme (blanc). (B) La partie supérieure du derme se distingue du fond par le brillant du tissu. Le sommet du derme (le côté qui va naturellement faire face à l'épiderme in vivo ou lorsque les kératinocytes seront ensemencées) est non brillant. Le fond du derme est brillant. Le tissu est rose en raison d'incubation dans KGM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Génération de cassettes organotypiques. (a) Utiliser un cautère pour enlever un carré 1.0 cm x 1.0 cm du centre du couvercle d'une boîte de 3,5 cm. (B) Retirer la place du centre de la 3,5 cm plat. (C) l'utilisation de vernis à ongles clair pour respecter des chevilles carrées. Autoriser 5 min pour le vernis à ongles à sécher. (D) Retourner le couvercle au-dessus de sorte qu'il est en appui sur les ergots carrés. La cassette est maintenant prêt à être utilisé. (E) l'image d'un métal fabriqué cassette organotypique avec ses dimensions. (F) l'image d'une cassette fabriquée de métal retourné à l'envers pour montrer les piquets de soutien. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Génération de organotypic cultures de peau. (A) Placer le derme avec le haut du derme (côté non brillant) vers le haut sur ​​la cassette organotypique. (B) Retournez la cassette puis ajouter Matrigel sur le côté brillant du derme. (C) Laisser 5 min pour le Matrigel se solidifier puis retournez en arrière sur la cassette. (D) Ajouter kératinocytes génétiquement modifié pour le derme (0,5-1 millions de cellules sont remises en suspension dans 90 ul de KGM). Récolter le tissu 1-14 jours après l'ensemencement des kératinocytes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. hématoxyline et éosine des cultures organotypiques de peau. Régénérée peau humaine contient à la fois l'épiderme et du derme. L'épidermeest est entièrement stratifiée et différenciée avec 4 couches distinctes. Ces couches incluent la couche basale indifférencié et les 3 couches différenciées comprenant couche épineuse, granuleuse et cornée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. coloration par immunofluorescence et une analyse de l'expression du gène de l'épiderme humain génétiquement modifiés. (A) La surexpression de SNAI2 inhibe la différenciation épidermique. La coloration pour les protéines de différenciation kératine 1 (K1) est représenté en vert et des noyaux est marqué en bleu (Hoechst). (B) Analyse RT-QPCR sur les taux d'ARNm de lacZ dans SNAI2 contrôle et surexprimant SNAI2 tissu. Les barres d'erreur = SD, n = 3. (C) l'analyse par RT-qPCR sur l'ARNmles niveaux de différenciation transcriptions KRT1, TGM1 et SPRR1A dans LACZ de contrôle et SNAI2 tissus surexprimant. Les barres d'erreur = SD, n = 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La manipulation génétique dans la peau humaine cultures organotypiques offrent de nombreux avantages à couramment étudié 2D cellules cultivées ainsi que des modèles de souris. Cultures 2D pas les trois dimensions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire interactions trouvés dans les tissus et organes intacts. Des études récentes ont également trouvé d'énormes différences entre les cellules de cancer de la peau en culture 2D et 3D avec les cellules cultivées en 3D montrant beaucoup plus de similitudes d'expression des gènes de la peau humaine tumeurs primaires 16. Cultures de peau organotypiques humains ont également plusieurs avantages par rapport aux modèles de souris. Modèles de souris sont longues et coûteuses à produire ainsi que plusieurs différences notables entre l'humain et la peau de la souris. Ceux-ci comprennent différents taux de renouvellement des tissus ainsi que l'épaisseur de l'épiderme entre murin et épiderme humain 8. Avec les nouvelles technologies émergentes telles que CRISPR-CAS, des gènes spécifiques peuvent être modifiés / muté pour modéliser des maladies de peau humaine en utilisant organotypique cultur de la peaues 23. De plus, les gènes peuvent être délivrés ou renversés dans ces cellules à travers une grande variété de méthodes en plus du transfert de gène retroviral décrit ici. Tant qu'il y est la livraison robuste grâce à l'efficacité de transduction haute ou la sélection des médicaments, la méthode peut être employée. Ces méthodes de livraison comprennent nucléofection de siRNA, lentivirus, le virus adéno-associé, et le virus adéno 11,12,24-26.

Les cultures organotypiques de peau peuvent être modifiées par addition de différents types de cellules dans le système. Par exemple, des fibroblastes humains normaux ou génétiquement modifiées peuvent être ajoutés au niveau du derme dévitalisées pour étudier mésenchymateuses et la diaphonie épithéliale. Les cellules immunitaires peuvent également être ajoutés au derme pour étudier la réponse inflammatoire à des perturbations dans la peau. Une limitation de ce système est que le processus de desquamation qui se produit in vivo ne se produit pas dans des cultures organotypiques. Cela empêche l'utilisation de ces cultures pour le long terme et la plupart des analysesest effectuée entre 1-14 jours après l'ensemencement des cellules de l'épiderme. Pour les longs essais terme, les cultures organotypiques peuvent être greffés sur le dos des souris immunodéprimées 17,27.

La culture organotypique de peau présentée ici est unique en ce qu'il utilise intactes derme humain dévitalisées qui est le substrat naturel de l'épiderme in vivo alors que la plupart des autres systèmes utilisent collagène ou Matrigel que le substrat 28. Configuration des cultures organotypiques de peau utilisant des substrats tels que les résultats de Matrigel dans la stratification plus mince et moins robuste de l'épiderme dans notre expérience. Le derme sous-sol contient des protéines de membrane, y compris la zone de la laminine et du collagène qui permet aux cellules de l'épiderme pour fixer, prolifèrent, se différencient et stratifier 29. Utilisation du derme permet de générer de l'épiderme qui imite leur homologue in vivo. Ainsi, cultures organotypiques de peau peuvent être extrêmement précieux dans l toxicologiques et pharmacologiqueses études dans les cas où les études animales ne sont pas autorisés (industrie cosmétique) 30.

Utilisation derme dévitalisées est également livré avec ses propres inconvénients puisque l'épaisseur du derme entre les différents bailleurs de fonds ou même au sein du même donneur peut varier. Cellules épidermiques cultivées sur derme épais ont tendance à ne pas proliférer et générer autant d'épaisseur de l'épiderme que les cellules cultivées sur le derme plus minces. Ainsi, il est essentiel de choisir l'épaisseur du derme similaires lors de l'établissement des expériences comparant des échantillons multiples. Un autre paramètre critique est d'ensemencer le même nombre de cellules de l'épiderme lorsque l'on compare les différents groupes de façon que les différences observées ne sont pas dues à des différences de nombre initial de cellules ensemencées.

En conclusion, la culture de la peau organotypique peut servir comme une avancée et efficace dans le modèle in vitro pour valider voies moléculaires dans un contexte plus physiologique, ce qui finira par accélérer la compréhension des gènes Mechan réglementaireismes qui sont importants pour la croissance et la différenciation épidermique.

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Acknowledgments

Ce travail a été appuyée par la Société de recherche sur le cancer Scholars Grant américaine (RSG-12-148-01-DDC) et la biologie Award CIRM de base (RB4-05779).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human skin New York Firefighters Skin Bank http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP GIBCO 15140-122
amphotropic phoenix cell lines ATCC CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent Promega E2691
Keratinocyte Media (KCSFM) Life Technologies 17005042
DMEM GIBCO 11995
Ham's F12 Cambrex 12-615F
FBS GIBCO 10437-028
Adenine Sigma A-9795
Cholera Toxin Sigma  C-8052
Hydrocortisone Calbiochem 3896
Insulin Sigma I-1882
EGF Invitrogen 13247-051
Transferrin  Sigma T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride Serologicals 89-001-1
cautery Bovie Medical Corporation AA01
Matrigel Corning 354234
Keratin 1 antibody Biolegend PRB-149P
square pegs Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes ATCC PCS-200-010
human neonatal keratinocytes Cell Applications 102K-05n
MSCV retroviral vector Clontech 634401
LZRS retroviral vector Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector Oligoengine VEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide  Sigma H9268-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain
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Li, J., Sen, G. L. Generation of… More

Li, J., Sen, G. L. Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis. J. Vis. Exp. (106), e53280, doi:10.3791/53280 (2015).

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