Abstract
Organotypischen Kulturen erlauben die Rekonstruktion eines 3D-Umgebung kritisch für Zell-Zell-Kontakt und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, die die Funktion und Physiologie ihrer in vivo Gewebegegen nachahmt. Dies wird durch organotypische Hautkulturen, die treu rekapituliert die epidermale Differenzierung und Stratifizierung Programm veranschaulicht. Primären humanen epidermalen Keratinozyten sind genetisch manipulierbar durch Retroviren, wo Gene lassen sich überexprimiert oder abgerissen werden. Diese genetisch veränderte Keratinozyten kann dann verwendet werden, um die menschliche Epidermis in organotypischen Hautkulturen Bereitstellung einer leistungsfähiges Modell zu genetischen Signalwege zu untersuchen aufprall epidermalen Wachstums, Differenzierung und Fortschreiten der Krankheit zu regenerieren. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben Verfahren zur devitalized menschlichen Dermis vorzubereiten sowie genetisch zu manipulieren primären humanen Keratinozyten, um organotypischen Hautkulturen zu erzeugen. Regeneriert die menschliche Haut kann in downstr verwendet werdeneam Anwendungen wie Genexpressionsanalysen, Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung. So wird Generation dieser gentechnisch veränderten organotypischen Hautkulturen der Bestimmung von Genen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Haut sind zu ermöglichen.
Introduction
Die menschliche Epidermis ist eine geschichtete Epithel, die zu der darunter liegenden Dermis durch eine extrazelluläre Matrix, wie die Basalmembran Zone Epidermis nicht nur als Barriere, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern, sondern auch als erste Verteidigungslinie, um die zu schützen dient bekannt verbindet Körper vor fremden und toxische Stoffe 1. Die basale Schicht, die der tiefsten Schicht der Epidermis ist, enthält die epidermalen Stammzellen und Vorläuferzellen, die zu dem differenzierten Nachkommen, die den Rest der Oberhaut 2 zu bilden ergeben. Der epidermale Stammzellen differenzieren sie sich nach oben zu wandern, um die erste Schicht von differenzierten Zellen wie spinosus Schicht 3 bekannt ist. Im Stratum spinosum, drehen Zellen auf die Expression der Keratine 1 und 10, die dann liefern die Kraft, körperliche Belastung für den differenzierten Schichten der Epidermis zu widerstehen. Da die Dornfortsätze Schicht-Zellen weiter zu differenzieren, nach oben in der Epidermis, um sie zu bewegenm die Körnerschicht, die durch die Bildung von Keratohyalin und lamellarem Granulate sowie Strukturproteine, die unterhalb der Plasmamembran montiert sind charakterisiert ist. Da die Zellen in dem Differenzierungsprozess fortzufahren, die Proteine unter der Plasmamembran sind Quer miteinander verbunden, während die plättchenförmigen Körnchen werden aus den Zellen extrudiert, um eine lipidreiche Barriere genannt Stratum corneum 4 bilden.
Erkrankungen, die Störungen der epidermalen Wachstums und der Differenzierung Schlag ~ 20% der Bevölkerung 5 einzubeziehen. Somit Verständnis der Mechanismen bei diesem Verfahren ist von großer Bedeutung. Da Manifestation viele dieser Krankheiten abhängig Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt haben organotypischen Kulturen, in denen die menschliche Epidermis in einer 3D Umgebung rekonstituiert 6-10 erstellt. Diese Verfahren beinhalten typischerweise die Verwendung von primären oder transformierte Keratinozyten auf der extrazellulären Matrix ausgesät wie devitalisierten menschlichenDermis, Matrigel oder Kollagen.
Gen-Regulationsmechanismen, die in den epidermalen Wachstums und der Differenzierung wichtig zu verstehen, können Keratinozyten genetisch durch retrovirale Vektoren manipuliert den Zuschlag oder überexprimieren Gene in 2D-Kultur und dann in 3D rekonstituiert. Diese Methoden sind sehr häufig benutzt worden, um Gene in epidermalen Stammzellen und Progenitorzellen Selbsterneuerung und Differenzierung sowie Progression Neoplasie 11-21 beteiligt charakterisieren. Hier eine eingehende Protokoll, wie die Genexpression in der Epidermis organotypischen Kulturen durch den Einsatz von Retroviren zu ändern ist.
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Protocol
Die menschliche Haut-Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of California, Forschungsethikkommission von San Diego durchgeführt. Die menschliche Haut kann aus gebrauchten chirurgischen Proben erhalten oder von Hautbanken kauften (Hautbank in der Material / Ausrüstung Tabelle aufgeführt sind) werden. Der Ort, wo die Haut vor oder Alter des Spenders abgeleitet ist nicht kritisch für das Experiment, solange die Basalmembran-Proteinen (Kollagen / Laminin) in der Dermis nicht verschlechtert werden.
1. Herstellung von devitalisierten Menschen Dermis
- Auf der menschlichen Haut empfangen, legen Sie das Gewebe in der Gewebekultur Haube zu tauen (~ 3-5 min). Abhängig von der Größe der Haut die aufgetauten Gewebe in einem sterilen Wegwerf 50 ml konischen Röhrchen oder 125 ml Flasche. Die typische Größe der Haut von der Haut Bank 0,75 Quadratmetern.
- Füllen Sie den Behälter zu 75% voll mit 4x Penicillin und Streptomycin (Pen / Strep) in 1x PBS. Kräftig schütteln5 Minuten und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 weitere Male.
- Nach dem letzten Wasch, übertragen das Gewebe in ein neues Röhrchen / Flasche und fügen frische 4x Pen / Strep / PBS auf 75% des Behälters zu füllen. Inkubieren dieser Mischung in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für 2 Wochen, um die Trennung der Dermis von der Epidermis zu ermöglichen.
- Unter sterilen Bedingungen verwenden Pinzette von der Dermis abziehen die Epidermis. Die Dermis vollständig weiß ist, während die Epidermis wird Färbung in Abhängigkeit von der Rasse des Spenders (1A) haben. Entsorgen Sie die Haut gemäß dem Protokoll des Instituts für den Umgang mit menschlichem Gewebe.
- Legen Sie die Dermis in einer Tube oder Flasche und waschen Sie ihn in 4x Pen / Strep in 1x PBS unter kräftigem Schütteln verdünnt (5 min wäscht 4 mal). Nach dem letzten Wasch, übertragen Sie die Dermis in ein neues Röhrchen / Flasche in 4x Pen / Strep in 1x PBS verdünnt und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Dermis können bei 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. 2. genetische Modifizierung primären humanen Keratinozyten
- Tag 1: Am Tag vor der Transfektion seed Phoenix-Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 800.000 Zellen pro Vertiefung in komplettem DMEM Medium.
- Tag 2: Tag der Transfektion, verwenden Sie 3 ug von retroviralen Vektoren pro Vertiefung. Aliquot 3 ug retroviralen Vektor in einem 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie eine Mischung von 100 μ; l DMEM plus 6 ul Transfektionsreagenz für jeweils 3 ug Vektor. MIX 6 ul Transfektionsreagenz mit 100 ul DMEM in einem 1,5-ml-Röhrchen. (Die retroviralen Vektoren, die verwendet werden, sind in der Geräte / Materialien Tabelle aufgeführt).
- Inkubation für 5 min und fügen Sie die 106 & mgr; l-Gemisch in die Pre-aliquotierten Röhrchen mit dem 3 ug retroviralen Vektor. Mischen und Inkubation bei RT für 30 min. Fügen Sie diese gesamte Mischung tropfenweise zu jeder Vertiefung der Phoenix-Zellen.
- 3. Tag: Der Tag nach der Transfektion, entfernen Sie die Medien aus den Phoenix-Zellen und 2 ml frisches vollständiges DMEM-Medium. Am selben Tag, Samen primärer menschlicher Keratinozyten in 6-Well-Platten in einer Dichte von 75.000 Zellen pro Vertiefung. Pflegen Sie die Keratinozyten in einer Keratinozyten-serumfreiem Medium (KCSFM) mit Antibiotika (Pen / Strep).
HINWEIS: Primäre menschliche Keratinozyten wurden gekauft. Zellen können aus einer Vielzahl von Anbietern (in der Material / Ausrüstung Tabelle aufgeführt) erworben werden. - Tag 4: HarWeste das Medium aus den transfizierten phoenix-Zellen, die jetzt enthält Viruspartikel. Führen Sie das Material durch ein 0,45 um-Filter mit einer Spritze (um alle verunreinigenden phoenix Zellen zu entfernen) und legen Sie 2 ml auf die Keratinozyten (bei 75.000 Zellen / gut am Vortag: siehe Schritt 2.3). In Hexadimethrinbromid (5 ug / ml) zu den Medien zu helfen, vermitteln die Infektionsprozess. Virustiter sind ~ 1 x 10 & sup7; TU / ml.
- Drehen die Platten mit 6 Vertiefungen in einer Zentrifuge bei 200 × g für 1 h bei RT. Nach dem Spin, entfernen Sie die Medien-Virus enthält, und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS vor der Zugabe KCSFM.
- Tag 5: Infizieren derselben Charge von Keratinozyten wieder wie in Schritt 2.4.
HINWEIS: Wählen Sie die Keratinozyten mit einem Medikament, wenn es einen selektierbaren Marker auf dem retroviralen Vektor und erweitern für den Einsatz in nachgelagerten Analyse oder Anwendungen wie organotypischen Kulturen. - Bauen Sie dieorganotypischen Kassette aus gängigen Materialien im Labor festgestellt oder die Kassetten können benutzerdefinierte durch einen Metall Stanzerei gemacht werden (2A - F). Um diese Kassetten von einem 3,5 cm-Gewebekulturplatte zu machen, verwenden Sie ein Brenneisen, ein 1,0 cm x 1,0 cm im Quadrat aus der Mitte des Deckels aus einem 3,5 cm-Schale (2A-B) zu entfernen. Tun Sie dies unter sterilen Bedingungen.
- Bringen quadratischen Zapfen an der Unterseite der Kassette (Deckel 3,5 cm Schale) mit klarem Nagellack (2C). Lassen Sie 5 Minuten für den Nagellack zu trocknen und drehen Sie die Kassette auf, so dass es auf den quadratischen Zapfen (2D) ruht. Setzen Sie die Kassette in einen 6 cm Schale.
HINWEIS: Square Pegs können aus einer Vielzahl von Kunsthandwerk-Läden gekauft werden.
- Bringen quadratischen Zapfen an der Unterseite der Kassette (Deckel 3,5 cm Schale) mit klarem Nagellack (2C). Lassen Sie 5 Minuten für den Nagellack zu trocknen und drehen Sie die Kassette auf, so dass es auf den quadratischen Zapfen (2D) ruht. Setzen Sie die Kassette in einen 6 cm Schale.
- Vorbereitung Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) von 66% DMEM, 22% Ham-F12, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10% FBS, 2,67 ug / ml Adenin, 40 n bestehtg / ml Hydrocortison, 10 ng / ml Cholera-Toxin, 4,94 & mgr; g / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, 1,36 ng / ml Triiod-L-thyronin, 10 ng / ml EGF und 10 ug / ml Ciprofloxacin-Hydrochlorid. Filtern Sie die Medien durch ein 0,22 um-Filter und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Nehmen die Dermis aus dem 4x Pen / Strep + PBS-Lösung und wäscht 2 mal in KGM und dann in KGM bei 37 ° C für zwei Tage vor der Verwendung.
- Schneiden Sie die Lederhaut mit einem Skalpell bis 1,5 cm x 1,5 cm große Stücke schneiden und dann auf den organotypischen Kassette zu platzieren. Platzieren der Dermis mit der Oberseite der Dermis nach oben zeigt. Der obere Teil der Dermis wird die Seite, die in Kontakt mit den Keratinozyten (1B) kommt.
- Legen Sie die vorgeschnittenen Lederhaut auf die quadratische Öffnung des organotypischen Kassette mit der Oberseite der Dermis nach oben (3A).
- Klappen Sie den gesamten organotypischen Kassette, die die Lederhaut mehr als mit einer Pinzette (3B). Tauen die extrazelluläre Matrix-Lösung auf Eis. Verwenden Sie eine Nadel und Spritze zu ziehen 100 ul der extrazellulären Matrix-Lösung pro Kassette. 5 Tropfen auf den Boden der Dermis (glänzende Seite) und schütteln Sie leicht, um eine gleichmäßige Verteilung in der gesamten Dermis (3B) zu gewährleisten.
- Lassen Sie 5 Minuten für die kommerzielle extrazellulären Matrix-Lösung vollständig zu verfestigen (3C). Nach dem Erstarren verwenden Pinzette, um die Kassette wieder umdrehen. 4 ml KGM an die 6 cm Schale.
- Platzieren ,5-1.000.000 gentechnisch veränderten Keratinozyten auf die organotypische Kassetten, die die Lederhaut (Figur 3D).
- Trypsinize Keratinozyten, indem 4 ml von 0,05% Trypsin auf 10 cm-Platten für 5 min und schrecke mit 4 ml vollständigem DMEM-Medium.
- Zählen Sie die Keratinozyten mit einer Zählkammer und dann drehen bei 200 xg für 5 min nach unten. Resuspendieren 0.5-1 Millionen Zellen (in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Zellen) in 90 μl KGM und legen Sie alle Zellen auf der Dermis.
Hinweis: Es ist wichtig, dieselbe Anzahl von Zellen auf die Lederhaut in dem gleichen Experiment zu platzieren, um sicherzustellen, daß die Unterschiede in der Dicke der regenerierten Epidermis gesehen nicht aufgrund von Unterschieden im Ausgangszellzahl. Platzieren von weniger als 0,5 Millionen Zellen auf Dermis kann zu schlechter Schichtung und Differenzierung führen.
- Ändern KGM Medien auf die organotypische Kulturen jeden zweiten Tag. Erntegewebe 1-14 Tage nach der Platzierung der Keratinozyten auf der Dermis. Voll Schichtung und Differenzierung der Epidermis tritt in der Regel nach Tag 5.
HINWEIS: Verwenden Sie amphotrope phoenix Zellen in vollständigem DMEM media [DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) + Pen / Strep] gewachsen, um Viren zu produzieren, um primäre menschliche Keratinozyten zu infizieren. Virale Verpackungs Gene, die Proteine wie gag-pol und Umschlag kodieren, stabil in das Zellgenom Phoenix die für die Virusproduktion ermöglicht, wenn sie mit einem retroviralen Vektor transfiziert integriert. Phoenix-Zellen mit hoher Effizienz unter Berücksichtigung hoher Virustiter Produktions transfiziert werden. Virus von dieser Verpackungslinie produziert kann auch infizieren eine Vielzahl von Säugetierzellen einschließlich menschlicher.
3. Einrichten Organotypische Hautkulturen
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Representative Results
Der erste Schritt bei der Erzeugung von organotypischen menschliche Haut, um die Epidermis von der Dermis zu entfernen. Der zweiwöchigen Inkubation der Haut bei 37 ° C in 4 x Pen / Strep / PBS sollte die Trennung der Dermis von der Epidermis (1A) zu erlauben. Wenn die Trennung der Epidermis und Dermis ist schwierig, dann das Gewebe bei 37 ° C in 4x Pen / Strep / PBS für eine Woche und dann noch einmal versuchen Peeling mit einer Pinzette.
Einer der Schlüssel zum Regenerieren menschlichen Epidermis devitalisierten Dermis ist es, sicherzustellen, dass die Keratinozyten auf der richtigen Seite der Dermis platziert. Die Dermis weist eine Oberseite und eine Unterseite. Der obere Teil der Dermis ist die Seite, die in Kontakt mit den Keratinozyten in vivo als auch in organotypischen Kulturen kommt. Der obere Teil der Dermis von der Unterseite der Dermis durch den Glanz der Unterseite (1B) unterschieden werden. Wenn Keratinozyten werden direkt auf den Boden gelegtSeite (glänzend) der Dermis, wird die Oberhaut nicht zu differenzieren oder nicht richtig zu schichten. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um die Oberseite der Dermis (nicht glänzende) nach oben in der organotypischen Kassette haben. Die Dermis kann direkt auf einer organotypischen Kassette (- F 2A) angeordnet werden. Kassetten aus Gewebekulturplatten sollten UV sterilisiert werden, während Metall gefertigt Kassetten können autoklaviert werden vor der Dermis auf platziert. Die genetisch modifizierten Keratinozyten kann dann auf die Lederhaut gesetzt werden. Die Keratinozyten werden zunächst in Flüssigkeit eingetaucht ist, da sie auf der Lederhaut in KGM resuspendiert in Verkehr gebracht wurden. Nach 24 h wurde die KGM wird durch die Dermis, die die Keratinozyten, um die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die Schichtung und Differenzierung in der Epidermis 7 (Figur 3) bewirkt, ausgesetzt werden können diffundiert sind.
RNA kann Protein, DNA / Chromatin sowie Gewebeschnitte von der organotypischen s geerntetkin Kulturen, die alle für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann. RNA kann verwendet werden, um die Genexpression Unterschiede zwischen Kontroll- und Zuschlags / Verwendung von RT-qPCR, Mikroarrays oder RNA-Seq-Überexpression Gewebe zu bestimmen. DNA / Chromatin kann DNA oder Chip-Seq-Anwendungen verwendet werden. Das regenerierte Haut kann in OCT montiert und Gefrierschnitten für Immunfärbung oder Hämatoxylin und Eosin-Färbung verwendet werden, um Gewebemorphologie, Protein-Expression / Lokalisierung in Kontroll- und Versuchsgruppen zu bewerten.
Ein Beispiel hierfür ist in Figur 4 mit dem Hämatoxylin-Eosin-Färbung einer typischen organotypischen Hautkultur gezeigt. Beachte, dass alle vier verschiedenen Schichten der Epidermis mit schichtspezifischen Expression von Differenzierungs verwandten Proteine (Figur 4) 11,12,14,15 gebildet. Dieses System kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Überexpression oder Knockdown von verschiedenen Genen auf der Epidermis zu bestimmen, Fig. 5 zeigt regenerierten epidermale Gewebe, das Steuer, LACZ sowie Gewebe für SNAI2 überexprimiert ausdrückt. Überexpression von SNAI2 führte zu einer Hemmung der epidermalen Differenzierung wie durch das Fehlen von Keratin 1 (K1) Färbung als auch Verlust der Expression der Differenzierung induzierten strukturellen Genen, wie TGM1 und SPRR1A (5A - C) bemerkt 13,22. Die in 4 und 5 gezeigt Epidermisdicke kann innerhalb der gleichen Probe durch mehrere Zellen, der sich in der Mitte der Dermis gegenüber dem Umfang, wenn die Zellen zunächst auf der Dermis platziert variieren. So neigen die mittleren Abschnitte, um dickere Epidermis haben, während die Peripherie tendenziell dünner zu haben. Zum direkten Vergleich zwischen unterschiedlichen Proben die gleichen Regionen eines Abschnitts sollte verglichen werden. Jedoch sollte die Färbung für die Marker konsistent bleiben.
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Figur 1. Herstellung der Dermis aus der menschlichen Haut. (A) Nach der Inkubation der menschlichen Haut bei 37 ° C für 2 Wochen können die Dermis von der Epidermis zu trennen. Pinzette verwendet, um die Epidermis (braun gefärbt) von der Dermis (weiß) zu schälen. (B) Die Oberseite der Dermis von der Unterseite durch den Glanz des Gewebes zu unterscheiden. Der obere Teil der Dermis (die Seite, die natürlicherweise gegen wird die Epidermis in vivo oder in denen die Keratinozyten werden ausgesät werden) nicht-glänzend. Die Unterseite der Dermis ist glänzend. Das Gewebe ist rosa durch Inkubation in KGM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
FBBILDUNG 2. Erzeugung von organotypischen Kassetten. (A) mit einem Brenneisen, ein 1,0 cm x 1,0 cm im Quadrat aus der Mitte des Deckels aus einem 3,5 cm-Schale zu entfernen. (B) Entfernen Sie den Platz von der Mitte des 3,5-cm-Schale. (C) Mit klaren Nagellack auf quadratische Pflöcke halten. Lassen Sie 5 Minuten für die Nagellack, um zu trocknen. (D) Klappen Sie den Deckel über, so dass es auf den quadratischen Zapfen ruht. Die Kassette kann nun verwendet werden. (E) Bild von einem Metall organotypischen Kassette mit seinen Abmessungen. (F) Bild von einem Metall-Kassette umgedreht auf den Kopf, um die Tragzapfen zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Generation organotypic Hautkulturen. (A) Legen Sie die Dermis mit der Oberseite der Lederhaut (nicht glänzende Seite) nach oben auf den organotypischen Kassette. (B) Drehen Sie die Kassette auf und fügen Matrigel auf die glänzende Seite der Lederhaut. (C) Lassen Sie 5 Minuten für die Matrigel zu verfestigen und dann drehen Sie die Kassette wieder um. (D) genetisch in die Dermis (0,5-1 Millionen Zellen werden in 90 & mgr; l resuspendiert KGM) modifiziert Keratinozyten hinzufügen. Ernten Sie die Gewebe 1-14 Tage nach der Aussaat der Keratinozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Hämatoxylin und Eosin-Färbung von organotypischen Hautkulturen. Regenerierte menschliche Haut enthält sowohl die Epidermis und Dermis. Die Oberhautist voll geschichteten und differenziert mit 4 verschiedenen Schichten. Diese Schichten sind die undifferenzierten basalen Schicht und die 3 differenzierten Schichten, Stratum spinosum, granulosum und corneum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5. Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsanalyse von gentechnisch veränderten menschlichen Epidermis. (A) Die Überexpression von SNAI2 hemmt epidermaler Differenzierung. Färbung zur Differenzierung Protein Keratin 1 (K1) ist in grün und Kerne gezeigt wird blau (Hoechst) markiert. (B) RT-qPCR Analyse der mRNA-Spiegel von SNAI2 in Steuer LACZ und SNAI2 überexprimierenden Gewebe. Fehlerbalken = SD, n = 3 (C) RT-qPCR-Analyse auf der mRNAEbenen der Differenzierung Transkripte KRT1, TGM1 und SPRR1A in Steuer LACZ und SNAI2 überexprimierenden Gewebe. Fehlerbalken = SD, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Genmanipulation in der menschlichen Haut organotypischen Kulturen bieten viele Vorteile häufig gelernten 2D kultivierten Zellen als auch Mausmodellen. 2D Kulturen fehlen die drei Zell-Zell und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen dimensional in intakten Geweben und Organen gefunden. Jüngste Studien haben auch festgestellt, enorme Unterschiede zwischen 2D- und 3D-kultivierten Hautkrebszellen mit den 3D-kultivierten Zellen, die viel mehr Genexpression Ähnlichkeiten mit primären humanen Tumoren der Haut 16. Menschen organotypischen Hautkulturen haben auch einige Vorteile gegenüber Maus-Modellen. Mausmodelle sind zeitaufwendig und teuer sowie einige bemerkenswerte Unterschiede zwischen der menschlichen und Maus-Haut zu erzeugen. Dazu gehören verschiedene Gewebefluktuationsraten sowie die Dicke der Epidermis zwischen murinen und humanen Epidermis 8. Mit neuen Technologien Schwellenländern wie CRISPR-CAS, können bestimmte Gene verändert werden / mutierte menschliche Hauterkrankungen mit organotypischen Haut cultur zu modellierenn 23. Ferner können Gene geliefert bzw. abgerissen in diesen Zellen durch eine große Vielzahl von Verfahren Neben den hier beschriebenen retroviralen Gentransfer werden. Solange es ist robust Zufuhr durch hohe Transduktionseffizienz oder Medikamentenauswahl, kann das Verfahren eingesetzt werden. Diese Versandarten sind Nukleofektion von siRNAs, lentivirale, adenoassoziierten Virus und Adeno-Virus 11,12,24-26.
Die organotypischen Haut kann durch Zugabe von verschiedenen Zelltypen an das System angepasst werden. Zum Beispiel können normale oder genetisch veränderte menschliche Fibroblasten der Dermis devitalisierten hinzugefügt werden, um mesenchymalen und epithelialen Übersprechen zu studieren. Immunzellen können auch zur Dermis zugegeben werden, um die Entzündungsreaktion auf Störungen in der Haut zu untersuchen. Eine Beschränkung des Systems ist, dass der Prozess, der in der Abschuppung vivo tritt nicht in organotypischen Kulturen auftreten. Dies verhindert die Verwendung dieser Kulturen zur Langzeitanalyse und die meistenzwischen 1-14 Tage nach der Aussaat der epidermalen Zellen durchgeführt. Für längerfristige Untersuchungen, können die organotypische Kulturen auf den Rücken der immungeschwächten Mäusen 17,27 aufgepfropft werden.
Die Haut organotypische Kultur präsentierten, dass sie intakt devitalized menschlichen Dermis, die das natürliche Substrat der Epidermis ist in vivo während die meisten anderen Systeme verwenden Kollagen oder Matrigel als Substrat 28 verwendet einzigartig. Setup von organotypischen Hautkulturen unter Verwendung von Substraten wie Matrigel Ergebnisse in dünner und weniger robust Schichtung der Epidermis in unserer Erfahrung. Die Dermis enthält Basalmembran-Proteinen, einschließlich Laminin und Kollagen, die epidermalen Zellen zu befestigen, zu proliferieren, differenzieren und zu schichten 29 erlaubt. Verwendung von Lederhaut ermöglicht eine Generation von Epidermis, die ihre in vivo Gegen nachahmt. Somit kann organotypischen Hautkulturen äußerst wertvoll in der toxikologischen und pharmakologischen s seinTUDIEN in Fällen, in denen Tierversuche sind nicht zulässig (Kosmetikindustrie) 30.
Verwendung devitalisierten Dermis kommt auch mit seinen eigenen Nachteile, da die Dicke der Dermis zwischen verschiedenen Spendern oder sogar innerhalb des gleichen Spenders kann variieren. Epidermalen Zellen auf dicken Lederhaut aufgewachsen sind in der Regel nicht vermehren und erzeugen so dick wie der Epidermis-Zellen auf dünner Lederhaut gewachsen. Daher ist es wichtig, ähnliche Dicke Dermis wählen Sie bei der Einrichtung der Experimente Vergleich mehrerer Proben. Ein weiterer kritischer Parameter ist, um den gleichen Teil der Epidermiszellen Saatgut beim Vergleich verschiedener Gruppen, so daß die Unterschiede gesehen ist aufgrund der Unterschiede in der anfänglichen Anzahl von Zellen ausgesät.
Abschließend kann der organotypischen Hautkultur als fortschrittliche und effiziente in vitro-Modell für die Validierung von molekularen Signalwege in einer physiologischen Kontext, die letztlich das Verständnis genregulatorischen mechan beschleunigen dienennismen, die der epidermalen Wachstums und der Differenzierung von Bedeutung sind.
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Acknowledgments
Diese Arbeit war supportedby der American Cancer Society Forschung Gelehrte Grant (RSG-12-148-01-DDC) und dem CIRM Grund Biologie Award (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
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