Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा माउस स्तन ट्यूमर मॉडल में फेफड़ों मेटास्टेसिस का मूल्यांकन

Published: January 29, 2016 doi: 10.3791/53329
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Medical University of South Carolina, 2FirstString Research, Inc.

Summary

इस प्रोटोकॉल माउस फेफड़े के ऊतकों के भीतर मेटास्टेसिस का प्रतिनिधित्व कर ट्यूमर सेल विशिष्ट mRNA पता लगाने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी पीसीआर) का उपयोग करने के लिए कैसे करें।

Abstract

Metastatic रोग दूर के एक अंग के लिए प्राथमिक कैंसर साइट से घातक ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार को और कैंसर जुड़े मौत 1 का प्राथमिक कारण है। मेटास्टेटिक प्रसार के आम साइटों फेफड़े, लिम्फ नोड, मस्तिष्क, और हड्डी 2 शामिल हैं। मेटास्टेसिस ड्राइव तंत्र है कि कैंसर अनुसंधान के तीव्र क्षेत्र हैं। मेटास्टेसिस के दूर साइटों कैंसर अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है में नतीजतन, प्रभावी assays के मेटास्टेटिक बोझ को मापने के लिए। स्तन ट्यूमर मॉडल में फेफड़ों मेटास्टेसिस का मूल्यांकन आम तौर पर विच्छेदन के बाद फेफड़े के ऊतकों के सकल गुणात्मक अवलोकन द्वारा किया जाता है। मेटास्टेसिस के मूल्यांकन के मात्रात्मक तरीकों वर्तमान में पूर्व vivo करने और उपयोगकर्ता परिभाषित मानकों की आवश्यकता है कि vivo इमेजिंग तकनीक पर आधारित में सीमित कर रहे हैं। इन तकनीकों के कई बल्कि सेलुलर स्तर 3-6 से पूरे जीव के स्तर पर हैं। बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग नए तरीकों इमेजिंग METAS मूल्यांकन करने में सक्षम हैं, यद्यपिसेलुलर स्तर 7 बजे tasis, इन बेहद सुरुचिपूर्ण प्रक्रियाओं प्रसार के तंत्र के बजाय मेटास्टेटिक बोझ से मात्रात्मक मूल्यांकन का मूल्यांकन करने के लिए अधिक अनुकूल हैं। इधर, मात्रात्मक मेटास्टेसिस का आकलन करने के लिए एक सरल इन विट्रो विधि प्रस्तुत किया है। मात्रात्मक वास्तविक समय का उपयोग करते हुए पीसीआर (क्यूआरटी पीसीआर), ट्यूमर सेल विशिष्ट mRNA माउस फेफड़े के ऊतकों के भीतर का पता लगाया जा सकता है।

Introduction

क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण ट्यूमर मेटास्टेसिस का आकलन करने के लिए एक विधि के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इस विधि मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने में रुचि रखते हैं, लेकिन इस तरह के vivo इमेजिंग उपकरण या एक प्रतिदीप्ति सक्षम त्रिविमदर्शी के रूप में विशिष्ट उपकरणों के लिए उपयोग नहीं हो सकता है कि उपयोगकर्ताओं के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है। आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों की चर्चा क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण एक अलग रूप में या मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने के लिए एक साथी की विधि के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे के लिए एक प्रदर्शन के बाद प्रस्तुत किया है। यह प्रक्रिया मेटास्टेटिक बोझ का एक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करने की क्षमता है।

एक stereomicroscope के तहत फेफड़ों के दृश्य के साथ ही hematoxylin और eosin द्वारा पीछा धारावाहिक सेक्शनिंग सहित सकल विश्लेषण का मानक तरीकों, फेफड़े के ऊतकों की (एच एंड ई) धुंधला, मात्रात्मक हैं, लेकिन 2-5 की गिनती के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित मानकों पर काफी भरोसा है। एक stereomicroscope का उपयोग पूरे फेफड़ों का मूल्यांकन, केवल बड़े सतह मेटास्टेसिस visi हैंble और विश्लेषण एक मेटास्टेटिक घाव का गठन निर्धारित करने के लिए फेफड़ों शारीरिक संरचना का उचित ज्ञान है अन्वेषक की आवश्यकता है। ऐसे GFP और उचित / उत्तेजना उत्सर्जन Maxima (GFP के लिए उदाहरण के पास 470/510 एनएम) के साथ एक प्रकाश घन होता है कि एक stereomicroscope के उपयोग के रूप में एक मार्कर के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग इस प्रक्रिया में सहायता करता है, लेकिन केवल सतह ट्यूमर पिंड का पता लगता है । इसके अतिरिक्त, GFP के रूप में एक ही मापदंड के तहत दिखाई दे रहा है, जो रक्त संदूषण से प्रतिदीप्ति, संभव मेटास्टेटिक घावों की झूठी पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

फेफड़ों मेटास्टेसिस कल्पना करने के लिए एच एंड ई धुंधला द्वारा पीछा फेफड़ों की सेक्शनिंग micrometastases और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ सहित अन्य सूक्ष्म प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है, लेकिन अक्सर आयल एम्बेड, सेक्शनिंग, और धुंधला प्रक्रियाओं के लिए पूरे फेफड़े के ऊतकों के उपयोग की आवश्यकता है। इसलिए, नीचे की ओर प्रक्रियाओं इस metho निम्नलिखित आदर्श नहीं हैंघ। Quantifiable हालांकि, इस प्रक्रिया के विश्लेषण के फेफड़ों की पूरी 3D संरचना के लिए खातों कि यह सुनिश्चित करने के लिए पशु प्रति दाग फेफड़ों वर्गों की एक बड़ी संख्या का मूल्यांकन करने के अन्वेषक की आवश्यकता है। नतीजतन, परीक्षा की इस प्रकार की त्रुटि की गिनती करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, समय लेने वाली है, और विश्लेषण अन्वेषक विवेक पर निर्भर करता है।

(एमआरआई, पीईटी, SPECT उदाहरण के लिए) वर्तमान में प्रदर्शन या प्रयोगात्मक कृंतक मॉडल 8 में जैविक प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं vivo इमेजिंग तकनीक में कई। में विवो bioluminescent इमेजिंग मेटास्टेसिस 9 की सकल दृश्य प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल एक आम तरीका है। इस तकनीक को आम तौर पर होने के कारण ट्यूमर सेल आरोपण के बाद स्तन ग्रंथि और सहज मेटास्टेसिस पर फेफड़ों की तरह विशिष्ट अंगों में रहते हैं कि एक luciferase प्रतिक्रिया तत्व शामिल करने के लिए इंजीनियर हैं जो ट्यूमर कोशिकाओं, के संचय के लिए luciferase संवाददाता गतिविधि की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जाता है 1Luciferase संवाददाता गतिविधि के 0। विज़ुअलाइज़ेशन luciferin सब्सट्रेट (डी luciferin) की उपस्थिति से प्रेरित है। Luciferase bioluminescence पैदा oxyluciferin करने के लिए डी luciferin की ऑक्सीडेटिव डिकार्बोजाइलेशन उत्प्रेरित। सूचनात्मक, वहीं इस विधि सब्सट्रेट स्थिरता (यानी कम आधा जीवन), यह प्रायोगिक पशुओं के लिए दिया जाता है पर निर्भर करता है जो सब्सट्रेट की पर्याप्त वितरण, और पता लगाने के 9 की कम संवेदनशीलता सहित कई कारकों द्वारा सीमित है। इस तकनीक के लिए एक मुख्य योग्यता यह गैर आक्रामक है जीवित पशुओं पर किया जा सकता है, और सामान्य रूप से विच्छेदन 9,10 पर काटा गया है नहीं हो सकता है कि कई अंगों में ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

Vivo इमेजिंग तकनीकों में से एक सकारात्मक पहलू फेफड़े के ऊतकों आयल एम्बेडिंग की तरह माध्यमिक प्रक्रियाओं के लिए अनुमति देने के लिए अबाधित है या यहाँ के रूप में प्रस्तुत किया है, क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण है। हालांकि, क्यूआरटी पीसीआर theoretica है क्योंकिlly का पता लगाने के लिए एक और अधिक संवेदनशील उपाय, सकल मूल्यांकन के फेफड़ों में मौजूद ट्यूमर कोशिकाओं की कम संख्या का खुलासा नहीं कर सकता है। उपयोगी है, जबकि ऊपर वर्णित इमेजिंग तकनीक प्रतिस्थापित किया जा सकता है या वर्तमान में वर्णित क्यूआरटी पीसीआर विधि के साथ पूरक। क्यूआरटी पीसीआर एक फेफड़ों के भीतर ट्यूमर व्युत्पन्न mRNA का एक संवेदनशील उपाय प्रदान करने की क्षमता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल के दिशा-निर्देशों और दक्षिण कैरोलिना (MUSC) और उसके संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के चिकित्सा विश्वविद्यालय (IACUC) के जानवरों की देखभाल के मानकों का पालन करती।

1. फेफड़े विच्छेदन

  1. स्तन ट्यूमर विच्छेदन (वैकल्पिक अध्ययन के लक्ष्यों पर और प्राथमिक ट्यूमर विश्लेषण या पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन किया गया था कि क्या निर्भर करता है)।
    1. IACUC और विश्वविद्यालय के विनियमन के अनुसार isoflurane संज्ञाहरण की एक घातक खुराक का उपयोग कर माउस euthanize। शल्य अव्यवस्था से euthanization की पुष्टि करें।
    2. फोम बोर्ड, अंग प्रसार के साथ अपनी पीठ पर माउस रखकर विच्छेदन पिन के साथ पिन पर।
    3. 70% इथेनॉल के साथ माउस का छिड़काव करें।
    4. संदंश का प्रयोग, केंद्र में पशु के निचले हिस्से को समझ।
    5. कैंची का उपयोग करना, माउस के पेरिटोनियल गुहा बेध नहीं सावधान किया जा रहा है, त्वचा के माध्यम से गर्दन की ओर ऊपर की ओर काटा।
    6. ट्यूमर के ऊतक को प्रकट करने के अंगों पर त्वचा में कटौती।
    7. ट्यूमर के ऊतक और जनसंपर्क काटनाआगे के विश्लेषण के लिए नहीं है (इस प्रोटोकॉल में आगे चर्चा), इस तरह की ठंड या निर्धारण, वरीय विधि द्वारा eserve।
  2. फेफड़े के ऊतकों विच्छेदन।
    1. जैसा कि ऊपर वर्णित ट्यूमर के ऊतक काटा गया था, तो किसी भी अतिरिक्त त्वचा नीचे पिन।
    2. संदंश का प्रयोग, जानवर के निचले सिरे पर पेरिटोनियम समझ और गर्दन के आधार की ओर ऊपर की तरफ काटने लगते हैं।
    3. ध्यान से वक्ष गुहा में खून बहाना हो सकता है कि किसी भी रक्त वाहिकाओं विच्छेद से बचने के लिए सावधान किया जा रहा रिब पिंजरे के बाएँ और दाएँ पक्ष के साथ काटा। छोड़ दिया और सही रिब पिंजरे के डायाफ्राम और ऊपरी भाग के माध्यम से काटने से पसली की हड्डियों को निकाल दें।
    4. संदंश का प्रयोग माउस की श्वासनली समझ और आगे खींच।
    5. विच्छेदन कैंची से श्वासनली तोड़ और माउस से फेफड़ों को हटा दें।
      नोट: दिल फेफड़ों से जुड़ी रह सकती है। यदि ऐसा होता है, ध्यान से सभी पांच खण्डों इकट्ठा करने के लिए सावधान किया जा रहा फेफड़ों से दूर दिल काटना (चित्रा 1 देखें
    6. अतिरिक्त रक्त को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ धीरे धो लें।
  3. फेफड़े के ऊतकों के सकल मूल्यांकन।
    1. विकल्प 1: vivo इमेजिंग में।
      1. Luciferase इमेजिंग के लिए, ~ 10 मिनट इमेजिंग के लिए पहले, जानवरों intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा luciferin के एक 150 मिलीग्राम / किग्रा खुराक दे। Anesthetized जानवरों में या विच्छेदन (चित्रा 2) 5 के बाद हटाने पर विवो में छवि फेफड़ों।
    2. विकल्प 2: सकल मूल्यांकन।
      1. ट्यूमर पिंड कल्पना करने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत फेफड़ों की जांच करना। नोट: लेबल कोशिकाओं GFP हैं, GFP पता लगाने के लिए (470/510 एनएम के पास उदाहरण के लिए) उचित / उत्तेजना उत्सर्जन Maxima के साथ एक प्रकाश घन युक्त एक प्रतिदीप्ति सक्षम stereomicroscope के प्रसंस्करण के लिए पूर्व प्रतिदीप्ति के लिए stereoscopically फेफड़ों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. फेफड़ों तुरंत विश्लेषण किया जाए तो, 'आरएनए अलगाव' अनुभाग के लिए आगे बढ़ें। अन्यथा, liqu का उपयोग कर फ्रीज ऊतक तस्वीरआईडी नाइट्रोजन या सूखी बर्फ। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. शाही सेना अलगाव

नोट: प्रतिनिधि विश्लेषण के लिए, आरएनए एक आरएनए अलगाव किट (सामग्री सूची देखें) का उपयोग कर अलग किया गया था। वर्तमान विश्लेषण एक विशिष्ट निर्माता के उत्पाद का उपयोग करता है, वहीं अलगाव किट की एक किस्म के कई सम्मानित विक्रेताओं से उपलब्ध हैं। इसके अतिरिक्त, गैर-किट आधारित centrifugation के तरीकों में भी एक विकल्प है। सीडीएनए भी इस तरह के मानक वक्र विश्लेषण के लिए एक सेल लाइन या प्लाज्मिड, के रूप में, एक सकारात्मक नियंत्रण आरएनए नमूने से तैयार किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, प्राइमर जांच सेट के लिए विशिष्ट एक सकारात्मक नियंत्रण खरीदा जा सकता है (सामग्री सूची देखें)।

  1. पहले से जमे हुए ऊतक का उपयोग करते हैं, तो सूखी बर्फ पर जमे हुए ऊतक इकट्ठा होते हैं।
  2. इस तरह के रूप में निम्न विधियों में से एक का उपयोग ऊतक Homogenize: मोर्टार और मूसल तरल नाइट्रोजन में ऊतक ठंड के बाद सूखी बर्फ के ऊपर हाथ से प्रदर्शन किया पीस; ऊतक homogenizer या यांत्रिक हदबंदी डिवाइसनिर्माता के सुझाव के अनुसार; sonication, या अन्य पसंदीदा तरीका।
    नोट: प्रतिनिधि विश्लेषण के लिए, homogenization की पसंदीदा तरीका sonication है।
    1. चित्रा 3 में प्रस्तुत विश्लेषण के लिए, के अनुपात में सेल (आरएनए अलगाव किट में प्रदान की) बफर और 2-mercaptoethanol तैयार 20 μl 2-mercaptoethanol lysis बफर के हर 1 मिलीलीटर के लिए। Resuspend ऊतक 300 μl lysis बफर में 30% आयाम पर सेट sonicator के साथ 10 सेकंड के लिए ऊतक और sonicate के हर 30 ग्राम के लिए 2-mercaptoethanol के साथ पूरक।
    2. पीसने के बाद 300 μl lysis बफर में resuspend जमीन ऊतक, मोर्टार और मूसल का उपयोग करते हैं।
  3. 590 μl ते बफर (; 1 मिमी EDTA 10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0) के लिए 10 μl proteinase कश्मीर जोड़ें। ऊतक के (यानी हर 30 मिलीग्राम के लिए) हर 300 μl करने के लिए 600 μl proteinase कश्मीर समाधान जोड़ें। आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: पाचन समय भिन्न हो सकते हैं।
  4. ≥1 पर अपकेंद्रित्र नमूने10 मिनट के लिए 3,000 ग्राम मलबे को हटाने के लिए।
  5. नई ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  6. आरएनए वेग के लिए सतह पर तैरनेवाला के हर 900 μl के लिए 450 μl इथेनॉल (96% -100%) जोड़ें।
  7. स्तंभ के लिए lysate / इथेनॉल मिश्रण के 700 μl स्थानांतरण।
  8. 1 मिनट के लिए ≥13,000 जी पर अपकेंद्रित्र नमूने स्तंभ के लिए आरएनए बाध्य करने के लिए।
  9. तरल अपशिष्ट त्यागें और स्तंभ के लिए शेष सतह पर तैरनेवाला जोड़ सकते हैं और फिर से स्पिन।
  10. सभी lysate कॉलम के माध्यम से काता है एक बार, 30 सेकंड के लिए ≥13,000 ग्राम पर स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज नमूने के ऊपरी भाग को धो बफर 1 के 350 μl जोड़ें।
  11. स्तंभ से तरल त्यागें और ऊपरी हिस्से की जगह।
  12. मैं 10x DNase के 5 μl और नमूना प्रति DNase / RNase मुक्त पानी के 40 μl (50 μl / नमूने की कुल मात्रा) के साथ एंजाइम DNase की 5 इकाइयों के मिश्रण से DNase तैयार करें।
  13. DNase के 50 μl प्रत्येक स्तंभ के लिए मिश्रण और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते जोड़ें।
  14. स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज सैम को धो बफर 1 के 350 μl जोड़ेंमंदिरों 30 सेकंड के लिए ≥13,000 ग्राम पर।
  15. स्तंभ से तरल त्यागें और ऊपरी हिस्से की जगह।
  16. स्तंभ को धो बफर 2 के 600 μl जोड़ें और ≥13,000 जी पर 30 सेकंड के स्पिन।
  17. स्तंभ से तरल त्यागें और ऊपरी हिस्से की जगह।
  18. ≥13,000 ग्राम पर 2 मिनट के लिए 250 धो बफर 2 के μl और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  19. नया संग्रह ट्यूब में स्तंभ का हिस्सा रखा और पुराने संग्रह ट्यूब त्यागें।
  20. स्तंभ के लिए RNase / DNase मुक्त पानी के 50-100 μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  21. ≥13,000 ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन।
  22. फिर से चलाएँ शाही सेना उपज बढ़ाने के लिए कॉलम के माध्यम से एकत्र eluate।
  23. तत्काल उपयोग के लिए, बर्फ पर नमूने रखने और quantitation के लिए आगे बढ़ें। बाद में उपयोग के लिए, सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन पर फ्रीज तस्वीर। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर की जरूरत तक।

3. पहले Strand संश्लेषण

नोट: प्रतिनिधि विश्लेषण के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) प्रतिक्रिया एक एफ प्रदर्शन किया गया था(सामग्री सूची देखें) क्यूआरटी पीसीआर के लिए डिज़ाइन किया गया irst कतरा सीडीएनए संश्लेषण किट।

  1. नमूने पहले से एकत्र किए गए थे, तो बर्फ पर ट्यूबों पिघलना।
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग आरएनए मात्रा को मापने।
  3. कुल शाही सेना के 0.5-2 ग्राम का उपयोग करना, सीडीएनए शेयर उत्पन्न करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर पहली कतरा संश्लेषण प्रदर्शन करते हैं।
    1. बाँझ, RNase / DNase मुक्त पीसीआर ट्यूबों / प्लेट में, प्रतिक्रिया मिश्रण (1 टेबल) तैयार करते हैं। धीरे और सेंट्रीफ्यूज मिलाएं। एक मानक पीसीआर मशीन (तालिका 2) कार्यक्रम।
  4. बाँझ nuclease मुफ्त पानी का उपयोग कर वांछित मात्रा (आम तौर पर 50-100 μl) को समाप्त प्रतिक्रिया पतला।

4. वास्तविक समय पीसीआर

नोट: प्रतिनिधि विश्लेषण के लिए, SYBR हरे रंग का इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, किसी भी पसंदीदा विधि उपयोगकर्ता के विवेक पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

  1. एक सकारात्मक नियंत्रण सीडीएनए का उपयोग करना, प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए एक मानक वक्र की स्थापना की।
    1. विश्लेषण मैं दिखाया लिएएन चित्रा 3, सकारात्मक नियंत्रण सीडीएनए सिफारिश निर्माता का उपयोग मानव HER2 के लिए मानक वक्र तैयार (सामग्री सूची देखें)। माउस GAPDH के लिए, एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण फेफड़ों सीडीएनए का उपयोग करें। 5 मानकों उत्पन्न करने के लिए 4: हर जांच के लिए, क्रमानुसार सीडीएनए 1 पतला।
  2. मानक वक्र और प्रयोगात्मक नमूने शामिल करना चाहिए, जो कुल नमूनों की संख्या की गणना।
    नोट: विश्लेषण यहाँ वर्णित के लिए, नमूना प्रति 2-3 प्रयोगात्मक प्रतिकृति विश्लेषण किया गया। मानक वक्र विश्लेषण अंतिम सामान्यीकृत मात्रा की गणना करने के लिए नमूना प्रति रिश्तेदार HER2 की राशि और GAPDH निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक साधारण रेखीय प्रतिगमन मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया गया था। इस विश्लेषण भी प्राइमर दक्षता हाथ में विश्लेषण के लिए पर्याप्त है कि यह सुनिश्चित करेंगे।
  3. एक बाँझ, RNase / DNase मुक्त ट्यूब में, मास्टर मिश्रण (3 टेबल) तैयार करते हैं।
    1. मास्टर मिश्रण Amoun की गणनानमूना प्रति टी। एक से अधिक नमूने के लिए ऊपर स्केल। ब्याज की प्रत्येक प्रयोगात्मक जीन, साथ ही GAPDH के रूप में इस तरह के एक आंतरिक नियंत्रण के लिए एक मास्टर मिश्रण का प्रयोग करें। 200 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता में GAPDH के लिए प्राइमरों का प्रयोग करें।
      नोट: मानव और माउस सेल मूल के बीच भेद करने के लिए कोशिश कर रहा है जब आंतरिक नियंत्रण विशेष रूप से उपयोगी है।
      नोट: HER2 के लिए प्राइमर एकाग्रता अनुकूलित और निर्माता द्वारा निर्धारित किया गया था।
  4. प्रत्येक मानक या प्रयोगात्मक नमूना करने के लिए इसी 1 μl cDNAs युक्त परीक्षण थाली तैयार है। प्रत्येक प्राइमर जांच के लिए अच्छी तरह से कम से कम 1 सीडीएनए नमूना / आवंटन। प्रत्येक प्राइमर जांच के लिए अच्छी तरह से प्रति मास्टर मिश्रण के 19 μl जोड़ें।
    नोट: चित्रा 3 में प्रतिनिधि डेटा के लिए, सीडीएनए नमूने प्रत्येक प्राइमर जांच के लिए दो प्रतियों में विश्लेषण किया गया और दो ​​नमूनों की औसत के रूप में रेखांकन।
  5. क्यूआरटी पीसीआर मशीन में चलाने के लिए प्रतिक्रिया की सिफारिश की है या पहले पीसीआर प्रोटोकॉल का परीक्षण का उपयोग कर। तालिका 4 देखें चित्रा 3 और 4 चित्र में प्रतिनिधि डेटा के लिए इस्तेमाल किया पीसीआर प्रोटोकॉल के लिए trong>।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

समय से परे यह प्रयोगात्मक जानवर में और यदि ट्यूमर कोशिकाओं के प्रारंभिक टीका प्रदर्शन करने के लिए ले जाता है प्रदर्शन, विवो ट्यूमर विश्लेषण, ऊतक फसल, शाही सेना, अलगाव और क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण में प्राथमिक एक 1-2 दिन प्रक्रिया है (चित्रा 1) ।

सकल विश्लेषण का एक उदाहरण फेफड़े के ऊतकों के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए bioluminescent इमेजिंग है। इधर, एक स्तन tumorigenesis प्रयोग Act1 बुलाया खाई जंक्शन प्रोटीन connexin43, कि लक्ष्य एक अनुसंधानात्मक एजेंट, फेफड़ों को 4T1 ल्यूक स्तन ट्यूमर कोशिकाओं की सहज मेटास्टेसिस ख़राब होगा कि क्या मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया था। उपचार, प्लेसबो या परीक्षण एजेंट प्राप्त किया है कि जानवरों के कई हफ्तों के बाद luciferin के साथ इंजेक्शन और बलिदान किया गया। विच्छेदन पर, फेफड़ों luciferase bioluminescence के लिए कल्पना थे। प्रतिनिधि छवियों से यह दवा से फेफड़ों कि प्रतीत होता हैपशुओं का इलाज कोई ट्यूमर कोशिकाओं Act1 उपचार (2A चित्रा) के बाद मेटास्टेसिस की एक अवरोध का सुझाव दे, फेफड़ों में मौजूद हैं, जो इंगित करता luciferase गतिविधि के लिए नकारात्मक हैं। इन छवियों प्रतिनिधि का मुख्य उद्देश्य bioluminescent इमेजिंग मेटास्टेसिस के लिए पता लगाने के लिए एक उपयुक्त तरीका है कि प्रदर्शन करने के लिए है। हालांकि, Act1 के साथ इलाज जानवरों से फेफड़ों के एच ई वर्गों की विस्तृत जांच करने पर, micrometastases शायद इमेजिंग के इस प्रकार के ट्यूमर की कम संख्या का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हो सकता है, सुझाव है कि luciferase इमेजिंग (चित्रा 2 बी) द्वारा प्रकाशित नहीं किया गया है कि पहचान की गई कोशिकाओं फेफड़ों के भीतर एम्बेडेड। आदर्श रूप में, क्यूआरटी पीसीआर के लिए एक साथी के विश्लेषण के इन परिणामों की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया जाएगा।

यहाँ प्रस्तुत क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण HER2 + JIMT -1 कोशिकाओं से फेफड़े में मानव ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए मानव HER2 के लिए एक जांच विशिष्ट का उपयोग करता हैमूल रूप से मेजबान पशुओं के स्तन वसा पैड (चित्रा 3) में प्रत्यारोपित किया गया। मेटास्टेसिस ट्यूमर के विकास के बाद अनायास हुआ। विच्छेदन करने पर, एक stereomicroscope के नीचे देखा, कोई निहायत दिखाई दे मेटास्टेसिस फेफड़ों में से किसी पर मनाया गया। हालांकि, बाद में क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण के आधार पर यह दृश्य से नहीं चल पाता थे कि कि ट्यूमर कोशिकाओं का सुझाव दे चित्रा 3 में तीर से चिह्नित मेटास्टेसिस harbored ट्यूमर असर पशुओं से काटा ग्यारह फेफड़ों के दो मौजूद हैं कि प्रतीत होता है। JIMT-1-व्युत्पन्न ट्यूमर का एक टुकड़ा से निकाली गई सीडीएनए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ नहीं किया गया था कि HER2 अभिव्यक्ति (चित्रा 3, (+)) और एक माउस से एक फेफड़ों के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 3, (-))। GAPDH के लिए एक माउस विशिष्ट जांच की कुल माउस फेफड़े के ऊतकों को मानव ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण करने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सकारात्मक नियंत्रणनमूना एक संदर्भ के रूप में नियंत्रण फेफड़ों से GAPDH स्तर तक सामान्यीकृत था। एक वैकल्पिक सामान्य बनाने की रणनीति नियंत्रण के नमूने लिए और अधिक सुसंगत सामान्य बनाने के स्तर को प्राप्त करने के लिए सभी फेफड़ों के नमूने भर में GAPDH की राशि औसत करने के लिए किया जाएगा। ऐसे GFP के रूप में गैर-माउस और गैर मानव जीनों के लिए वैकल्पिक जांच से पहले माउस में शुरुआत करने के लिए, उसके अनुसार चिह्नित किया गया है कि ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

एक माध्यमिक विश्लेषण भी फेफड़ों में कुल ट्यूमर सेल नंबर की एक रिश्तेदार quantitation प्रदान करने के लिए किया गया था। इन परिणामों के 4 चित्र में दिखाया गया है। इधर, एक मानक वक्र विश्लेषण एक सेल नंबर श्रृंखला में माउस फेफड़ों GAPDH के लिए सामान्यीकृत रिश्तेदार HER2 मात्रा निर्धारित करने के लिए तैयार किया गया था। सिद्धांत रूप में, इस शोधकर्ता, 1x10 6 में 1x10 5, 1x10 4, 1x10 HER2 के रिश्तेदार राशि निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है > 3, 1x10 2, और 10 कोशिकाओं। परिणाम क्यूआरटी पीसीआर जांच और विश्लेषण के रूप में कम के रूप में 10 कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) में HER2 के स्तर का पता लगाने के लिए काफी संवेदनशील था कि प्रदर्शन दिखा। जिसके परिणामस्वरूप गणना की HER2 के मूल्यों को एक लॉग-पैमाने पर प्लॉट किए जाते थे और एक सरल रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रत्येक फेफड़ों के नमूने में रिश्तेदार सेल नंबर, साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, सेल नंबर विशिष्ट मूल्यों प्रयोगात्मक नमूने के लिए उत्पन्न किया गया।

आकृति 1
इनसेट बढ़े ड्राइंग द्वारा संकेत के रूप में चित्रा फेफड़ों विच्छेदन और विश्लेषण के 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। माउस फेफड़ों, 5 पालियों में शामिल है। विच्छेदन से विश्लेषण करने के लिए क्यूआरटी पीसीआर प्रक्रिया आम तौर पर पूरा करने के लिए 1-2 दिन लगते हैं।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
मेटास्टेसिस के 2. सकल विश्लेषण चित्रा। (ए) 4T1 ल्यूक कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन और प्लेसबो या खाई जंक्शन प्रोटीन, connexin43 कि लक्ष्य एक अनुसंधानात्मक दवा कहा जाता Act1 या तो साथ इलाज किया गया है कि जानवरों से फेफड़ों के प्रतिनिधि bioluminescent छवियों। (बी)। में एक micrometastasis के प्रतिनिधि एच एंड ई अनुभाग Act1 के साथ इलाज किया गया था कि एक 4T1 ट्यूमर के साथ एक पशु के फेफड़ों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण। बार ग्राफमानव HER2, JIMT -1 मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन में एक जीन वर्तमान की क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण से quantitated डेटा का प्रतिनिधित्व। फेफड़ों में मानव HER2 स्तरों माउस GAPDH सामान्यीकृत कर रहे हैं। (+) सकारात्मक नियंत्रण अर्थ। (-) नकारात्मक नियंत्रण को दर्शाता है। परिणाम एक लॉग-पैमाने पर प्लॉट किए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
सेल नंबर विश्लेषण से चित्रा 4. प्रतिनिधि क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण। (ए) 1x10 6 से 10 कोशिकाओं से JIMT -1 कोशिकाओं के सेल नंबर मात्रा के संबंध में HER2 के स्तर का प्रतिनिधित्व ग्राफ़। से quantitated डेटा का प्रतिनिधित्व (बी) के बार ग्राफ मानव HER2 की क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण, JIMT -1 मानव स्तन में एक जीन पेश कर सकते हैंप्रमाणपत्र सेल लाइन। फेफड़ों में मानव HER2 स्तरों माउस GAPDH सामान्यीकृत कर रहे हैं। (+) सकारात्मक नियंत्रण अर्थ। (-) नकारात्मक नियंत्रण को दर्शाता है। परिणाम एक लॉग-पैमाने पर प्लॉट किए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

खाका आरएनए 0.5-2 माइक्रोग्राम
iScript Supermix 4 μl / नमूना
Nuclease मुक्त पानी 20 μl / नमूना के लिए ऊपर

तालिका 1. सबसे पहले Strand संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण घटकों (कदम 3.3.1)।

ellpadding = "0" cellspacing = "0" के लिए: रख-together.within-पेज = "1" चौड़ाई = "397">
चरण 1: 25 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
चरण 2: 42 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट
चरण 3: 85 डिग्री सेल्सियस (समापन) 5 मिनट

पहले Strand संश्लेषण (कदम 3.3.3) के लिए तालिका 2 पीसीआर की स्थिति।

"> Nuclease मुफ्त पानी
iTAQ मास्टर मिक्स 10 μl / नमूना
प्राइमर मिश्रण 1 μl / नमूना
20 μl / नमूना के लिए ऊपर

तालिका 3. वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण घटकों (4.3 चरण)।

स्टेप 1 एक्टिवेशन 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट एक चक्र
चरण 2 विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 5 सेकंड 40 चक्रों
एनीलिंग / एक्सटेंशन 60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
चरण 3 कर्व पिघला (वैकल्पिक) 65-95 डिग्री सेल्सियस (0.5 वेतन वृद्धि) 5 सेकंड / कदम </ टीडी>

तालिका 4. वास्तविक समय पीसीआर की स्थिति (4.5 कदम)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल एक जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग फेफड़ों को स्तन ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने के लिए क्यूआरटी पीसीआर के उपयोग का वर्णन। यह bioluminescent इमेजिंग सहित अन्य तकनीकों, उपलब्ध हैं, और यह भी अपने मूल्यों और सीमाओं के बावजूद मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए प्रभावी रहे हैं कि स्वीकार किया है। प्रस्तुत डाटा क्यूआरटी पीसीआर कुल मेटास्टेसिस के quantitation के लिए फेफड़े के ऊतकों के भीतर ट्यूमर व्युत्पन्न mRNA का पता लगाने के लिए एक प्रभावी उपाय प्रदान करता है कि पता चलता है। यह क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण पूरक कर सकते हैं या इन इमेजिंग तकनीक के एवज में प्रदर्शन किया है कि एक माध्यमिक तरीका प्रदान करता है कि प्रस्तावित है। इस तकनीक को सबसे अच्छा उपकरण की या मेटास्टेटिक बोझ में विशिष्ट हितों के साथ अनुसंधान समूहों के लिए कुछ विशेष प्रकार के सीमित उपयोग के साथ अनुसंधान वातावरण के लिए अनुकूल है लेकिन यंत्रवत अध्ययनों विस्तृत नहीं किया जा सकता है।

सूचनात्मक, वहीं यहाँ वर्णित क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण सीमाएं हैं। यह नीचे की ओर अतिरिक्त प्रदर्शन करने के लिए संभव नहीं हैइम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री (आईएचसी) या पूरे फेफड़े के ऊतकों आरएनए अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) धुंधला सहित विश्लेषण,। एक vivo इमेजिंग तकनीक के साथ रखा हालांकि, अगर फेफड़े के ऊतकों विश्लेषण के इस माध्यमिक प्रकार के प्रदर्शन के बाद इमेजिंग अलग किया जा सकता है। एक बहु प्रस्तुत करने का अलगाव किट फेफड़े के ऊतकों को तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जब तक कि इसके अलावा, इस तकनीक को इस प्रकार प्रोटीन विश्लेषण mRNA का पता लगाने के लिए और सीमित है संभव नहीं है। जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन का विश्लेषण अभी भी आईएचसी यदि / के आधार पर माउस ऊतकों में पाया धुंधला से ट्यूमर के ऊतक में दाग प्रोटीन चित्रित करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है, जबकि एक में सब ट्यूमर और फेफड़े के ऊतकों शामिल है कि एक कुल प्रोटीन मिश्रण, का मूल्यांकन करने के लिए होने तक सीमित है आईएचसी यदि / धुंधला के दृश्य। मेटास्टेसिस फेफड़ों के एक हिस्से में पहचान की है और वें नहीं कर रहे हैं फायदेमंद हो सकता है इस तरह के ऊतक विज्ञान के रूप में अन्य विश्लेषण के लिए फेफड़े के ऊतकों के आधे बनाए रखने पर परस्पर विरोधी निष्कर्षों का खतरा है, पूरे फेफड़ों का उपयोग करने के लिए वैकल्पिकई अन्य।

संशोधन और समस्या निवारण के कई बिंदुओं सिफारिश कर रहे हैं। क्यूआरटी पीसीआर डेटा की सटीकता प्रतिलेख quantitation के लिए एक उचित मानक वक्र विश्लेषण के उपयोग सहित सिफारिश की है परख और जांच के अनुकूलन के लिए चुना जाता है कि प्राइमर जांच पर निर्भर है। इसके अतिरिक्त, यह अलग है कि शाही सेना की गुणवत्ता गेज करने के लिए महत्वपूर्ण है। ओवर-पाचन proteinase साथ ऊतक के कश्मीर आरएनए गुणवत्ता को कम कर सकते हैं और इस तरह अनुकूलन आरएनए तैयारी के हित और विधि के विशिष्ट ऊतक के आधार पर की सिफारिश की है। एक उचित हाउसकीपिंग संदर्भ जीन का चयन भी महत्वपूर्ण है। GAPDH आमतौर पर इस्तेमाल किया संदर्भ जीन है, वहीं हर जीन की वजह से प्रयोगात्मक शर्तों को बदला जा सकता है कि सेल में एक सामान्य समारोह और इस तरह वैकल्पिक विकल्प उपयोगी होते हैं (मेजबान ऐसे जीन पीटा रूप में पशुओं की यानी आनुवंशिक संशोधन) में कार्य करता है। रिपोर्ट कर रहे हैं कि कुछ आम संदर्भ जीन सर्वव्यापी एक्सप्रेस के लिए हैआयन और मात्रा में कम भिन्नता प्रोटीन (TBP) बाध्यकारी टाटा-बॉक्स, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा 2 एन्कोडिंग जीन हैं (RP2), actin की तरह प्रोटीन (अधिनियम), और गोलमटोल द्विपक्षीय प्रतिलेखन कारक (टब) 11। इसके अलावा, सटीक विश्लेषण विश्वास दिलाता हूं कि महत्वपूर्ण कदम, फेफड़ों (कदम 1.2.2-1.2.6) की सटीक विच्छेदन और वाशिंग शामिल क्यूआरटी पीसीआर सेटअप (कदम 4.4) के दौरान अलग-थलग कुल शाही सेना के सही quantitation (3.2 कदम), और सटीक pipetting। एक दोहराने pipettor का उपयोग इस प्रक्रिया में सहायता कर सकते हैं।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल क्यूआरटी पीसीआर फेफड़ों मेटास्टेसिस की पहचान करने के लिए एक quantifiable विधि है कि प्रदर्शन करने के लिए करना है। सकारात्मक मूल्य और सीमाओं दोनों इस प्रक्रिया के उपयोग के साथ की पहचान कर रहे हैं और यह सबसे अच्छा विश्लेषण का एक माध्यमिक विधि के साथ जोड़ा जा करने के लिए उपयुक्त हो सकता है। हालांकि, इस पद्धति उन अनुसंधान laborator के लिए quantitation के एक सीधे आगे प्रक्रिया हो सकता हैविशिष्ट अनुसंधान की जरूरत है या व्यापक उपकरणों की कमी के साथ एँ मेटास्टेसिस जांच करने के लिए। । इस विधि का भविष्य अनुप्रयोगों मेटास्टेसिस के अन्य आम साइटों रहे हैं, जो इस तरह के लिम्फ नोड या मस्तिष्क के रूप में फेफड़ों के परे लक्ष्य अंगों में मेटास्टेसिस, के लिए देखने के लिए संशोधन शामिल हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ESY और मां FirstString अनुसंधान इंक द्वारा नियोजित नहीं कर रहे हैं और कंपनी में किसी भी वित्तीय हित पकड़ नहीं है। FirstString अनुसंधान इंक इस पांडुलिपि में प्रस्तुत किया गया था कि luciferase इमेजिंग डेटा प्रदान की है। GSG FirstString रिसर्च के अध्यक्ष और मुख्य कार्यकारी अधिकारी है। CLG FirstString अनुसंधान के एक कर्मचारी है। GSG और CLG FirstString रिसर्च द्वारा जारी किए गए शेयर विकल्प हैं।

Acknowledgments

ये प्रयोगशाला एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान (IRG-97-219-14) एक रक्षा विभाग के अनुदान से अनुसंधान के वित्तपोषण के द्वारा, MUSC पर Hollings कैंसर केंद्र के लिए सम्मानित किया (W81XWH-11-2- से अनुसंधान के वित्तपोषण के द्वारा समर्थित है 0229) MUSC पर, और चिंता (ESY करने के लिए) फाउंडेशन से एक पुरस्कार से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Fisher BP176-100
DNAse Thermo Scientific EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit Thermo Scientific K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR Bio-Rad 1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix  Bio-Rad 172-5121 
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human  Bio-Rad 100-25636 
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human  Bio-Rad 100-25716 
gapdh Primer Sequence For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  2. Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. Modeling metastasis in the mouse. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).
  3. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).
  4. Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
  5. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).
  6. Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis. Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).
  7. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  8. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).
  9. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).
  10. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).
  11. Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).

Tags

चिकित्सा अंक 107 स्तन ट्यूमर फेफड़े मेटास्टेसिस वास्तविक समय पीसीआर जेनोग्राफ्ट अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा माउस स्तन ट्यूमर मॉडल में फेफड़ों मेटास्टेसिस का मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar,… More

Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR. J. Vis. Exp. (107), e53329, doi:10.3791/53329 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter