Evaluering av Lung metastaser i Mouse Brysttumormodeller av kvantitativ real-time PCR

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) for å oppdage svulsten celle spesifikke mRNA som representerer metastaser innen musen lungevevet.

Abstract

Metastatisk sykdom er spredningen av maligne tumorceller fra primærcancer området til en fjernt organ, og er den primære årsak til kreft assosiert død ^1. Vanlige områder av metastatisk spredning inkluderer lunge, lymfeknute, hjerne og bein ^2. Mekanismene som driver metastase er intense områder av kreftforskning. Følgelig til effektive analyser måle metastatisk belastning i fjerne områder av metastaser er instrumental for kreftforskning. Evaluering av lungemetastaser i brysttumormodeller er vanligvis utført av brutto kvalitativ observasjon av lungevev etter disseksjon. Kvantitative metoder for evaluering av metastaser er foreløpig begrenset til ex vivo og in vivo bildebaserte teknikker som krever brukerdefinerte parametere. Mange av disse teknikkene er at hele organismen nivå enn cellenivå ^3-6. Selv nyere avbildningsmetoder utnytte multi-foton mikroskopi er i stand til å vurdere metastasis på cellenivå ^7, disse svært elegante prosedyrer er mer egnet til å vurdere mekanismer for formidling fremfor kvantitativ vurdering av metastatisk byrde. Her blir en enkel in vitro-metode for å kvantitativt vurdere presenteres metastase. Ved hjelp av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcelle bestemt mRNA oppdages innen musen lungevevet.

Introduction

QRT-PCR-analyse er foreslått som en metode for vurdering av tumormetastase. Denne metoden er foreslått som et alternativ for brukere som er interessert i å vurdere metastaser, men kanskje ikke har tilgang til spesielle utstyr som for eksempel in vivo imaging utstyr eller en fluorescens stand stereoskop. En diskusjon av brukte metodene er presentert etterfulgt av en demonstrasjon for hvordan QRT-PCR-analyse kan brukes enten som en separat eller som en følges metode for å evaluere metastaser. Denne fremgangsmåten har potensial til å gi en kvantitativ analyse av metastatisk belastning.

Standard metoder for grov analyse, inkludert visualisering av lungene under en stereo samt serie seksjonering fulgt av hematoxylin og eosin (H & E) farging av lungevev, er kvantifiserbare men avhengige av brukerdefinerte parametere for telling ^2-5. Når man skal vurdere hele lungene ved hjelp av et stereomikroskop, bare store overflatemetastaser er visigjengelig og analyse krever etterforskeren skal ha rimelig kjennskap til lunge anatomiske strukturen for å avgjøre hva som utgjør en metastatisk lesjon. Fluorescerende merking av tumorceller med en markør slik som GFP og bruk av et stereomikroskop som inneholder en lys kube med det passende eksitasjon / emisjon maksima (f.eks nær 470/510 nm for GFP) hjelper til med denne prosessen, men bare overflate tumorknuter kan påvises . I tillegg fluorescens fra blodsmitte, som er synlig under de samme parametrene som GFP, kan føre til falsk identifikasjon av mulige metastatiske lesjoner.

Seksjonering av lungen fulgt av H & E farging for å visualisere lungemetastase er en nyttig metode for å evaluere mikrometastaser og andre mikroskopiske prosesser, inkludert immuncelleinfiltrasjon, men krever ofte bruk av hele lungevev for parafin innebygging, snitting og fargingsprosedyrer. Derfor nedstrøms prosedyrer er ikke ideelt å følge denne method. Selv om det er kvantifiserbar denne fremgangsmåten krever undersøkeren for å evaluere et stort antall fargede lungeseksjoner per dyr for å sikre at analysen står for hele 3D-strukturen til lungen. Derfor denne type undersøkelse er tidkrevende, kan føre til tellefeil, og analysen er veldig avhengig etterforsker skjønn.

Flere i vivo imaging teknikker (f.eks MRI, PET, SPECT) blir i dag brukt til å utføre eller teste biologiske prosesser i eksperimentelle gnagermodeller ^8. In vivo bioluminescent bildediagnostikk er en vanlig metode som brukes for å skaffe seg en brutto visning av metastase ^9. Denne teknikken blir vanligvis brukt for å evaluere tilstedeværelsen av luciferase reporter-aktivitet på grunn av opphopning av tumorceller, som er konstruert for å inneholde en luciferase responselement, som befinner seg i bestemte organer som juret etter tumorcelle implantasjon, og lungen ved spontan metastase ¹0. Visualisering av luciferase reporter-aktivitet er indusert ved nærværet av luciferin substrat (D-luciferin). Luciferase katalyserer den oksydative dekarboksylering av D-luciferin for å generere oxyluciferin bioluminescens. Mens rikt, er denne metoden begrenset av flere faktorer, inkludert substrat stabilitet (dvs. kort halveringstid), tilfredsstillende fordeling av substrat som avhenger av hvordan det er levert til forsøksdyr, og lav følsomhet for deteksjon ^9. En hoved fortjeneste til denne teknikken er at den er ikke-invasiv, kan utføres på levende dyr, og kan føre til påvisning av tumorcellemetastaser i flere organer som kanskje ikke har vært normalt høstet ved disseksjon ^9,10.

En positiv side ved in vivo imaging teknikker er at lungevevet er uforstyrret åpner for sekundære prosedyrer som parafin innebygging eller som presenteres her, QRT-PCR-analyse. Men fordi QRT-PCR er theoretically et mer følsomt mål på gjenkjenning, kan brutto evalueringen ikke avsløre lavt antall kreftceller til stede i lungen. Mens nyttig, kan bildeteknikker beskrevet ovenfor erstattes eller suppleres med QRT-PCR-metoden for tiden beskrevet. QRT-PCR har potensiale for å tilveiebringe et følsomt mål på tumor-avledede mRNA i en lunge.

Protocol

Protokollen følger de retningslinjer og dyr omsorg standarder for Medical University of South Carolina (MUSC) og dens Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Brysttumor disseksjon (valgfritt avhengig av studiemål og om primærtumor analyse eller halevenen injeksjon ble utført).
   1. Avlive mus bruker en dødelig dose av isoflurananestesi ifølge IACUC og universitet regulering. Bekreft euthanization ved kirurgisk forvridning.
   2. På skum bord, pin med disseksjon pins ved å plassere musen på ryggen med bena spredt.
   3. Spray-mus med 70% etanol.
   4. Ved hjelp av tang, griper det nedre parti av dyret i sentrum.
   5. Ved hjelp av saks, klippe oppover mot halsen gjennom huden, være forsiktig med å stikke hull i bukhulen på mus.
   6. Skjær tilbake huden på bena for å avsløre svulstvev.
   7. Dissekere ut svulstvev og preserve av foretrukne metoden, slik som frysing eller fiksering, for videre analyse (ikke nærmere omtalt i denne protokollen).
2. Lungevev disseksjon.
   1. Hvis svulstvev ble høstet som beskrevet ovenfor, pin ned overflødig hud.
   2. Ved hjelp av tang, griper peritoneum ved nedre ende av dyret og begynne å skjære oppover mot bunnen av halsen.
   3. Skjær forsiktig langs venstre og høyre side av brystkassen er forsiktig med å unngå severing noen blodårer som kan blø inn i brysthulen. Fjern de rib bein ved å kutte til venstre og høyre gjennom membranen og øvre deler av brystkassen.
   4. Bruk pinsett gripe luftrøret på musen og trekke frem.
   5. Sever luftrøret med disseksjon saks og fjerne lunger fra mus.
      Merk: Hjertet kan forbli festet til lungene. Hvis dette skjer, nøye dissekere hjerte bort fra lungene er forsiktig med å samle alle fem lapper (se figur 1
   6. Forsiktig vask med PBS for å fjerne overskudd av blod.
3. Brutto evaluering av lungevev.
   1. Alternativ 1: In vivo avbildning.
      1. For luciferase avbildning, ~ 10 min før avbildning, gi et dyr 150 mg / kg dose av luciferin ved intraperitoneal (ip) injeksjon. Bilde lungene in vivo hos bedøvede dyr eller ved fjerning etter disseksjon (figur 2) ^5.
   2. Alternativ 2: Brutto evaluering.
      1. Undersøke lungene henhold stereo mikroskop for å visualisere tumornoduler. Merk: Hvis cellene er GFP-merket, kan en fluorescens i stand til stereomikroskop med en lys kube med det passende eksitasjon / emisjon maksima (for eksempel nær 470/510 nm) for å detektere GFP brukes til å undersøke lungene stereoskopisk for fluorescens før behandling.
   3. Hvis lungene skal analyseres umiddelbart, fortsetter du til 'RNA Isolation "-delen. Ellers knipse fryse vev ved hjelp av væskerid nitrogen eller tørris. Oppbevar ved -80 ° C.

2. RNA Isolation

Merk: For representant analyse ble RNA isolert ved hjelp av en RNA isolering kit (se Materials List). Mens dagens analyse bruker ett bestemt produsentens produkt, et utvalg av isolasjon kits er tilgjengelig fra flere anerkjente leverandører. I tillegg non-kit basert sentrifugeringsmetoder er også et alternativ. cDNA bør også fremstilles fra en positiv kontroll RNA prøve, slik som en cellelinje eller plasmid, for standardkurve analyse. Alternativt kan en positiv kontroll som er spesifikke for primer sonden sett kjøpes (se Materialer List).

1. Hvis du bruker tidligere frosset vev, samle frosset vev på tørris.
2. Homogenisere vev ved hjelp av en av følgende metoder som: morter sliping utført for hånd i løpet tørr is vev etter frysing i flytende nitrogen; vevshomogenisator eller mekanisk dissosiasjon enhetper produsentens forslag; ultralydbehandling, eller en annen foretrukket fremgangsmåte.
   Merk: For representant analyse, er den foretrukne metoden for homogenisering lydbehandling.
   1. For analysen presentert i figur 3, fremstille lyseringsbuffer (tilgjengelig i RNA isolert kit) og 2-merkaptoetanol i et forhold på 20 pl 2-merkaptoetanol for hver 1 ml lyseringsbuffer. Resuspender vev i 300 ul lyseringsbuffer supplert med 2-merkaptoetanol for hver 30 g av vev og sonikere i 10 sek med sonikator satt til 30% amplitude.
   2. Hvis du bruker morter, resuspender bakken vev i 300 mL lysisbuffer etter sliping.
3. Tilsett 10 ul proteinase K til 590 ul TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Legg 600 pl proteinase K-løsning til hver 300 ul (dvs. for hver 30 mg) av vev. Inkuber i 10 min ved RT.
   Merk: Fordøyelse Tiden kan variere.
4. Sentrifuger prøver på ≥13000 g i 10 minutter for å fjerne rester.
5. Overfør supernatanten til nye rør.
6. Legg 450 ul etanol (96% -100%) for hver 900 ul av supernatanten for å utfelle RNA.
7. Overfør 700 ul av lysatet / etanol-blanding til kolonnen.
8. Sentrifuger prøvene ved ≥13,000 g i 1 min for å binde RNA til kolonnen.
9. Kast flytende avfall og tilsett resten av supernatant til kolonne og spinne igjen.
10. Når all lysatet blir spunnet gjennom kolonnen, tilsett 350 ul av en vaskebuffer til den øvre delen av kolonnen og sentrifugere prøven ved de ≥13,000 g i 30 sek.
11. Kast væske fra kolonnen og erstatte øvre del.
12. Forbered DNase ved å blande 5 enheter DNase I enzym med 5 ul 10 x DNase og 40 ul av DNase / RNase fritt vann per prøve (totalt volum på 50 ul / prøve).
13. Tilsett 50 mL av DNase bland til hver kolonne og inkuberes i 15 min ved RT.
14. Legg 350 mL av Wash Buffer 1 til kolonnen og sentrifuger samsipper på ≥13,000 g for 30 sek.
15. Kast væske fra kolonnen og erstatte øvre del.
16. Legg 600 ul vaskebuffer 2 til kolonnen og spinne 30 sek ved ≥13,000 g.
17. Kast væske fra kolonnen og erstatte øvre del.
18. Tilsett 250 ul vaskebuffer og 2 sentrifuge i 2 minutter ved ≥13,000 g.
19. Sett en del av kolonnen til ny samling rør og kast gamle samling rør.
20. Legg 50-100 ul RNase / DNase fritt vann til kolonnen og inkuberes i 1 min.
21. Spinne i 1 min på ≥13,000 g.
22. Re drevne samlet eluatet gjennom kolonnen for å øke RNA yield.
23. For umiddelbar bruk, holde prøvene på is og fortsett til kvantifisering. For senere bruk, knipse fryse på tørris eller flytende nitrogen. Oppbevares ved -80 ° C fryser inntil nødvendig.

3. First Strand Synthesis

Merk: For representant analyse ble revers transkriptase (RT) reaksjon utført en First Strand cDNA syntese kit designet for QRT-PCR (se Materials List).

1. Hvis prøvene tidligere ble samlet inn, tine rørene på is.
2. Mål RNA mengde ved hjelp av et spektrofotometer.
3. Ved hjelp av 0,5-2 pg av total RNA, utføre første tråd syntese ved anvendelse av revers transkriptase for å generere cDNA lager.
   1. I sterile, RNase / DNase-free PCR rør / plater, forberede reaksjonen mix (tabell 1). Bland forsiktig og sentrifuger. Programmere en standard PCR maskin (tabell 2).
4. Fortynn ferdig reaksjon på ønsket volum (vanligvis 50-100 ul) bruker sterilt nukleasefritt vann.

4. Real-time PCR

Merk: For representant analyse ble SYBR grønt brukt. Imidlertid kan en hvilken som helst foretrukket fremgangsmåte være substituert på brukerens skjønn.

1. Ved hjelp av en positiv kontroll cDNA, satt opp en standardkurve for hvert primersett.
   1. For analyse vist in Figur 3, forberede standardkurven for menneskelig HER2 hjelp av produsenten anbefalte positiv kontroll cDNA (se Materials List). For mus GAPDH, bruke den negative kontrollen lunge cDNA å generere en standardkurve. For hver probe, i serie fortynne cDNA 1: 4 for å generere 5 standarder.
2. Beregn det totale antallet prøver, som bør inkludere standardkurven og eksperimentelle prøver.
   Merk: For analysen er beskrevet her, ble 2-3 eksperimentelle replikater per prøve analysert. Standardkurve analyse ble utført for å generere en enkel lineær regresjonsmodell som kan brukes for å bestemme den relative mengde av HER2 og GAPDH per prøve for å beregne endelig normalisert kvantitet. Denne analysen vil også sørge for at primer effektivitet er tilstrekkelig for analyse på hånden.
3. I et sterilt, RNase / DNase-free tube, forberede mester mix (Tabell 3).
   1. Beregn mester mix amount per prøve. Skalere opp for mer enn én prøve. Bruk en masterblanding for hver forsøks genet av interesse, så vel som en intern kontroll som GAPDH. Bruke primere for GAPDH ved en sluttkonsentrasjon på 200 nM.
      Merk: Internkontrollen er spesielt nyttig når du prøver å skille mellom menneske og mus celle opprinnelse.
      Merk: Primer konsentrasjon for HER2 ble optimalisert og bestemt av produsenten.
4. Tilberede prøveplate inneholdende 1 pl cDNA som svarer til hver standard eller eksperimentell prøve. Bevilge minst en cDNA prøven / brønn for hver primer probe. Legg 19 mL av masterblanding per brønn for hver primer probe.
   Merk: For representative data i figur 3, ble cDNA-prøvene analysert i duplikat for hvert primer probe og fremstilles grafisk som gjennomsnittet av de to prøvene.
5. Kjør reaksjon i QRT-PCR-maskin ved hjelp av anbefalt eller tidligere testet PCR-protokollen. Se tabell 4 dataene på figur 3 og figur 4.

Representative Results

Utover den tiden det tar å utføre den innledende inokulering av tumorceller inn i forsøksdyr, og hvis utførelse, primær in vivo tumor-analyse, vevet avling, RNA isolering, og QRT-PCR-analyse er en 1-2 dagers prosedyre (Figur 1) .

Et eksempel på brutto analyse er selvlysende avbildning for å vurdere tumorceller i lungevevet. Her ble en bryst tumorigenesis eksperiment utført for å vurdere om en eksperimentell middel som er rettet mot gap junction protein connexin43, kalt ACT1, ville svekke spontan metastasering av 4T1-Luc melketumorceller til lungene. Etter flere uker med behandling, dyr som fikk placebo og testmidlet ble injisert med luciferin og ofret. Ved disseksjon, ble lungene visualisert for luciferase Bioluminescens. Fra de representative bildene ser det ut til at lungene fra narkotikabehandlede dyr er negative for luciferaseaktiviteten som indikerer at ingen tumorceller er tilstede i lungene, noe som tyder på en inhibering av metastaser etter ACT1 behandling (figur 2A). Hovedformålet med disse representative bilder er å vise at selvlysende bildebehandling er en passende metode for påvisning for metastasering. Men ved nærmere undersøkelse av H & E deler av lungene fra dyr behandlet med ACT1, ble mikrometastaser identifisert som ikke ble belyst av luciferase-imaging (figur 2B), kanskje noe som tyder på at denne type avbildning ikke være følsom nok til å detektere lavt antall tumor celler innleiret i lungene. Ideelt sett ville en ledsager analyse for QRT-PCR bli utført for å bekrefte disse resultater.

QRT-PCR-analyse er presentert her anvender en sonde spesifikk for humant HER2 for å detektere humane tumorceller i lunge fra HER2 + JIMT-1-celler somopprinnelig ble transplantert inn i melkefettpute av vertsdyr (figur 3). Metastase oppsto spontant etter svulst utvikling. Etter disseksjon, sett under et stereomikroskop, ble det ikke grovt synlige metastaser observert på noen av lungene. Imidlertid, basert på den etterfølgende QRT-PCR-analyse synes det som om to av de elleve lungene høstet fra tumorbærende dyr næret metastaser, som er betegnet ved pilene i figur 3, noe som tyder på at tumorceller som ble ubemerket av visualiseringen er til stede. cDNA avledet fra et stykke av JIMT-1-avledet tumor ble anvendt som en positiv kontroll for HER2 uttrykket (figur 3, (+)) og en lunge fra en mus som ikke ble injisert med tumorceller ble benyttet som en negativ kontroll (figur 3, (-)). En mus spesifikk probe for GAPDH ble anvendt som en intern kontroll for å bestemme andelen av humane tumorceller i mus total lungevevet. Den positive kontrollenPrøven ble normalisert til GAPDH-nivåer fra styre lungen som referanse. En alternativ normalisering strategi ville være å gjennomsnitt mengden GAPDH tvers av alle lungekreft prøver å tilegne seg mer konsekvent normaliserings nivåer for kontrollprøver. Alternative prober for ikke-mus og ikke-humane gener, slik som GFP kan være substituert for å påvise tumorceller som er blitt merket tilsvarende, forut for innføring i mus.

En sekundær analyse ble også utført for å tilveiebringe en relativ kvantifisering av total tumor celletallet til stede i lungen. Disse resultatene er vist i figur 4. Her er en standardkurve analyse var innstilt på å bestemme den relative mengde av HER2 normalisert til GAPDH mus lunge i en celle nummerserie. I teorien kan dette forskeren til å bestemme den relative mengde av HER2 i 1x10 ^6, 1x10 ^5, 1x10 ^4, 1x10 > 3, 1x10 ^2, og 10 celler. Resultatene viser at QRT-PCR-probe og analyse utført var følsom nok til å detektere HER2-nivåer i så lite som 10-celler (figur 4A). De resulterende beregnede HER2 verdier ble plottet på en log-skala, og en enkel lineær regresjonsanalyse ble benyttet for å bestemme det relative celleantall i hver lungeprøve, så vel som positive og negative kontroller. Som vist i figur 4B, ble celletall spesifikke verdier som genereres for de eksperimentelle prøver.

Figur 1. Skjematisk fremstilling av lunge disseksjon og analyse. Musen lunge inneholder 5 fliker, som indikert av det innfelte forstørret tegning. Fra disseksjon til analyse prosedyren QRT-PCR vanligvis tar 1-2 dager å fullføre.ge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Brutto analyse av metastaser. (A) Representative bioluminescerende bilder av lungene fra dyr som ble injisert med 4T1-Luc celler og behandlet med enten placebo eller en eksperimentell medikament kalt ACT1 som er rettet mot gap junction protein, connexin43. (B). Representant H & E-delen av en micrometastasis i lunge av et dyr med en 4T1 svulst som ble behandlet med ACT1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Representant QRT-PCR-analyse. Søylediagrammetsrepresenterer kvantifisert data fra QRT-PCR-analyse av humant HER2, et gen som er tilstede i JIMT-1 human brystcancercellelinje. Menneskelige HER2 nivåer i lungen er normalisert til mus GAPDH. (+) Angir positiv kontroll. (-) Betyr negativ kontroll. Resultatene er plottet på en log-skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Representative QRT-PCR-analyse av celle nummeranalyse. (A) Diagram representerer HER2-nivåer i forhold til celletallet mengde JIMT-1-celler fra 1x10 ^{6 til} 10 celler. (B) av søylediagram som representerer data fra kvantifisert QRT-PCR-analyse av humant HER2, et gen som er tilstede i JIMT-1 human bryst muligcer cellelinje. Menneskelige HER2 nivåer i lungen er normalisert til mus GAPDH. (+) Angir positiv kontroll. (-) Betyr negativ kontroll. Resultatene er plottet på en log-skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mal RNA	0,5-2 mikrogram
iScript Supermix	4 mL / prøve
Nukleasefritt vann	opp til 20 ul / prøve

Tabell 1. First Strand Synthesis reaksjon mix komponenter (trinn 3.3.1).

ellpadding = "0" cellspacing = "0" fo: keep-together.within-page = "1" width = "397">

Trinn 1: 25 ° C	5 min
Trinn 2: 42 ° C	30 min
Trinn 3: 85 ° C (terminering)	5 min

Tabell 2. PCR-betingelser for First Strand Synthesis (trinn 3.3.3).

"> Nuclease Gratis vann

iTAQ Master Mix	10 mL / prøve
Primer Mix	1 mL / prøve
opp til 20 ul / prøve

Tabell 3. Real-time PCR reaksjonen mix komponenter (trinn 4.3).

Trinn 1	Aktivisering	95 ° C	2 min	En syklus
Trinn 2	Denaturering	95 ° C	5 sek	40 sykluser
	Gløding / Extension	60 ° C	30 sek
Trinn 3	Smelt Curve (valgfritt)	65-95 ° C (i trinn på 0,5)	5 sek / trinn </ td>

Tabell 4. Real-Time PCR betingelser (trinn 4.5).

Discussion

Denne protokollen beskriver anvendelse av QRT-PCR for å evaluere brysttumorcellemetastasering til lungen ved hjelp av en xenograft musemodell. Det erkjennes at andre teknikker, inkludert selvlysende avbildning, er tilgjengelige og er også effektive for detektering av metastasering til tross for å ha sine egne verdier og begrensninger. Dataene presenteres antyder at QRT-PCR gir et effektivt tiltak for å påvise tumor-avledet mRNA innenfor lungevev for kvantifisering av total metastaser. Det er foreslått at QRT-PCR-analyse gir en sekundær metode som kan komplettere eller utføres i stedet for disse bildeteknikker. Denne teknikken kan være best egnet for forskningsmiljøer med begrenset tilgang til visse typer utstyr eller for forskningsgrupper med spesielle interesser i metastatisk byrde, men ikke detaljert mekanistiske studier.

Mens informativ, QRT-PCR-analyse er beskrevet her har begrensninger. Det er ikke mulig å utføre tilleggsnedstrømsanalyse, inkludert immunhistokjemi (IHC) eller immunfluorescens (IF) farging fordi hele lungevev anvendes for RNA-isolering. Hvis imidlertid forbundet med en in vivo avbildningsteknikk lungevevet kan isoleres post-avbildning for å utføre denne sekundære type analyse. Dessuten er denne teknikken er begrenset til å detektere mRNA og dermed protein analyse er ikke mulig med mindre en multi-prep isolasjon settet brukes for å fremstille den tette vev. Analysen av resulterende protein er fortsatt begrenset til å måtte vurdere en total proteinblanding som omfatter svulsten og lungevev alt i ett, mens IHC / IF tillater brukeren å avgrense proteiner farget i tumorvev fra flekker funnet i mus vev, basert på visualisering av IHC / IF farging. Alternativ til å bruke hele lungen, opprettholde halvparten av lungevev for andre analyser som histologi kan være fordelaktig, men løper risikoen for motstridende resultater hvis metastaser er identifisert i en del av lungen og ikke the andre.

Flere interessante modifikasjon og feilsøking anbefales. Nøyaktigheten av QRT-PCR-data er avhengig av primer sonde som er valgt for analysen og optimalisering av prober er anbefalt, inkludert bruk av en passende standardkurve analyse for transkripsjon kvantifisering. I tillegg er det viktig å måle kvaliteten på det RNA som er isolert. Over-nedbrytning av vev med proteinase K kan redusere RNA kvalitet og dermed optimalisering anbefales basert på det spesifikke vev av interesse og fremgangsmåte for RNA-preparatet. Velge en passende rengjøring referanse genet er også viktig. Mens GAPDH er et vanlig brukt referanse-genet, tjener hvert gen en normal funksjon i cellen som kan bli endret på grunn av forsøksbetingelser (dvs. genetisk modifisering av vertsdyr som knockout-genet), og således alternative valg er nyttige. Noen vanlige referanse gener som er rapportert å ha allestedsnærværende uttrykkeligion og lav variasjon i mengde er de genene som koder TATA-boksen bindende protein (TBP), Retinitis pigmentosa 2 (RP2), Actin-lignende protein (Act), og Tubby bipartite transkripsjonsfaktor (Tub) ^11. Videre kritiske trinnene som sikrer nøyaktig analyse inkluderer nøyaktig disseksjon og vasking av lungen (trinn 1.2.2-1.2.6), riktig mengdebestemmelse av total-RNA isolert (trinn 3.2), og nøyaktig pipettering under QRT-PCR oppsett (trinn 4.4). Anvendelse av en gjentakelse pipette kan hjelpe i denne prosessen.

I sammendraget, har som mål denne protokollen for å vise at QRT-PCR er en målbar metode for å identifisere lungemetastaser. Både positive verdi, og begrensninger som er identifisert ved bruk av denne fremgangsmåten, og det kan være best egnet til å bli koblet sammen med en sekundær metode for analyse. Imidlertid kan denne fremgangsmåte være en rett frem fremgangsmåte for kvantifisering for de forskning laboratoriumkaper med spesifikke forskningsbehov eller mangel på omfattende utstyr for å undersøke metastaser. . Fremtidige anvendelser av denne metoden omfatter modifikasjon for å lete etter metastaser i målorganer utover lungene, for eksempel lymfeknute eller hjerne, som er andre vanlige områder av metastaser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG