Summary
Detta protokoll beskriver hur man använder kvantitativa realtid PCR (QRT-PCR) för att upptäcka tumörcellsspecifika mRNA representerar metastaser i musen lungvävnad.
Abstract
Metastatisk sjukdom är spridningen av maligna tumörceller från den primära cancer webbplats till en avlägsen organ och är den främsta orsaken till cancer associerade dödsfall 1. Vanliga platser av metastatisk spridning inkluderar lunga, lymfkörtel, hjärna och ben 2. Mekanismer som driver metastaser är intensiva områden av cancerforskningen. Följaktligen effektiva analyser mäter metastaserande bördan i avlägsna områden av metastaser är av avgörande betydelse för cancerforskningen. Utvärdering av lungmetastaser i brösttumörmodeller i allmänhet utförs av grov kvalitativ observation av lungvävnad efter dissektion. Kvantitativa metoder för att utvärdera metastaser är för närvarande begränsad till ex vivo och in vivo imaging baserade tekniker som kräver användardefinierade parametrar. Många av dessa tekniker är på hela organismen nivå snarare än cellnivå 3-6. Även nyare avbildningsmetoder som använder multi-foton mikroskopi kan bedöma metastasis på cellnivå 7, dessa mycket elegant förfaranden är bättre lämpade för att utvärdera mekanismer för spridning snarare än kvantitativ bedömning av metastaserande bördan. Här är en enkel in vitro metod för att kvantitativt bedöma metastaser presenteras. Med hjälp av kvantitativa realtid PCR (QRT-PCR), kan tumörcellspecifika mRNA detekteras i musen lungvävnad.
Introduction
QRT-PCR-analys föreslås som en metod för att bedöma tumörmetastaser. Denna metod föreslås som ett alternativ för användare som är intresserade av att utvärdera metastaser men får inte ha tillgång till särskild utrustning som in vivo imaging utrustning eller fluorescens kan stereoskop. En diskussion av vanliga metoder presenteras följt av en demonstration för hur QRT-PCR-analys kan användas antingen som en separat eller som en följeslagare metod för att utvärdera metastaser. Detta förfarande har potential att ge en kvantitativ analys av metastaserande bördan.
Standardmetoder av grov analys, inklusive visualisering av lungorna under ett stereomikroskop samt seriesnittning följt av hematoxylin och eosin (H & E) färgning av lungvävnad, är kvantifierbara men är starkt beroende av användardefinierade parametrar för att räkna 2-5. Vid bedömningen av hela lungor med hjälp av ett stereomikroskop, bara stor yta metastaser är Visible och analys kräver utredaren att ha rimlig kunskap om lung anatomisk struktur för att avgöra vad som utgör en metastatisk skada. Fluorescensmärkning av tumörceller med en markör såsom GFP och användning av ett stereomikroskop som innehåller en ljus kub med lämplig excitering / emissionsmaxima (t.ex. nära 470/510 nm för GFP) bistår i denna process, men endast ytan tumörnoduli är detekterbara . Dessutom, fluorescens från blodsmitta, som är synlig under samma parametrar som GFP, kan leda till falsk identifiering av eventuella metastaser.
Sektionering i lungorna följt av H & E färgning att visualisera lungmetastas är en användbar metod för att utvärdera mikrometastaser och andra mikroskopiska processer inklusive immuncellinfiltration men ofta kräver användning av hela lungvävnad för paraffininbäddning, sektionering och färgningsprocedurer. Därför, förfaranden nedströms är inte idealiskt följer denna metod. Även kvantifierbar, kräver denna procedur utredaren att utvärdera ett stort antal färgade lungsektioner per djur för att säkerställa att analysen står för hela 3D-strukturen för lungan. Därför är denna typ av undersökning är tidskrävande, kan leda till att räkna fel, och analys är starkt beroende av utredare diskretion.
Flera in vivo avbildningstekniker (t.ex. MR, PET, SPECT) används idag för att utföra eller testa biologiska processerna i experimentella gnagarmodeller 8. In vivo självlysande avbildning är en vanlig metod för att få en grov bild av metastaser 9. Denna teknik tillämpas allmänt för att utvärdera närvaron av luciferasaktivitet reporteraktivitet på grund av ansamling av tumörceller, vilka är konstruerade för att innehålla ett luciferas responselement, som finns i specifika organ såsom bröstkörteln efter tumörcell implantation och lungan vid spontan metastas 10. Visualisering av luciferas reporteraktivitet induceras genom närvaro av luciferin substrat (D-luciferin). Luciferas katalyserar den oxidativa dekarboxyleringen av D-luciferin att oxyluciferin generera bioluminiscens. Medan informativ, är denna metod begränsas av flera faktorer, inklusive substrat stabilitet (dvs. kort halveringstid), lämplig fördelning av substrat som beror på hur den levereras till försöksdjur, och låg känslighet för upptäckt 9. En huvud merit denna teknik är att den är icke-invasiv, kan utföras på levande djur, och kan leda till upptäckt av tumörcellmetastaser i flera organ som kanske inte har normalt skördas vid dissektion 9,10.
En positiv aspekt av in vivo avbildningstekniker är att lungvävnaden är ostört möjliggör sekundära förfaranden som paraffininbäddning eller presenteras här, QRT-PCR-analys. Men eftersom QRT-PCR är theoretically ett mer känsligt mått på detektion, kan brutto utvärderingen inte avslöja lågt antal tumörceller som är närvarande i lungan. Medan användbara, kan de avbildningstekniker som beskrivits ovan vara substituerad eller kompletteras med QRT-PCR-metod som för närvarande beskrivs. QRT-PCR har potential att ge ett känsligt mått på tumörhärrörande mRNA i en lunga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer de riktlinjer och djurvårds standarder för den medicinska universiteten av South Carolina (MUSC) och dess Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Lung Dissection
- Brösttumör dissektion (tillval beroende på studie mål och om primärtumören analys eller svansveninjektion utfördes).
- Euthanize musen med en dödlig dos av isoflurananestesi enligt IACUC och universitet reglering. Bekräfta eutanasi genom kirurgisk förskjutning.
- På skum ombord, stift med dissektion stift genom att placera musen på rygg med benen spridning.
- Spraya mus med 70% etanol.
- Använd pincett, ta tag i nedre delen av djuret i centrum.
- Med hjälp av sax, skär uppåt mot halsen genom huden, försiktigt så att inte tränga igenom bukhålan av musen.
- Skär ner huden vid armar och ben för att avslöja tumörvävnad.
- Dissekera ut tumörvävnad och preserve med lämplig metod, såsom frysning eller fixering, för vidare analys (inte diskuteras vidare i detta protokoll).
- Lungvävnad dissektion.
- Om tumörvävnad skördades såsom beskrivits ovan, sätta fingret på något överflödig hud.
- Använd pincett, ta tag bukhinnan vid nedre änden av djuret och börjar såga upp mot basen av halsen.
- Skär försiktigt längs vänster och höger sida av bröstkorgen var noga med att undvika att bryta de blodkärl som kan blöda in i brösthålan. Ta bort revbenen genom att skära till vänster och höger genom membranet och övre delarna av bröstkorgen.
- Använd pincett tag i luftstrupen av musen och dra framåt.
- Sever luftstrupen med dissektion sax och ta bort lungor från mus.
Obs: Hjärtat får sitta kvar till lungan. Om detta inträffar, noggrant dissekera hjärta bort från lungorna var noga med att samla alla fem lober (se figur 1 - Tvätta försiktigt med PBS för att avlägsna överskott blod.
- Brutto utvärdering av lungvävnad.
- Alternativ 1: In vivo imaging.
- För luciferas avbildning, ~ 10 min före avbildning, ge djuren en 150 mg / kg dos av luciferin genom intraperitoneal (ip) injektion. Bild lungorna in vivo i bedövade djur eller vid avlägsnande efter dissektion (Figur 2) 5.
- Alternativ 2: Brutto utvärdering.
- Undersök lungor enligt stereo mikroskop för att visualisera tumörnoduler. Obs: Om celler är GFP märkt, kan en fluorescens kapabel stereomikroskop som innehåller en ljus kub med den lämpliga maxima excitation / emission (t.ex. nära 470/510 nm) för att detektera GFP användas för att undersöka lungorna stereoskopiskt för fluorescens före bearbetning.
- Om lungorna skall analyseras omedelbart, gå vidare till "RNA Isolering avsnittet. Annars snap frys vävnad med hjälp av flytande tvid kväve eller torris. Förvara vid -80 ° C.
- Alternativ 1: In vivo imaging.
2. RNA-isolering
Obs: För representativ analys, isolerades RNA med hjälp av en RNA-isoleringskit (se Materials List). Medan den nuvarande analysen använder en viss tillverkare produkt, en mängd olika isoleringssatser finns tillgängliga från flera välrenommerade leverantörer. Dessutom kan icke-kit baserade centrifuge metoder är också ett alternativ. cDNA bör även framställas från en positiv kontroll RNA-prov, såsom en cellinje eller plasmid, för standardkurva analys. Alternativt kan en positiv kontroll som är specifik för primem sonduppsättningen kan köpas (se Material lista).
- Om du använder tidigare fryst vävnad, samla fryst vävnad på torris.
- Homogenisera vävnad med användning en av följande metoder såsom: mortel slipning utförs för hand över torris efter frysning vävnad i flytande kväve; vävnadshomogenisator eller mekanisk dissociation anordningper tillverkarens förslag; sonikering eller annan föredragen metod.
Obs: För representativ analys, är den lämpligaste metoden för homogenisering ultraljudsbehandling.- För analysen i fig 3, förbereda lysbuffert (tillgänglig i RNA-isoleringskit) och 2-merkaptoetanol vid ett förhållande av 20 | il 2-merkaptoetanol under varje 1 ml lyseringsbuffert. Resuspendera vävnad i 300 pl lysbuffert kompletterad med 2-merkaptoetanol per 30 g vävnad och låt ligga i 10 sekunder med sonikator inställd på 30% amplitud.
- Om du använder mortel, återsuspendera marken vävnad i 300 pl lysbuffert efter slipning.
- Lägg 10 pl proteinas K till 590 | il TE-buffert (10 mM tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Lägg 600 pl proteinas K-lösning till varje 300 | il (dvs. för varje 30 mg) vävnad. Inkubera i 10 min vid RT.
Obs: koktiden kan variera. - Centrifugera proverna vid ≥13000 g under 10 minuter för att avlägsna skräp.
- Överför supernatanten till nya rör.
- Lägg 450 ul etanol (96% -100%) för varje 900 | il av supernatanten för att fälla RNA.
- Överför 700 | il av lysatet / etanol blandning till kolonnen.
- Centrifugera proverna vid ≥13,000 g under 1 min för att binda RNA till kolonnen.
- Kasta flytande avfall och lägga resterande supernatanten till kolonnen och snurra igen.
- När all lysatet spanns genom kolonnen, tillsätt 350 pl av tvättbuffert 1 till den övre delen av kolonnen och centrifugera proverna vid ≥13,000 g under 30 sek.
- Kasta vätska från kolonnen och ersätta övre delen.
- Förbered DNas genom att blanda 5 enheter av DNas I-enzym med 5 ul av 10 x DNas och 40 | il av DNas / RNas fritt vatten per prov (total volym av 50 | il / prov).
- Tillsätt 50 pl av DNas blanda till varje kolonn och inkubera under 15 min vid RT.
- Lägg 350 il tvättbuffert 1 till kolonnen och centrifugera sampel på ≥13,000 g under 30 sek.
- Kasta vätska från kolonnen och ersätta övre delen.
- Lägg 600 pl av tvättbuffert 2 till kolonnen och centrifugera 30 sek vid ≥13,000 g.
- Kasta vätska från kolonnen och ersätta övre delen.
- Tillsätt 250 pl av tvättbuffert 2 och centrifugera i 2 min vid ≥13,000 g.
- Sätt en del av kolumn i nya provrör och släng gamla provrör.
- Lägg 50-100 pl RNas / DNas fritt vatten till kolonn och inkubera i 1 minut.
- Spin för en min vid ≥13,000 g.
- Re-run uppsamlade eluatet genom kolonnen för att öka RNA avkastning.
- För omedelbar användning, hålla prover på is och fortsätt till kvantifiering. För användning senare, snap frysa på torris eller flytande kväve. Förvara vid -80 ° C frys tills de behövdes.
3. Första strängsyntes
Obs: För representativ analys, var omvänt transkriptas (RT) reaktion utfört en FFÖRSTA Strand cDNA syntes kit avsett för QRT-PCR (se Material List).
- Om proverna tidigare insamlade, tina rör på is.
- Mät RNA mängd med hjälp av en spektrofotometer.
- Använda 0,5-2 pg av totalt RNA, utföra första strängsyntes användning av omvänt transkriptas för att generera cDNA lager.
- I sterila, RNas / DNas-fritt PCR-rör / plattor Bered reaktionsblandningen (Tabell 1). Blanda försiktigt och centrifugera. Programmera en standard-PCR-maskin (tabell 2).
- Späd färdiga reaktion på önskad volym (i allmänhet 50-100 ul) med steril nukleasfritt vatten.
4. Real-time PCR
Obs: För representativ analys var SYBR grön användes. Emellertid kan vilken som helst lämplig metod vara substituerad vid användarens diskretion.
- Med hjälp av en positiv kontroll cDNA, skapa en standardkurva för varje primer set.
- För analys visat in Figur 3, förbereda standardkurvan för mänsklig HER2 med tillverkarens rekommenderade positiv kontroll cDNA (se Materials List). För mus GAPDH, använda den negativa kontrollen lunga cDNA för att generera en standardkurva. För varje sond, seriellt späda cDNA 1: 4 för att generera 5 standard.
- Beräkna det totala antalet prover, vilket bör inbegripa standardkurvan och experimentella prover.
Obs! För den analys som beskrivs här, var 2-3 experimentella replikat per prov analyseras. Standardkurva analys utfördes för att generera en enkel linjär regressionsmodell som kan tillämpas för att fastställa den relativa mängden av HER2 och GAPDH per prov för att beräkna slut normaliserad kvantitet. Denna analys kommer också att se till att primern effektivitet är tillräcklig för analys till hands. - I ett sterilt, RNas / DNas-fritt rör, förbereda huvudblandning (tabell 3).
- Beräkna masterblandning Amounton per prov. Skala upp för mer än ett prov. Använd en Master Mix för varje experimentell gen av intresse, liksom en intern kontroll, såsom GAPDH. Använd primrar för GAPDH vid en slutlig koncentration av 200 nM.
Obs: Den interna kontrollen är särskilt användbar när man försöker skilja mellan människa och mus cellursprung.
Obs: Primer koncentration för HER2 optimerades och bestäms av tillverkaren.
- Beräkna masterblandning Amounton per prov. Skala upp för mer än ett prov. Använd en Master Mix för varje experimentell gen av intresse, liksom en intern kontroll, såsom GAPDH. Använd primrar för GAPDH vid en slutlig koncentration av 200 nM.
- Förbered testplatta innehållande 1 pl cDNA som motsvarar varje standard eller experimentellt prov. Fördela minst en cDNA prov / brunn för varje primer sond. Lägg 19 il huvudblandning per brunn för varje primer sond.
Anmärkning: För de representativa data i fig 3, var cDNA-prover analyserades i duplikat för varje primer prob och visas som medelvärdet av de två proverna. - Kör reaktion i QRT-PCR-maskin med användning rekommenderas eller tidigare testats PCR-protokollet. Se tabell 4 Figur 3 och Figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utöver den tid det tar att utföra den initiala inokuleringen av tumörceller in i försöksdjuret och om utförande, är primärt in vivo tumöranalys, vävnaden skörd, RNA-isolering, och QRT-PCR-analys en 1-2 dagars förfarande (Figur 1) .
Ett exempel av brutto analys är självlysande avbildning att utvärdera tumörceller i lungvävnad. Här var en brösttumörbildning experiment för att utvärdera om en investigational medel som riktar gapet korsningen protein connexin43, kallad ÄRV1 skulle försämra spontan metastas av 4T1-luc brösttumörceller till lungorna. Efter flera veckors behandling, djur som fick placebo eller testmedlet injicerades med luciferin och avlivades. Vid dissektion var lungor visualiseras för luciferas bioluminiscens. Från representativa bilder verkar det som lungor från drogenbehandlade djur är negativa med avseende på luciferasaktivitet som anger att inga tumörceller är närvarande i lungan, vilket antyder en hämning av metastas efter ÄRV1 behandling (Figur 2A). Huvudsyftet med dessa representativa bilder är att visa att självlysande avbildning är en lämplig metod för detektion för metastaser. Men vid närmare undersökning av H & E delar av lungorna från djur som behandlats med ÄRV1 har mikrometastaser identifierades som inte belyses av luciferas imaging (figur 2B), kanske tyder på att denna typ av avbildning kanske inte tillräckligt känsliga för att detektera låga antal tumör celler inbäddade i lungan. Helst skulle en följeslagare analys för QRT-PCR utföras för att bekräfta dessa resultat.
QRT-PCR-analys som presenteras här använder en sond specifik för humant HER2 att detektera humana tumörceller i lungan från HER2 + JIMT-1-celler somursprungligen transplanteras in i bröstfettkudden av värddjur (Figur 3). Metastaser inträffade spontant efter tumörutveckling. Vid dissektion, när den betraktas under ett stereomikroskop, observerades inga grovt synliga metastaser observeras på någon av lungorna. Emellertid, baserat på den efterföljande QRT-PCR-analys visar det sig att två av de elva lungor skördats från tumörbärande djur hyste metastaser, betecknade med pilar i fig 3, vilket tyder på att tumörceller som inte upptäcks av visualisering är närvarande. cDNA som härletts från en bit av JIMT-1-härledda tumör användes som en positiv kontroll för HER2-expression (Figur 3, (+)) och en lunga från en mus som inte injicerades med tumörceller användes som en negativ kontroll (figur 3, (-)). En mus specifik sond för GAPDH användes som en intern kontroll för att bestämma andelen av humana tumörceller till total mus lungvävnad. Den positiva kontrollenprov normaliserades till GAPDH nivåerna från kontroll lungan som en referens. En alternativ normalisering strategi skulle vara i genomsnitt mängden GAPDH i alla lungprover att förvärva mer konsekventa normaliseringsnivåer för kontrollprover. Alternativa prober för icke-mus och icke-humana gener, såsom GFP kunde ersättas för att detektera tumörceller som har märkts i enlighet med detta, före införandet i musen.
En sekundär analys utfördes också för att åstadkomma en relativ kvantifiering av totala antalet tumörceller närvarande i lungan. Dessa resultat visas i figur 4. Här, var en standardkurva analys beredd att bestämma den relativa HER2 kvantitet normaliserad till muslunga GAPDH i en cellnummerserier. I teorin ger detta forskaren att bestämma den relativa mängden av HER2 i 1x10 6, 1x10 5, 1x10 4, 1x10
Figur 1. Schematisk representation av lung dissekering och analys. Den muslunga innehåller 5 lober, såsom indikeras av infällningen förstorade ritningen. Från dissektion analysen QRT-PCR proceduren tar vanligtvis 1-2 dagar att slutföra.ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Brutto analys av metastaser. (A) Representativa självlysande bilder av lungorna från djur som injicerades med 4T1-luc celler och behandlades med antingen placebo eller en investigational drog som kallas ÄRV1 som riktar gapet korsningen proteinet connexin43. (B). Representant H & E del av en mikrometastas i lunga av ett djur med en 4T1 tumör som behandlades med ÄRV1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representant QRT-PCR-analys. Stapeldiagramrepresenterar de kvantifierade data från QRT-PCR-analys av humant HER2, en gen som föreligger i JIMT-1 human bröstcancer cellinje. Humana HER2-nivåer i lungan är normaliserade till mus-GAPDH. (+) Betecknar positiv kontroll. (-) Betecknar negativ kontroll. Resultaten plottas på en log-skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa QRT-PCR-analys från cell nummeranalys. (A) Diagram representerar HER2 nivåer i förhållande till cellantalet kvantitet JIMT-1-celler från 1x10 6 till 10 celler. (B) Stapeldiagram representerar kvantifierade data från QRT-PCR-analys av humant HER2, en gen som föreligger i JIMT-1 human bröst kancer-cellinjen. Humana HER2-nivåer i lungan är normaliserade till mus-GAPDH. (+) Betecknar positiv kontroll. (-) Betecknar negativ kontroll. Resultaten plottas på en log-skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mall-RNA | 0,5-2 ^ ig |
| iScript Supermix | 4 | il / prov |
| Nukleasfritt vatten | upp till 20 | il / prov |
Tabell 1. First Strand Synthesis reaktionsblandningskomponenter (steg 3.3.1).
| Steg 1: 25 ° C | 5 min |
| Steg 2: 42 ° C | 30 min |
| Steg 3: 85 ° C (terminering) | 5 min |
Tabell 2. PCR-betingelser för First Strand Synthesis (steg 3.3.3).
| iTAQ Master Mix | 10 | il / prov |
| Primer mix | 1 | il / prov |
| upp till 20 | il / prov |
Tabell 3. realtids-PCR-reaktionsblandning komponenter (steg 4,3).
| Steg 1 | Aktivering | 95 ° C | 2 min | 1 cykel |
| Steg 2 | Denaturering | 95 ° C | 5 sek | 40 cykler |
| Glödgning / förlängning | 60 ° C | 30 sek | ||
| Steg 3 | Smält Curve (tillval) | 65-95 ° C (0,5 steg) | 5 sek / steg </ td> |
Tabell 4. realtid PCR-betingelser (steg 4,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver användningen av QRT-PCR för att utvärdera juver tumörcellmetastas till lungan med hjälp av en xenograft musmodell. Det medges att andra tekniker, inklusive självlysande bildbehandling, finns tillgängliga och är också effektivt för att upptäcka metastaser trots sina egna värderingar och begränsningar. De data som presenteras tyder på att QRT-PCR ger en effektiv åtgärd för att detektera tumörhärrörande mRNA inom lungvävnad för kvantifiering av den totala metastaser. Det föreslås att QRT-PCR-analys ger en sekundär metod som kan komplettera eller utföras i stället för dessa avbildningstekniker. Denna teknik kan vara bäst lämpad för forskningsmiljöer med begränsad tillgång till vissa typer av utrustning eller för forsknings- grupper med särskilda intressen i metastaserande börda, men inte detaljerade mekanistiska studier.
Medan informativ, QRT-PCR-analys som beskrivs här har begränsningar. Det är inte möjligt att utföra ytterligare nedströmsanalys, inklusive immunohistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF) färgning eftersom hela lungvävnad används för RNA-isolering. Men om ihopkopplade med en in vivo imaging teknik lungvävnaden kan isoleras efter imaging att utföra denna sekundära typen av analys. Dessutom är denna teknik begränsad till detektering mRNA och således proteinanalys är inte möjlig om inte en multi-prep-isoleringskit användes för att framställa den lungvävnad. Analysen av resulterande proteinet är fortfarande begränsad till att behöva utvärdera en total proteinblandning som innehåller tumören och lungvävnad allt i ett, medan IHC / IF tillåter användaren att avgränsa proteiner färgade i tumörvävnad från färgning finns i musvävnad baserad på visualisering av IHC / IF-färgning. Alternativ till att använda hela lungan, bibehålla hälften av lungvävnad för andra analyser såsom histologi kan vara fördelaktigt, men riskerar att motstridiga slutsatser om metastaser identifieras i en del av lungan och inte the andra.
Flera punkter i modifiering och felsökning rekommenderas. Noggrannheten för QRT-PCR-data som är beroende av den primer-prob som är vald för analysen och optimering av sönder rekommenderas inklusive användning av en lämplig standardkurva Analys för transkriptet kvantifiering. Dessutom är det viktigt att mäta kvaliteten av RNA som är isolerad. Över digestion av vävnaden med proteinas K kan minska RNA-kvaliteten och därmed optimering rekommenderas baserat på den specifika vävnad av intresse och ett förfarande för RNA-beredning. Att välja en lämplig referenskeeping-genen är också viktigt. Medan GAPDH är en vanligt förekommande referens gen, varje gen serverar en normal funktion i cellen som kan ändras på grund av experimentella betingelser (dvs. genetisk modifiering av värddjur, såsom gen knockout) och därmed alternativa möjligheter underlättar. Vissa gemensamma referens gener som rapporteras ha allestädes närvarande expressjon och låg variationen i mängd är de gener som kodar TATA-box bindande protein (TBP), retinitis pigmentosa 2 (RP2), Actin-liknande protein (Act) och Tubby ömsesidig transkriptionsfaktor (Tub) 11. Vidare är de kritiska steg som garanterar exakt analys inkluderar noggrann dissektion och tvättning av lungan (steg 1.2.2-1.2.6), korrekt kvantifiering av den totala RNA som isolerats (steg 3,2), och exakt pipettering under QRT-PCR inställning (steg 4,4). Användning av en repetitionspipett kan underlätta denna process.
Sammanfattningsvis syftar detta protokoll för att visa att QRT-PCR är en kvantifierbar metod för att identifiera lungmetastaser. Både positivt värde och begränsningar identifieras med hjälp av detta förfarande och det kan vara bäst lämpad att paras ihop med en sekundär analysmetod. Däremot kan denna metod vara en rättfram procedur för kvantifiering för de forsknings laboratortalet med särskilda forskningsbehov eller brist på omfattande utrustning för att undersöka metastaser. . Framtida tillämpningar av denna metod innefattar modifiering för att leta efter metastaser i målorgan utanför lungan, såsom lymfkörtel eller hjärnan, som är andra vanliga platser av metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ESY och MAA är inte anställda av FirstString Research Inc. och inte ha något ekonomiskt intresse i bolaget. FirstString Research Inc. gav luciferas uppgifter bildbehandling som presenterades i detta manuskript. GSG är VD och koncernchef för FirstString Research. CLG är anställd hos FirstString Research. GSG och CLG har optioner emitterade av FirstString Research.
Acknowledgments
Den Yeh labbet stöds av forskningsmedel från ett American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) tilldelas den Hollings Cancer Center vid MUSC genom forskningsmedel från en Department of Defense bidrag (W81XWH-11-2- 0229) på MUSC, och en utmärkelse från Concern Foundation (till ESY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J.
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).
- Saxena, M., Christofori, G.
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).
- Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis. Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).
