Summary
这个协议描述了如何使用定量实时PCR（QRT-PCR），以检测表示内的小鼠肺组织转移的肿瘤细胞特异性mRNA。
Abstract
转移性疾病是从主癌症部位 到远处器官恶性肿瘤细胞的扩散和是癌症相关死亡1的首要原因。转移扩散共同位点包括肺，淋巴结，脑，骨和2。机制，推动转移是癌症研究的激烈的领域。因此，有效的试验来测量转移性负担转移遥远的站点是有助于为癌症研究。一般是由以下解剖定性观察肺组织的总评价进行乳腺肿瘤模型肺转移。评估转移的定量方法目前仅限于体外 ，并在需要的用户定义的参数基于活体成像技术。许多这些技术是在整个生物体水平，而不是在细胞水平3-6。虽然利用多光子显微镜较新的成像方法能够评估METASTASIS在细胞水平7，这些高度优雅的程序更适合于传播评估机制，而不是转移负担的量化评估。这里，一个简单的体外方法定量评估转移呈现。利用定量实时PCR（QRT-PCR），肿瘤细胞特异性mRNA可以内的小鼠肺组织中检测到。
Introduction
QRT-PCR分析，提出作为评估肿瘤转移的方法。这种方法被提出作为该有兴趣评估转移，但可能无法获得特定设备，例如在体内成像设备或荧光能立体镜用户的替代。的常用方法的讨论，提出后跟一个示范如何QRT-PCR分析可以使用，也可以作为一个单独的或作为伴侣方法来评价转移。此过程有可能提供的转移性负担进行定量分析。
总分析的标准方法，包括肺的立体显微镜下的可视化以及连续切片随后苏木精和曙红肺组织（H＆E）染色，可以量化但在很大程度上依赖于用户定义的参数，用于计数2-5。在评估整个肺使用立体显微镜，只有大面积转移是VISI竹叶提取和分析需要研究者具有肺解剖结构的合理的知识来确定什么构成转移性病灶。肿瘤细胞与一个标记例如GFP和使用包含光立方与适当的激发/发射最大值（如邻近五百一十分之四百七毫微米的GFP）在立体显微镜的荧光标记协助在此过程中，但只有表面肿瘤结节是可检测的。此外，从血液污染，这是根据相同的参数的GFP可见荧光，可能会导致可能的转移病灶误识别。
切片肺其次是H＆E染色可视化肺转移是评价微转移等微观过程，包括免疫细胞浸润的有效方法，但往往需要利用整个肺组织石蜡包埋，切片，和染色程序。因此，下游的过程是不理想的下面这个实现方法具ð。虽然量化，这个过程需要研究者评估了大量的每只动物染色肺切片，以确保分析占肺的整个3D结构。因此，这种类型的检查非常耗时，可能会导致计数误差，并分析在很大程度上依赖于研究者决定。
几个体内成像 技术 （例如MRI，PET，SPECT）目前用于执行或在实验啮齿动物模型中进行测试8的生物过程。 体内生物发光成像是用于获取转移9的总图的常用方法。这种技术通常被应用于评估荧光素酶报告活性的存在，由于肿瘤细胞，其工程化以包含一个萤光素酶应答元件，驻留在像后肿瘤细胞植入乳腺以及在自发转移肺特定器官的积累10。可视化的荧光素酶报告活性的由荧光素底物（D-萤光素）的存在下诱发。萤光素酶催化的D-荧光素的氧化脱羧以产生氧化萤光素生物发光。而信息量大，这种方法是由几个因素，包括基片的稳定性（ 即半衰期短），基板，取决于它是如何传递到实验动物的适当分配，并检测9的低灵敏度的限制。一个主要的优点在该技术是，它是非侵入性的，可以在活的动物进行的，并可能导致在多个器官肿瘤细胞转移的检测可能没有被正常收获解剖9,10。
体内成像技术之一积极方面是肺组织不受干扰允许像石蜡包埋次级步骤或如这里提出，QRT-PCR分析。但是，因为QRT-PCR是theoreticaLLY检测的更灵敏的测量，总评价可能不能揭示低号码存在于肺的肿瘤细胞。虽然有用，上述的成像技术可以被取代或补充有目前描述的QRT-PCR法。 QRT-PCR有潜力肺内提供的肿瘤来源的mRNA的一个敏感量度。
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Protocol
该协议遵循的准则和南卡罗来纳州（MUSC）和它的机构动物护理和使用委员会的医科大学（IACUC）动物保健标准。
1.肺解剖
- 乳腺肿瘤切除（可选取决于学习的目标和是否进行原发肿瘤的分析或尾静脉注射）。
- 使用根据IACUC和大学调控致死剂量异氟醚麻醉安乐死鼠标。确认安乐死手术脱位。
- 在泡沫板，针与解剖针通过把鼠标在它的后面有四肢蔓延。
- 喷小鼠用70％的乙醇。
- 使用镊子，把握动物的下部在中心。
- 使用剪刀，剪向上朝颈部穿过皮肤，小心不要刺破腹膜鼠标腔。
- 减少皮肤四肢揭示肿瘤组织。
- 解剖出肿瘤组织和公关通过优选的方法eserve，如冷冻或固定，以供进一步分析（未进一步在这个协议中所讨论的）。
- 肺组织清扫。
- 如果上述肿瘤组织收获，牵制任何多余的皮肤。
- 使用镊子，把握腹膜在动物的下端，并开始朝向颈部的底部切削向上。
- 沿着肋笼小心，以避免切断任何血管可能出血进入胸腔的左，右两侧小心切开。通过切割到左边，并通过肋骨的膜片和上部右去除肋骨。
- 使用镊子抓住老鼠的气管，向前拉。
- 断绝与解剖剪刀气管和鼠标删除肺部。
注意：心脏可能仍然附着到肺。如果发生这种情况，小心地从肺部解剖心脏远小心翼翼地收集所有五个叶片（ 见图 1 - 用PBS轻轻冲洗，去除多余血液。
- 肺组织的总评价。
- 选项1： 在体内成像 。
- 萤光素成像，〜10分钟之前成像，给动物150毫克/公斤剂量的萤光素通过腹膜内（IP）注射。 在体内在麻醉动物或在除去后解剖（图2）5图像肺部。
- 选项2：总的评价。
- 检查体视显微镜下肺可视化的肿瘤结节。注意：如果细胞是绿色荧光蛋白标记的，可以使用含有（邻近五百十分之四百七十毫微米例如 ）一个光立方与适当的激发/发射最大值的荧光立体显微镜能够以检测GFP的检查肺立体对加工前的荧光。
- 如果肺要立即进行分析，进入“RNA提取”部分。否则，使用理屈扣冻结的组织的id氮气或干冰。储存在-80℃。
- 选项1： 在体内成像 。
2. RNA分离
注：对于代表分析，RNA是使用RNA提取试剂盒（见材料清单）隔离。而当前的分析使用一个特定制造商的产品，各种分离试剂盒的可以从多个信誉的供应商。此外，非试剂盒基于离心的方法也是一种选择。的cDNA也应该从一个阳性对照RNA样品制备，例如一个细胞系或质粒，对于标准曲线分析。另外，具体的引物探针组阳性对照可以购买（见材料清单）。
- 如果使用以前冰冻组织，收集干冰冷冻组织。
- 均质化使用以下方法如之一组织：研钵和杵研磨冷冻的组织在液氮中后由手工进行过度干冰;组织匀浆器或机械分离装置按照制造商的建议;超声处理，或其他的优选的方法。
注：对于代表分析，同质化的首选方法是超声波。- 对于图3中所作的分析，制备裂解缓冲液（在RNA分离试剂盒中提供）和2-巯基乙醇的比率20微升2-巯基乙醇，每1毫升的裂解缓冲液。重悬在组织300微升裂解缓冲液补充有2-巯基乙醇，每30克组织和超声的10秒用超声波仪设定在30％的幅度。
- 如果使用研钵和杵，重悬地面组织在300μl的裂解缓冲液研磨后。
- 加10微升蛋白酶K至590微升的TE缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH值8.0; 1mM EDTA）中。加入600微升蛋白酶K的解决方案，以每300微升（ 即每30毫克）的组织。下室温温育10分钟。
注：消化时间可能有所不同。 - 离心样品在≥13000克10分钟以除去碎片。
- 上清转移到新管。
- 添加450微升乙醇（96％-100％），每900微升上清液来沉淀RNA。
- 传输700微升溶胞产物/乙醇混合到柱上。
- 离心样品在≥13,000克1分钟，从而结合核糖核酸柱。
- 弃废液，加入剩余的上清液列，并再次旋转。
- 一旦所有的溶胞产物通过柱纺丝，添加350微升洗涤缓冲液1到列和离心机样品的上部在≥13,000克30秒。
- 从塔倒掉液体，更换上部。
- 通过混合5单位DNA酶I酶与5微升10×DNA酶和40μlDNA酶/ RNA酶的水每样品（50微升/样品总体积）制备DNA酶。
- 加入50微升DNA酶的组合，以每一列并孵育15分钟，在室温。
- 加入350微升洗涤液1列和离心机SAM普莱斯在≥13,000克30秒。
- 从塔倒掉液体，更换上部。
- 添加600μl的洗涤缓冲液2到列和自旋30秒≥13,000克。
- 从塔倒掉液体，更换上部。
- 加入250微升洗涤液2，离心2分钟≥13,000克
- 把列的一部分进入新的收集管并弃去老收集管。
- 加入50-100微升RNA酶/ DNA酶的游离水柱并孵育1分钟。
- 自旋为1分钟≥13,000克。
- 重新运行，通过柱收集洗脱液，以增加RNA产量。
- 为了立即使用，保持在冰上的样品，并继续定量。以备后用，扣冻结的干冰或液氮。直到需要储存在-80℃冰箱。
3.第一链合成
注意：对于代表分析，逆转录酶（RT）进行反应，一架FIRST链cDNA合成试剂盒专为荧光定量PCR（见材料清单）。
- 如果以前的样品收集，解冻冰上管。
- 使用分光光度计测量RNA的量。
- 使用0.5-2微克总RNA，使用逆转录酶，以产生cDNA的库存进行第一链合成。
- 在无菌的，无RNase /无DNase的PCR管/板，准备反应混合物（ 表1）。轻轻混匀离心。编程一个标准PCR机（见表2）。
- 稀释成品反应使用无菌无核酸酶水所需体积（通常50-100微升）。
4.实时荧光定量PCR
注：对于代表分析，SYBR绿色使用。然而，任何优选的方法可以在用户的决定被取代。
- 使用阳性对照基因，建立了一个标准曲线各引物组。
- 为了显示我的分析Q图3，做标准曲线，使用厂家人 HER2推荐阳性对照基因（见材料清单）。对于小鼠GAPDH，使用阴性对照肺cDNA，以产生标准曲线。对于每个探针，串联稀释的cDNA 1：4至5生成的标准。
- 计算总样品的数量，其中应包括标准曲线和实验样品。
注意：这里的分析说明，每个样品2-3实验重复进行了分析。进行标准曲线分析，以产生可以应用到每个样品，计算最终归量确定HER2的相对量和 GAPDH一个简单的线性回归模型。这种分析也将确保引物效率是足够的分析在手。 - 在无菌的，无RNase / DNase的自由管，制备主混合物（表3）。
- 计算主的Amoun组合牛逼每个样品。向上扩展超过一个样本。使用一个主混合物对于每个实验基因的兴趣，以及作为内部对照如GAPDH。使用的引物为GAPDH以200nM的最终浓度。
注意：尝试人和小鼠细胞来源区分时，内部控制是特别有用的。
注意：引物浓度对 HER2进行优化，由制造商确定。
- 计算主的Amoun组合牛逼每个样品。向上扩展超过一个样本。使用一个主混合物对于每个实验基因的兴趣，以及作为内部对照如GAPDH。使用的引物为GAPDH以200nM的最终浓度。
- 制备试验板包含对应于每个标准或实验样品1微升的cDNA。至少分配1 cDNA样品/孔为每个引物探测器。添加19微升每孔主混合物的每种引物探针。
注意：对于图 3中的有代表性的数据，将cDNA样品一式两份每个引物探针进行了分析和作图作为两个样品的平均值。 - 使用推荐的或以前测试PCR方法在荧光定量PCR仪运行的反应。 见表4 图 3和图 4中的表示数据的PCR方案。
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Representative Results
超出所花费的时间来执行初始接种肿瘤细胞向实验动物和如果执行，主体内肿瘤分析，组织收获，RNA分离，和QRT-PCR分析是一个1-2天的过程（图1） 。
总分析的一个实例是生物发光成像内的肺组织评估肿瘤细胞。这里，一个乳腺肿瘤实验以评估在研药物靶向间隙连接蛋白43，称为ACT1，是否会削弱4T1-的luc乳腺肿瘤细胞对肺的自发转移。数周的治疗，接受安慰剂或测试试剂的动物后注射萤光素和处死。经解剖，肺可视化的荧光素酶的生物发光。从代表图像似乎肺部从药物处理的动物中是阴性的，它表明没有肿瘤细胞存在于肺，暗示ACT1处理（ 图2A）以后的抑制转移荧光素酶的活性。这些代表图像的主要目的是证明生物发光成像是用于检测转移的合适的方法。然而，在对肺的H＆E切片与ACT1处理的动物的详细调查，微转移被确定不是由荧光素酶成像（ 图2B）照亮，也许这表明这种类型的成像的可能不够灵敏地检测低的数字肿瘤细胞包埋肺内。理想的情况下，将被执行的同伴分析QRT-PCR来确认这些结果。
这里介绍的QRT-PCR分析使用的探针特异于人 HER2检测人肿瘤细胞在离her2 + JIMT-1细胞的肺那最初移植入宿主动物的乳腺脂肪垫（图3）。肿瘤的发生发展后发生自发转移。经解剖，在立体显微镜下观察时，没有严重可见的转移灶，观察任何肺部。然而，基于对随后的QRT-PCR分析看来两个11从肺部窝藏转移肿瘤携带动物中， 在图3中将由箭头指示收获，这表明通过可视化被未被发现即，肿瘤细胞的存在。的cDNA从一块JIMT-1衍生的肿瘤衍生的用作阳性对照HER2表达 （图3，（+））和来自小鼠肺，这不是注射肿瘤细胞被用作阴性对照 （图3，（ - ））。甲小鼠特异性探针为GAPDH用作内部对照，以确定人肿瘤细胞对总小鼠肺组织的比例。阳性对照样品被标准化为从控制肺作为基准的GAPDH水平。另一种规范化的策略是在所有的肺标本平均GAPDH的量以获得更稳定的规范化水平对照样品。替代探针用于非小鼠和非人基因，如绿色荧光蛋白可以被取代，以检测已相应标记，在引入到小鼠的肿瘤细胞。
还进行了二次分析，以提供整体存在于肺部肿瘤细胞数目的相对定量。这些结果示于图4，这里，标准曲线分析准备确定归一化到小鼠肺GAPDH在细胞数系列的相对HER2量。在理论上，这允许研究者确定HER2的相对量在1×10 6，1×10 5，1×10 4，1×10
图肺解剖和分析1.示意图，该小鼠肺包含5瓣，通过插入放大图所示。从解剖分析的荧光定量PCR方法一般需要1-2天才能完成。ge.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图转移2.总量分析。 （一）从动物肺注射了4T1-Luc细胞，并与安慰剂或研究药物名为ACT1为目标的缝隙连接蛋白，连接蛋白43治疗的代表性生物发光图像。（B）中的一个微小转移灶的代表H＆E节与用ACT1治疗的4T1肿瘤的动物的肺。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。代表荧光定量PCR分析。条形图表示从人 HER2，一个存在于JIMT-1的人乳腺癌细胞系基因的QRT-PCR分析的定量数据。 人 HER2的水平在肺中标准化为GAPDH鼠标。 （+）表示阳性对照。 （ - ）表示阴性对照。结果绘制在对数尺度。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.从细胞数分析代表性的QRT-PCR分析。（A） 的格拉夫表示从1×10 6至10个细胞的HER2的水平相对于JIMT-1细胞的细胞数量。表示来自所述定量数据（B）的棒图人 HER2的QRT-PCR分析，一个存在于JIMT-1人乳腺癌基因可以CER细胞系。 人 HER2的水平在肺中标准化为GAPDH鼠标。 （+）表示阳性对照。 （ - ）表示阴性对照。结果绘制在对数尺度。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 模板RNA | 0.5-2微克 |
| 的iScript SuperMix混合 | 4微升/样品 |
| 不含核酸酶的水 | 高达20微升/样品 |
表1.第一链合成反应混合物组分（步骤3.3.1）。
| 步骤1：25℃ | 5分钟 |
| 第2步：42℃ | 30分钟 |
| 第3步：85°C（终止） | 5分钟 |
表2. PCR条件的第一链合成（步骤3.3.3）。
| ITAQ预混 | 10微升/样品 |
| 入门驴友 | 1微升/样品 |
| 高达20微升/样品 |
表3.实时PCR反应混合物成分（步骤4.3）。
| 步骤1 | 激活 | 95℃ | 2分钟 | 1周期 |
| 第2步 | 变性 | 95℃ | 5秒 | 40个循环 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 30秒 | ||
| 第3步 | 熔解曲线（可选） | 65-95°C（增量为0.5） | 5秒/步</ TD> |
表4.实时PCR的条件（步骤4.5）。
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Discussion
这个协议描述使用QRT-PCR，以评估乳腺肿瘤细胞转移到使用异种移植物小鼠模型中肺。应当承认，其他技术，包括生物发光成像，都可以，也是有效的，尽管有自己的价值观和限制检测转移。提出的数据表明，QRT-PCR提供了检测肺组织内的肿瘤来源的mRNA的总转移的定量的有效措施。所以建议的QRT-PCR分析提供了，可以补充或代替这些成像技术来执行辅助方法。这种技术可能最适合用于研究有限的环境中获得某些类型的设备或用于研究小组在转移负担的具体利益，但没有详细机理研究。
尽管内容翔实，这里所描述的荧光定量PCR分析有其局限性。这是不可能的，以执行额外的下游分析，包括免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）染色，因为整个肺组织用于RNA分离。然而，如果配对的体内成像技术肺组织可以被分离成像后进行分析的该二次类型。此外，这种技术被限制于检测到的mRNA，从而蛋白质分析是不可能的，除非多制备分离试剂盒用于制备肺组织。所得的蛋白质的分析仍然限于具有以评价总蛋白组合，包括所有在一个肿瘤和肺组织，而IHC / IF允许从小鼠组织中染色发现的基础上描绘染色的肿瘤组织中的蛋白质的用户可视化的IHC / IF染色。替代使用全肺，保持半肺组织用于其它分析，例如组织学可能是有益的，但运行矛盾的结果的风险，如果转移被确定在肺中的一个部分，而不是第E的其他。
建议修改和故障排除的几个点。的QRT-PCR数据的精度取决于被选择用于测定和探针的优化，该引物探针建议包括使用适当的标准曲线分析的转录物定量。此外，为了评估被分离的RNA的质量是很重要的。过度消化组织的用蛋白酶K可降低RNA的质量，因此是基于RNA制备的兴趣和方法的具体组织建议的优化。选择一个适当的持家对照基因也很重要。而GAPDH是一种常用的参考基因，每一个基因供应以可能会由于实验条件改变的细胞中的正常功能，因此替代的选择是有用的（宿主动物如基因敲除的即遗传修饰）。所报告的一些常见参照基因有无处不在快递离子和数量低的变化是编码TATA盒结合蛋白（TBP），视网膜色素变性2的基因 （RP2），肌动蛋白样蛋白（ACT） 和塔比二分转录因子（ 浴池 ）11。此外，这确保准确分析的关键步骤包括肺癌（步骤1.2.2-1.2.6）的精确解剖和洗涤，分离的总RNA的QRT-PCR设置（步骤4.4）中正确定量（步骤3.2），并准确移液。使用重复移液器的可在此过程中提供帮助。
总之，这个协议的目的是证明，QRT-PCR是一个量化的方法，以确定肺转移。两个正值和局限性确定与使用此过程，它可能最适合于与分析的次级方法进行配对。然而，这种方法可能是定量的直线前进过程对这些研究laboratorIES与特定的研究需求或缺乏广泛的设备进行调查转移。 。这种方法的未来应用包括改性寻找转移的靶器官以外的肺，如淋巴结或脑部，这是转移等常见的部位。
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Disclosures
ESY和MAA不受FirstString研究公司聘用，不抱任何经济利益的公司。 FirstString研究公司提供的是在这个手稿提出的荧光素酶成像数据。 GSG是FirstString Research的总裁兼首席执行官。 CLG是FirstString研究的雇员。 GSG和CLG必须通过FirstString研究发行股票期权。
Acknowledgments
在星爷的实验室是支持由美国癌症协会的机构研究基金（IRG-97-219-14）从美国国防部的资助奖励给霍林斯癌症中心MUSC，由科研经费（W81XWH-11-2-科研经费0229） 在MUSC，并通过从关怀基金会（到ESY）裁决。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
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