Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) للكشف عن مرنا محددة الخلايا السرطانية تمثل ورم خبيث في الأنسجة الماوس الرئة.
Abstract
المرض المنتشر هو انتشار الخلايا السرطانية الخبيثة من موقع السرطان الأساسي لجهاز بعيد وهو السبب الرئيسي لسرطان الوفيات المرتبطة 1. وتشمل المواقع المشتركة للانتشار النقيلي الرئة، العقدة الليمفاوية والمخ، والعظام 2. الآليات التي تدفع الانبثاث هي مناطق مكثفة لأبحاث السرطان. ونتيجة لذلك، المقايسات فعالة لقياس العبء المنتشر في مواقع بعيدة الانبثاث هي مفيدة لأبحاث السرطان. تقييم الانبثاث الرئة في نماذج ورم الثدي تتم عادة عن طريق الملاحظة النوعية الإجمالية للأنسجة الرئة بعد تشريح. الأساليب الكمية لتقييم ورم خبيث تقتصر حاليا لخارج الحي وتقنيات التصوير مقرها الجسم الحي والتي تتطلب المعلمات التي يحددها المستخدم. العديد من هذه التقنيات هي في مستوى الحي كله وليس على المستوى الخلوي 3-6. على الرغم من أن وسائل التصوير الجديدة استخدام متعدد الفوتون المجهر قادرة على تقييم metastasis على المستوى الخلوي 7، هذه الإجراءات أنيقة للغاية هي أكثر ملاءمة لتقييم آليات نشر بدلا من التقييم الكمي للعبء النقيلي. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة في المختبر لتقييم كمي لورم خبيث. باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، ويمكن الكشف عن مرنا الخلايا السرطانية معين داخل أنسجة الرئة الماوس.
Introduction
ويقترح تحليل QRT-PCR كوسيلة لتقييم الورم ورم خبيث. ويقترح هذا الأسلوب كبديل للمستخدمين الذين يرغبون في تقييم ورم خبيث ولكن قد لا يكون الحصول على معدات معينة مثل في الجسم الحي معدات التصوير أو مضان المجسام قادرة. وتقدم يتبع مناقشة الأساليب المستخدمة عادة من قبل مظاهرة لكيف يمكن استخدام تحليل QRT-PCR إما منفصلة أو كوسيلة مصاحب لتقييم ورم خبيث. هذا الإجراء لديه القدرة على تقديم تحليل كمي لعبء النقيلي.
الطرق المعيارية لتحليل الإجمالي، بما في ذلك التصور من الرئتين تحت stereomicroscope وكذلك باجتزاء المسلسل تليها الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ من أنسجة الرئة، وقابلة للقياس الكمي ولكن تعتمد بشكل كبير على المستخدم تعريف المعلمات لحساب 2-5. عند تقييم الرئتين بأكملها باستخدام stereomicroscope، الانبثاث السطح الكبيرة فقط هي VISIبليه ويتطلب تحليل المحقق أن لديهم معرفة معقولة من الرئة التركيب التشريحي لتحديد ما يشكل آفة المتنقل. وضع العلامات الفلورية من الخلايا السرطانية مع علامة مثل GFP واستخدام stereomicroscope الذي يحتوي مكعب الضوء مع ماكسيما المناسب الإثارة / الانبعاثات (على سبيل المثال قرب 470/510 نانومتر لGFP) يساعد في هذه العملية، ولكن فقط العقيدات الورم سطح قابلة للكشف . بالإضافة إلى ذلك، مضان من تلوث الدم، وهو أمر واضح تحت نفس المعلمات كما GFP، قد يؤدي إلى هوية مزورة من الآفات النقيلي المحتملة.
باجتزاء في الرئة تليها H & E تلطيخ لتصور الانبثاث الرئة هو طريقة مفيدة لتقييم micrometastases والعمليات المجهرية الأخرى بما في ذلك تسلل الخلايا المناعية ولكن غالبا ما يتطلب استخدام أنسجة الرئة بالكامل لتضمين البارافين، باجتزاء، والإجراءات تلطيخ. ولذلك، الإجراءات النهائية ليست مثالية تتبع هذا methoد. على الرغم من أن قياس الكمي، هذا الإجراء يتطلب المحقق لتقييم عدد كبير من أقسام الرئة الملون لكل حيوان للتأكد من أن التحليل يمثل هيكل 3D كامل من الرئة. ونتيجة لذلك، وهذا النوع من الفحص هو مضيعة للوقت، يمكن أن يؤدي إلى احتساب الخطأ، وتحليل يعتمد بشكل كبير على محقق تقدير.
العديد من تقنيات التصوير في الجسم الحي (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، SPECT) وتستخدم حاليا لإجراء اختبار أو العمليات البيولوجية في نماذج القوارض التجريبية 8. في الجسم الحي التصوير إضاءة الحيوية هو أسلوب شائع استخدامها للحصول على رأي الإجمالي من ورم خبيث 9. يتم تطبيق هذه التقنية بشكل عام لتقييم وجود نشاط luciferase المراسل بسبب تراكم الخلايا السرطانية، والتي صممت لاحتواء عنصر استجابة luciferase المراسل، الموجودة في أجهزة معينة مثل الغدة الثديية بعد زرع الخلايا السرطانية والرئة على الانبثاث عفوية 1وبفعل 0 التصور النشاط luciferase المراسل عن وجود الركيزة وسيفيرين (D-وسيفيرين). luciferase المراسل يحفز نزع الكربوكسيل التأكسدي من D-وسيفيرين إلى oxyluciferin توليد تلألؤ بيولوجي. في حين بالمعلومات، وهذه الطريقة محدودة بسبب العديد من العوامل بما في ذلك استقرار الركيزة (أي قصيرة العمر النصفي)، التوزيع المناسب للالركيزة التي تعتمد على كيفية تسليمها إلى حيوانات التجارب، وانخفاض الحساسية للكشف عن 9. A الفضل الاساسي لهذه التقنية هي أنها غير الغازية، لا يمكن أن يؤديها على الحيوانات الحية، ويمكن أن يؤدي إلى الكشف عن النقائل الخلايا السرطانية في الأجهزة المتعددة التي ربما لم تحصد عادة في تشريح 9،10.
وأحد الجوانب الإيجابية للفي الجسم الحي تقنيات التصوير هو أن أنسجة الرئة ودون أن يمسها السماح للإجراءات الثانوية مثل البارافين التضمين أو المعروضة هنا، تحليل QRT-PCR. ومع ذلك، لأن QRT-PCR هو theoreticaLLY مقياسا أكثر حساسية من الكشف والتقييم الإجمالي قد لا تكشف عن انخفاض أعداد الخلايا السرطانية موجودة في الرئة. وإن كان مفيدا، وتقنيات التصوير المذكورة أعلاه يمكن أن تكون بديلا أو تستكمل مع أسلوب QRT-PCR توصف حاليا. QRT-PCR لديه القدرة على توفير قدر حساسية مرنا المستمدة من ورم داخل الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية والمعايير رعاية الحيوان من كلية الطب بجامعة ولاية كارولينا الجنوبية (MUSC) ورعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).
1. الرئة تشريح
- الثديية تشريح الورم (اختياري اعتمادا على أهداف الدراسة وعما إذا تم إجراء تحليل الورم الرئيسي أو الوريد الذيل حقن).
- الموت ببطء الماوس باستخدام جرعة قاتلة من التخدير الأيزوفلورين وفقا لIACUC وتنظيم الجامعة. تأكيد euthanization بواسطة الخلع الجراحي.
- على مجلس رغوة، دبوس مع دبابيس تشريح عن طريق وضع الماوس على ظهرها مع انتشار أطرافه.
- رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪.
- باستخدام ملقط، فهم الجزء السفلي من الحيوان في المركز.
- باستخدام مقص، وقطع في اتجاه تصاعدي الرقبة من خلال الجلد، والحرص على عدم اختراق التجويف البريتوني من الفأرة.
- خفض الجلد في الأطراف لكشف نسيج الورم.
- تشريح خارج نسيج الورم والعلاقات العامةeserve بواسطة الأسلوب المفضل، مثل تجميد أو التثبيت، لمزيد من التحليل (لم تناقش بشكل أكبر في هذا البروتوكول).
- الرئة تشريح الأنسجة.
- إذا كان حصادها أنسجة الورم كما هو موضح أعلاه، أحدد أي الجلد الزائد.
- باستخدام ملقط، فهم البريتوني في أدنى حد من الحيوان وتبدأ خفض صعودا نحو قاعدة العنق.
- قطع بعناية على طول الجانبين الأيسر والأيمن من القفص الصدري والحرص على تجنب قطع أي الأوعية الدموية التي قد تنزف في التجويف الصدري. إزالة عظام الأضلاع عن طريق خفض إلى اليسار واليمين من خلال الحجاب الحاجز والعليا أجزاء من القفص الصدري.
- باستخدام ملقط فهم القصبة الهوائية من الماوس وسحب قدما.
- قطع القصبة الهوائية مع مقص تشريح وإزالة الرئتين من الفأرة.
ملاحظة: قد تبقى قلب تعلق على الرئة. إذا حدث هذا، تشريح بعناية القلب بعيدا عن الرئتين والحرص على جمع كل خمسة فصوص (انظر الشكل 1 - غسل بلطف مع PBS لإزالة الدم الزائد.
- التقييم الإجمالي للأنسجة الرئة.
- الخيار 1: في التصوير الجسم الحي.
- للتصوير luciferase المراسل، ~ 10 دقيقة قبل التصوير، وإعطاء الحيوانات 150 ملغ / كغ جرعة من وسيفيرين التي داخل الصفاق (IP) حقن. الرئتين الصورة في الجسم الحي في الحيوانات تخدير أو عند إزالة بعد تشريح (الشكل 2) 5.
- الخيار 2: التقييم الإجمالي.
- فحص الرئتين تحت المجهر ستيريو لتصور العقيدات الورم. ملاحظة: إذا الخلايا GFP المسمى، ومضان stereomicroscope قادرة تحتوي مكعب الضوء مع ماكسيما الإثارة / الانبعاثات المناسبة (مثل بالقرب 470/510 نانومتر) للكشف عن GFP يمكن أن تستخدم لفحص الرئتين تجسيمي لمضان قبل المعالجة.
- إذا الرئتين ليتم تحليلها على الفور، انتقل إلى قسم "عزل الحمض النووي الريبي. خلاف ذلك، والمفاجئة تجميد الأنسجة باستخدام LIQUالنيتروجين معرف أو الثلج الجاف. تخزين في -80 ° C.
- الخيار 1: في التصوير الجسم الحي.
2. عزل الحمض النووي الريبي
ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم عزل الحمض النووي الريبي (انظر قائمة المواد). في حين يستخدم التحليل الحالي المنتج مصنع واحد محدد، وتتوفر من عدة بائعين السمعة مجموعة متنوعة من مجموعات العزلة. بالإضافة إلى ذلك، غير طقم-أساليب الطرد المركزي مقرها هي أيضا خيار. [كدنا يجب إعداده من عينة السيطرة RNA إيجابية، مثل خط خلية أو البلازميد، لتحليل منحنى القياسية. بدلا من ذلك، يمكن شراء تحكم إيجابية محددة لتحقيق مجموعة التمهيدي (انظر قائمة المواد).
- في حالة استخدام الأنسجة المجمدة سابقا، وجمع الأنسجة المجمدة على الثلج الجاف.
- التجانس الأنسجة باستخدام إحدى الطرق التالية مثل: هاون ومدقة طحن يؤديها تسليم الثلج الجاف بعد تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. الخالط الأنسجة أو جهاز تفارق الميكانيكيةفي اقتراح الشركة المصنعة. صوتنة، أو الأسلوب المفضل الآخرين.
ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، الأسلوب المفضل من التجانس هو صوتنة.- لتحليل المعروضة في الشكل (3)، وإعداد العازلة تحلل (المنصوص عليها في RNA العزلة عدة) و 2 المركابتويثانول في نسبة 20 ميكرولتر 2-المركابتويثانول لكل 1 مل من تحلل العازلة. الأنسجة resuspend في 300 العازلة تحلل ميكرولتر تستكمل مع 2-المركابتويثانول لكل 30 غرام من الأنسجة ويصوتن لمدة 10 ثانية مع sonicator بنسبة 30٪ السعة.
- في حالة استخدام هاون ومدقة، الأنسجة الأرض resuspend في 300 ميكرولتر العازلة تحلل بعد الطحن.
- إضافة 10 ميكرولتر بروتين K إلى 590 ميكرولتر TE العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA). إضافة 600 ميكرولتر بروتين K الحل لكل 300 ميكرولتر (أي لكل 30 ملغ) من الأنسجة. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
ملاحظة: قد تختلف وقت الهضم. - عينات الطرد المركزي في ≥13000 ز لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام.
- نقل طاف لأنابيب جديدة.
- إضافة 450 ميكرولتر الإيثانول (96٪ -100٪) لكل 900 ميكرولتر من طاف لترسيب الحمض النووي الريبي.
- نقل 700 ميكرولتر من مزيج المحللة / الإيثانول إلى العمود.
- عينات الطرد المركزي في ≥13،000 ز لمدة 1 دقيقة لربط RNA إلى العمود.
- تجاهل النفايات السائلة وبإضافة ما تبقى طاف إلى العمود وتدور مرة أخرى.
- مرة واحدة يتم نسج جميع المحللة من خلال العمود، إضافة 350 ميكرولتر من غسل العازلة 1 إلى الجزء العلوي من العينات العمود وأجهزة الطرد المركزي في ≥13،000 ز لمدة 30 ثانية.
- تجاهل السائل من العمود واستبدال جزء العلوي.
- إعداد الدناز عن طريق خلط 5 وحدات من الدناز I انزيم مع 5 ميكرولتر من 10X الدناز و 40 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز المياه مجانا لكل عينة (الحجم الكلي لل50 ميكرولتر / عينة).
- إضافة 50 ميكرولتر من الدناز مزيج من كل عمود واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- إضافة 350 ميكرولتر من غسل العازلة 1 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي سامPLES في ≥13،000 ز لمدة 30 ثانية.
- تجاهل السائل من العمود واستبدال جزء العلوي.
- إضافة 600 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل 2 إلى العمود وتدور 30 ثانية في ≥13،000 ز.
- تجاهل السائل من العمود واستبدال جزء العلوي.
- إضافة 250 ميكرولتر من غسل العازلة 2 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في ≥13،000 ز.
- وضع جزء من العمود في أنبوب المجموعة الجديدة وتجاهل أنبوب جمع القديم.
- إضافة 50-100 ميكرولتر من ريبونوكلياز / الدناز المياه مجانا لعمود واحتضان لمدة 1 دقيقة.
- تدور لمدة 1 دقيقة في ≥13،000 ز.
- إعادة تشغيل شطافة التي تم جمعها من خلال عامود لزيادة الغلة RNA.
- للاستخدام الفوري، والحفاظ على عينات على الجليد، والشروع في الكميات. لاستخدامها في وقت لاحق، والمفاجئة تجميد الثلج الجاف أو النتروجين السائل. يخزن في الفريزر -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
3. ستراند الأولى التجميعي
ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، تم إجراء الناسخ العكسي (RT) رد فعل Fأوال ستراند [كدنا عدة التوليف مصممة لQRT-PCR (انظر قائمة المواد).
- إذا كانت العينات التي تم جمعها سابقا، ذوبان الجليد الأنابيب على الجليد.
- قياس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام معمل.
- باستخدام 0،5-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، نفذ التوليف حبلا الأول باستخدام الناسخ العكسي لتوليد الأسهم كدنا].
- في العقيمة، وأنابيب ريبونوكلياز / الدناز خالية من PCR / لوحات، وإعداد مزيج التفاعل (الجدول 1). المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي. برمجة جهاز PCR القياسية (الجدول 2).
- تمييع رد الفعل النهائي للحجم المطلوب (عادة 50-100 ميكرولتر) باستخدام معقم nuclease خالية من المياه.
4. في الوقت الحقيقي PCR
ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، وكان يستخدم SYBR الأخضر. ومع ذلك، يمكن أن تكون بديلا أي الأسلوب المفضل في السلطة التقديرية للمستخدم.
- باستخدام [كدنا السيطرة إيجابي، وإنشاء منحنى القياسية لكل مجموعة التمهيدي.
- لتحليل أظهرت طن الشكل 3، وإعداد منحنى قياسي لHER2 البشري باستخدام الصانع الموصى [كدنا السيطرة الإيجابي (انظر قائمة المواد). فأرة الحاسوب GAPDH، استخدم سلبي كدنا] تحكم الرئة لتوليد منحنى القياسية. لكل التحقيق، وتمييع متسلسل [كدنا] 1: 4 لتوليد 5 المعايير.
- حساب عدد من مجموع العينات، التي ينبغي أن تشمل منحنى القياسية والعينات التجريبية.
ملاحظة: للحصول على تحليل ووصف هنا، حللت 2-3 مكررات لكل عينة تجريبية. تم إجراء تحليل المنحنى القياسي لتوليد نموذج الانحدار الخطي البسيط التي يمكن تطبيقها لتحديد القيمة النسبية للHER2 وGAPDH لكل عينة لحساب كمية تطبيع النهائية. وهذا التحليل أيضا ضمان كفاءة التمهيدي كافية للتحليل في متناول اليد. - في العقيمة، ريبونوكلياز / الدناز خالية من أنبوب، وإعداد مزيج الرئيسي (الجدول 3).
- حساب سيد مزيج امونتي في العينة. تصعيد لعينة أكثر من واحد. استخدام مزيج الرئيسي لكل الجينات التجريبي للاهتمام، فضلا عن الرقابة الداخلية مثل GAPDH. استخدام التمهيدي لGAPDH بتركيز نهائي من 200 نانومتر.
ملاحظة: الرقابة الداخلية هي مفيدة بشكل خاص عند محاولة التمييز بين الأصل خلية الإنسان والفأر.
ملاحظة: تم تحسين تركيز التمهيدي لHER2 وتحديدها من قبل الشركة المصنعة.
- حساب سيد مزيج امونتي في العينة. تصعيد لعينة أكثر من واحد. استخدام مزيج الرئيسي لكل الجينات التجريبي للاهتمام، فضلا عن الرقابة الداخلية مثل GAPDH. استخدام التمهيدي لGAPDH بتركيز نهائي من 200 نانومتر.
- إعداد لوحة اختبار تحتوي على 1 cDNAs ميكرولتر المقابلة لكل عينة القياسية أو التجريبية. تخصيص 1 على الأقل كدنا] عينة / جيد لكل التحقيق التمهيدي. إضافة 19 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل بئر لكل التحقيق التمهيدي.
ملاحظة: للحصول على بيانات تمثيلية في الشكل (3)، وقد تم تحليل عينات كدنا] في نسختين لكل التحقيق التمهيدي ورسوم بيانية كمتوسط العينتين. - رد فعل تشغيل في جهاز QRT-PCR باستخدام أوصى أو اختبارها سابقا بروتوكول PCR. انظر الجدول 4 ممثل في الشكل 3 والشكل 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ما وراء الوقت المستغرق لأداء التلقيح الأولي من الخلايا السرطانية في حيوانات التجارب وإذا المنفذ، والابتدائي في تحليل الورم الجسم الحي، وحصاد الأنسجة والعزلة RNA، وتحليل QRT-PCR هو إجراء 1-2 يوم (الشكل 1) .
مثال على التحليل الإجمالي هو التصوير إضاءة الحيوية لتقييم الخلايا السرطانية داخل أنسجة الرئة. هنا، تم إجراء التجربة تكون الأورام الثديية لتقييم ما إذا كان وكيلا الفحص التي تستهدف فجوة بروتين تقاطع connexin43، ودعا ACT1، من شأنه أن يضر الانبثاث عفوية من الخلايا السرطانية الثديية 4T1 لوك إلى الرئة. بعد عدة أسابيع من العلاج، والحيوانات التي تلقت العلاج الوهمي أو وكيل اختبار حقنوا وسيفيرين والتضحية. على التشريح، وتصور الرئتين لتلألؤ بيولوجي luciferase المراسل. من صور تمثيلية يبدو أن الرئتين من المخدراتالحيوانات المعالجة سلبية لluciferase النشاط مما يدل على عدم وجود خلايا الورم موجودة في الرئة، مما يدل على تثبيط الانبثاث بعد العلاج ACT1 (الشكل 2A). والغرض الرئيسي من هذه الصور التمثيلية لإثبات أن التصوير إضاءة الحيوية هو الأسلوب المناسب للكشف عن ورم خبيث. ومع ذلك، عند تحقيق مفصل من H & E أقسام الرئتين من الحيوانات تعامل مع ACT1، تم تحديد micrometastases التي لم تنيره التصوير luciferase المراسل (الشكل 2B)، مما يشير إلى أن هذا النوع من التصوير قد لا تكون حساسة بما يكفي للكشف عن انخفاض أعداد الورم الخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل الرئة. من الناحية المثالية، تحليل مصاحب لQRT-PCR يمكن إنجازها لتأكيد هذه النتائج.
يستخدم التحليل QRT-PCR المقدمة هنا محددة التحقيق لHER2 البشري للكشف عن الخلايا السرطانية البشرية في الرئة من HER2 + JIMT-1 الخلايا التيتم زرع في الأصل إلى لوحة الدهون الثديية من الحيوانات المضيفة (الشكل 3). حدث ورم خبيث تلقائيا بعد وضع الورم. على التشريح، وعندما ينظر تحت stereomicroscope، لم يلاحظ أي الانبثاث واضحة بشكل صارخ على أي من الرئتين. ومع ذلك، استنادا لاحق التحليل QRT-PCR يبدو أن اثنين من الرئتين عشر تحصد من ورم تحمل الحيوانات آوى الانبثاث، الرمز بواسطة سهام في الشكل (3)، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية التي لم يتم كشفها من قبل التصور موجودة. وقد استخدم كدنا] المستمدة من قطعة من ورم JIMT-1 المستمدة كعنصر تحكم إيجابية للتعبير HER2 (الشكل 3، (+)) والرئة من الفئران التي لم تحقن بالمادة الخلايا السرطانية كانت تستخدم كقاعدة للسيطرة سلبية (الشكل 3، (-)). وقد استخدم المسبار الماوس محدد لGAPDH باعتبارها الرقابة الداخلية لتحديد نسبة الخلايا السرطانية البشرية إلى إجمالي نسيج الرئة الماوس. السيطرة الإيجابيةوكانت عينة طبيعية للمستويات GAPDH من الرئة تحكم كمرجع. ان استراتيجية تطبيع بديلة تكون في المتوسط مبلغ GAPDH في جميع عينات الرئة للحصول على مستويات تطبيع أكثر اتساقا لعينات السيطرة. يمكن أن تكون بديلا تحقيقات بديلة لغير الماوس وغير البشرية الجينات، مثل GFP للكشف عن الخلايا السرطانية التي تم المسمى وفقا لذلك، قبل إدخالها في الماوس.
وأجري تحليل الثانوي أيضا لتوفير الكميات النسبية لمجموع الوقت الحاضر عدد الخلايا السرطانية في الرئة. وتظهر هذه النتائج في الشكل (4). وهنا، كان تحليل المنحنى القياسي استعداد لتحديد كمية HER2 النسبية تطبيع للماوس GAPDH الرئة في سلسلة عدد الخلايا. من الناحية النظرية، وهذا يسمح للباحث لتحديد القيمة النسبية للHER2 في 1X10 6، 5 1X10، 1X10 4، 1X10
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للتشريح الرئة والتحليل. وتحتوي الرئة الماوس 5 فصوص، كما يدل على ذلك أقحم الموسع الرسم. من تشريح لتحليل الإجراء QRT-PCR يستغرق عادة 1-2 أيام لاستكمال.ge.jpg مرحبا "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تحليل الإجمالي من ورم خبيث. (A) وصور للإضاءة الحيوية التمثيلية للالرئتين من الحيوانات التي تم حقنها بخلايا 4T1 لوك وتعامل مع إما وهمي أو دعا ACT1 المخدرات الفحص الذي يستهدف البروتين الفجوة مفترق طرق، connexin43. (B). الممثل H & E قسم من نقيلة مجهرية في الرئة حيوان مع 4T1 الورم الذي كان يعالج مع ACT1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الممثل تحليل QRT-PCR البياني. بارتمثل البيانات quantitated من التحليل QRT-PCR من HER2 البشري، هدية الجينات في الثدي البشري خط الخلايا السرطانية JIMT-1. مستويات HER2 الإنسان في الرئة هي تطبيع للماوس GAPDH. (+) يدل على مراقبة إيجابية. (-) يدل على سيطرة سلبية. يتم رسم النتائج على نطاق وسجل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل الممثل QRT-PCR من تحليل عدد الخلايا. (A) رسم بياني يمثل مستويات HER2 فيما يتعلق كمية عدد الخلايا من JIMT-1 الخلايا من 1X10 6-10 خلايا (B) بار الرسم البياني الذي يمثل البيانات quantitated من تحليل QRT-PCR من HER2 البشري، هدية الجينات في الثدي البشري JIMT-1 يمكن خط الخلية حدات خفض الانبعاثات المعتمدة. مستويات HER2 الإنسان في الرئة هي تطبيع للماوس GAPDH. (+) يدل على مراقبة إيجابية. (-) يدل على سيطرة سلبية. يتم رسم النتائج على نطاق وسجل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| RNA قالب | 0.5-2 ميكروغرام |
| iScript Supermix | 4 ميكرولتر / عينة |
| nuclease خالية من المياه | ما يصل الى 20 ميكرولتر / عينة |
الجدول 1. أولا ستراند التجميعي مكونات مزيج رد فعل (الخطوة 3.3.1).
| خطوة 1: 25 ° C | 5 دقيقة |
| خطوة 2: 42 ° C | 30 دقيقة |
| الخطوة 3: 85 ° C (إنهاء) | 5 دقيقة |
الجدول 2. شروط PCR لأول ستراند التجميعي (الخطوة 3.3.3).
| iTAQ ميكس ماجستير | 10 ميكرولتر / عينة |
| مزيج التمهيدي | 1 ميكرولتر / عينة |
| ما يصل الى 20 ميكرولتر / عينة |
الجدول 3. في الوقت الحقيقي مكونات مزيج رد فعل PCR (الخطوة 4.3).
| الخطوة 1 | تفعيل | 95 درجة مئوية | 2 دقيقة | 1 دورة |
| الخطوة 2 | تمسخ | 95 درجة مئوية | 5 ثانية | 40 دورات |
| الصلب / الإرشاد | 60 درجة مئوية | 30 ثانية | ||
| الخطوة 3 | تذوب منحنى (اختياري) | 65-95 ° C (0،5 الزيادات) | 5 ثانية / الخطوة </ td> |
الجدول 4. ظروف PCR في الوقت الحقيقي (الخطوة 4.5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام QRT-PCR لتقييم الثديية ورم خبيث الخلايا السرطانية إلى الرئة باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس. ومن المسلم به أن التقنيات الأخرى، بما في ذلك التصوير إضاءة الحيوية، متاحة وفعالة للكشف عن ورم خبيث الرغم من وجود قيمهم والقيود أيضا. البيانات المقدمة توحي بأن QRT-PCR يوفر تدبيرا فعالا لكشف مرنا المستمدة من ورم داخل أنسجة الرئة لتحديد الكميات من إجمالي ورم خبيث. يقترح هذا التحليل QRT-PCR يوفر طريقة الثانوي التي يمكن أن تكمل أو أن يقوم بدلا من هذه التقنيات التصوير. هذه التقنية قد تكون الأنسب لبيئات البحث مع وصول محدود إلى أنواع معينة من المعدات أو المجموعات البحثية التي لها مصالح محددة في العبء المنتشر ولكن ليس بالتفصيل الدراسات الميكانيكية.
في حين بالمعلومات والتحليل QRT-PCR هو موضح هنا له حدود. فإنه ليس من الممكن أن تؤدي إضافي المصبالتحليل، بما في ذلك المناعية (IHC) أو المناعي (IF) تلطيخ لأنه يتم استخدام أنسجة الرئة بالكامل لعزل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا قرنت مع تقنية التصوير في الجسم الحي أنسجة الرئة قد تكون معزولة بعد التصوير لأداء هذا النوع الثانوي من التحليل. أيضا، هذه التقنية يقتصر على الكشف عن مرنا وبالتالي تحليل البروتين ليس من الممكن ما لم يتم استخدام مجموعة عزلة متعددة الإعدادية لإعداد أنسجة الرئة. تحليل أدى البروتين لا تزال تقتصر على الحاجة إلى تقييم مزيج البروتين الكلي الذي يتضمن نسيج الورم والرئة في كل واحدة، في حين IHC / IF يسمح للمستخدم لتحديد البروتينات الملون في أنسجة الورم من تلطيخ وجدت في الأنسجة الماوس على أساس التصور من تلطيخ IHC / IF. بديل لاستخدام الرئة كلها، والحفاظ على نصف أنسجة الرئة لتحليلها الأخرى مثل الأنسجة قد تكون مفيدة ولكن ينطوي على خطر من النتائج المتضاربة إذا تم تحديد الانبثاث في جزء واحد من الرئة وليس THالبريد البعض.
ينصح العديد من النقاط من تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. دقة البيانات QRT-PCR يعتمد على التحقيق التمهيدي الذي تم اختياره لفحص والأمثل للتحقيقات يوصى بما في ذلك استخدام تحليل المنحنى القياسي الصحيح للحصول على النسخة الكميات. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم لقياس نوعية RNA التي يتم عزلها. الإفراط في هضم الأنسجة مع بروتين K يمكن أن تقلل من نوعية RNA، وبالتالي ينصح الأمثل استنادا إلى أنسجة معينة من الفائدة وطريقة التحضير RNA. اختيار الجينات المرجعية التدبير المنزلي المناسب مهم أيضا. في حين GAPDH هو جين المرجعية المستخدمة عادة، يخدم كل الجينات وظيفة عادية في الخلية التي يمكن تغييرها بسبب الظروف التجريبية (أي التعديل الوراثي للحيوانات المضيفة مثل خروج المغلوب الجينات)، وبالتالي الخيارات البديلة مفيدة. بعض الجينات مرجعية مشتركة يتم الإعلام عنها ليكون صريح في كل مكانايون وتباين منخفضة في كمية هي الجينات التي تكود TATA مربع البروتين (TBP) ملزمة، التهاب الشبكية الصباغي 2 (rp2)، أكتين مثل البروتين (القانون)، وبدين عامل النسخ الثنائي (حوض) 11. وعلاوة على ذلك، والخطوات الحاسمة التي تضمن تحليل دقيق وتشمل تشريح دقيق وغسل الرئة (الخطوة 1.2.2-1.2.6)، الكميات الصحيحة من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة (الخطوة 3.2)، وpipetting لدقيقة أثناء الإعداد QRT-PCR (الخطوة 4.4). استخدام تكرار pipettor يمكن أن تساعد في هذه العملية.
باختصار، يهدف هذا البروتوكول إلى إثبات أن QRT-PCR هو أسلوب كمي لتحديد الانبثاث الرئة. وأشار كل من قيمة إيجابية والقيود مع استخدام هذا الإجراء، وأنه قد تكون الأنسب ليتم إرفاقها مع طريقة الثانوي التحليل. ومع ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن يكون الإجراء على التوالي إلى الأمام من الكميات لأولئك المختبر البحوثالمنشأ مع احتياجات بحثية محددة أو نقص المعدات واسعة للتحقيق ورم خبيث. . وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب تعديل للبحث عن الانبثاث في الأجهزة المستهدفة خارج الرئة، مثل العقدة الليمفاوية أو الدماغ، والتي هي مواقع مشتركة أخرى من ورم خبيث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يعملون ESY وMAA التي كتبها FirstString البحوث وشركة لا يحملون أي مصلحة مالية في الشركة. قدمت FirstString أبحاث شركة البيانات التصوير luciferase المراسل الذي قدم في هذه المخطوطة. GSG هو الرئيس والرئيس التنفيذي لشركة أبحاث FirstString. CLG هو موظف للبحوث FirstString. GSG وCLG ديك خيارات الأسهم الصادرة عن أبحاث FirstString.
Acknowledgments
يتم اعتماد مختبر يه بواسطة تمويل البحوث من الجمعية الأمريكية للسرطان المؤسسية منحة بحثية (IRG-97-219-14) منحت لمركز هولينغ السرطان في MUSC، من خلال تمويل البحوث من منحة وزارة الدفاع (W81XWH-11-2- 0229) في MUSC، وجائزة من القلق مؤسسة (لESY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J.
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).
- Saxena, M., Christofori, G.
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).
- Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis. Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).
