Summary
Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.
Abstract
Metastasen ist die Verbreitung von bösartigen Tumorzellen aus dem Primärkrebs Website zu einem entfernten Orgel und ist die Hauptursache von Krebs Tod 1. Gemeinsame Standorte Metastasierung sind Lunge, Lymphknoten, Gehirn und Knochen 2. Mechanismen, die Metastasen zu fahren sind intensiv Bereichen der Krebsforschung. Folglich effektiven Tests, um metastatic Belastung zu messen in entfernten Stellen von Metastasen sind maßgeblich für die Krebsforschung. Bewertung der Lungenmetastasen in Mammatumor-Modellen wird im allgemeinen grob qualitative Beobachtung von Lungengewebe nach Dissektion durchgeführt. Quantitative Methoden zur Bewertung der Metastasierung sind derzeit auf ex vivo- und in vivo-Bildgebungstechniken, die auf Basis benutzerdefinierter Parameter erfordern beschränkt. Viele dieser Techniken sind in den gesamten Organismus Ebene als zellulärer Ebene 3-6. Obwohl neuere bildgebende Verfahren, die Multi-Photonen-Mikroskopie in der Lage, metas bewertenTASIS auf zellulärer Ebene 7 sind diese sehr elegante Verfahren besser geeignet für die Beurteilung Mechanismen der Verbreitung statt quantitative Bewertung der metastatischen Last. Hier wird ein einfaches in vitro-Verfahren für die quantitative Erfassung der Metastasierung wird vorgestellt. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) kann tumorzellspezifischen mRNA in der Maus-Lungengewebe nachgewiesen werden.
Introduction
QRT-PCR-Analyse als ein Verfahren zur Beurteilung der Tumormetastasierung vorgeschlagen. Dieses Verfahren wird als eine Alternative für die Nutzer, die sich für die Bewertung der Metastasierung sind, aber keinen Zugriff auf bestimmte Geräte wie in vivo bildgebenden Geräten oder einem Fluoreszenz fähig Stereoskop vorgeschlagen. Eine Diskussion der am häufigsten verwendeten Verfahren wird durch eine Demonstration, wie qRT-PCR-Analyse kann entweder als getrennte oder als Begleiter Verfahren zur Metastasierung auszuwerten dieser genutzt werden können gefolgt. Dieses Verfahren hat das Potenzial, eine quantitative Analyse von metastatischen Last bereitzustellen.
Standardverfahren der Brutto-Analyse, einschließlich der Visualisierung der Lunge unter einem Stereomikroskop sowie Serienschnitt gefolgt von Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung von Lungengewebe, quantifizierbar sind, sondern verlassen sich stark auf benutzerdefinierte Parameter zum Zählen 2-5. Bei der Bewertung der gesamten Lunge mit einem Stereomikroskop, nur große Oberfläche Metastasen sind visiBLE und Analyse erfordert die Prüfer, angemessene Kenntnisse der Lungen anatomischen Struktur, um festzustellen, was eine metastatische Läsion haben. Fluoreszenzmarkierung von Tumorzellen mit einem Marker, wie GFP und die Verwendung eines Stereomikroskops, das eine Licht Würfel mit dem geeigneten Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm für GFP) enthält hilft bei diesem Verfahren jedoch nur Oberflächentumorknötchen nachweisbar . Zusätzlich Fluoreszenz von Blutkontamination, die unter den gleichen Parametern wie GFP sichtbar ist, kann zu falschen Identifizierung möglicher Metastasen führen.
Schneiden der Lunge, gefolgt von H & E-Färbung auf Lungenmetastasen zu visualisieren ist eine nützliche Methode, um Mikrometastasen und anderen mikroskopischen Verfahren, einschließlich Immunzellinfiltration zu bewerten, sondern erfordert oft den Einsatz des gesamten Lungengewebe für die Paraffineinbettung, Schneiden und Färbeverfahren. Daher folgt dieser metho sind nachgeschalteten Verfahren nicht ideald. Obwohl quantifizierbaren, erfordert dieses Verfahren den Forscher eine Vielzahl von gefärbten Lungenschnitten pro Tier bewerten, um sicherzustellen, dass die Analyse berücksichtigt die gesamte 3D-Struktur der Lunge. Somit ist diese Art der Untersuchung zeitaufwendig, können Zählfehler zu führen, und die Analyse stützt sich stark auf Ermittler Diskretion.
Mehrere in vivo bildgebenden Verfahren (zB MRT, PET, SPECT) werden gegenwärtig verwendet, durchzuführen oder zu testen, biologische Prozesse in experimentellen Tiermodellen 8. In vivo Biolumineszenz-Bildgebung ist eine gängige Methode verwendet, um eine grobe Ansicht von Metastasen 9 zu erwerben. Diese Technik wird im allgemeinen angewandt, um die Anwesenheit von Luciferase-Reporteraktivität zu beurteilen aufgrund der Akkumulation von Tumorzellen, die dazu entworfen sind, um eine Luciferase-Reaktionselement enthält, die in bestimmten Organen wie der Brustdrüse nach der Tumorzellimplantation und der Lunge, bei einer spontanen Metastasierung aufzuhalten 10. Visualisierung der Luciferase-Reporteraktivität durch die Anwesenheit von Luciferin-Substrat (D-Luciferin) induziert. Luciferase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxyluciferin Erzeugen Biolumineszenz. Während informative wird dieses Verfahren durch mehrere Faktoren, einschließlich Substratstabilität (dh kurze Halbwertszeit), eine angemessene Verteilung des Substrats, wie sie an Versuchstiere geliefert wird, hängt, und geringe Nachweisempfindlichkeit 9 begrenzt. Ein Haupt Vorteil dieser Technik ist, dass sie nicht invasiv ist, kann an lebenden Tieren durchgeführt werden und kann auf den Nachweis von Tumorzellmetastasen in verschiedenen Organen, die nicht normal zu Dissektion 9,10 geerntet führen kann.
Ein positiver Aspekt der in vivo bildgebenden Verfahren ist, dass das Lungengewebe ungestört so dass für sekundäre Eingriffe wie Paraffineinbettung oder wie hier, QRT-PCR-Analyse vorgestellt. Da jedoch QRT-PCR ist theoretically ein empfindlicheres Maß für die Erkennung, kann grobe Auswertung nicht verraten geringe Zahl von Tumorzellen in der Lunge vorhanden. Zwar nützlich, können die oben beschriebenen Bildgebungstechniken ersetzt oder die unmittelbar beschriebene qRT-PCR-Verfahren ergänzt werden. QRT-PCR hat das Potential, ein empfindliches Maß tumorderivierten mRNA innerhalb einer Lunge bereitzustellen.
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Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien und Tierpflegestandards der Medical University of South Carolina (MUSC) und seine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC).
1. Lung Dissection
- Mammatumor-Dissektion (optional je nach Studienziele und ob Primärtumor Analyse oder Schwanzveneninjektion durchgeführt wurde).
- Euthanize Maus mit einer letalen Dosis von Isofluran-Narkose nach IACUC und Hochschulverordnung. Bestätigen Euthanasie durch chirurgische Luxation.
- Am Schaumbrett, Stift mit Dissektion Stifte, indem Sie die Maus auf seiner Rückseite mit Gliedmaßen Verbreitung.
- Spray-Maus mit 70% Ethanol.
- Mit einer Pinzette, fassen Sie den unteren Teil des Tieres in den Mittelpunkt.
- Verwendung Schere, schneiden oben in Richtung auf den Hals durch die Haut, man aufpassen, nicht in die Bauchhöhle der Maus durchbohren.
- Schnitt zurück Haut an den Extremitäten, um Tumorgewebe zu offenbaren.
- Sezieren Tumorgewebe und preserve von bevorzugten Verfahren wie Gefrier- oder Fixierung, zur weiteren Analyse (nicht weiter in diesem Protokoll beschrieben).
- Lungengewebe Dissektion.
- Wenn Tumorgewebe wurde wie oben beschrieben geerntet, festzunageln überschüssige Haut.
- Mit einer Pinzette fassen Peritoneum am unteren Ende des Tieres und beginnen Schneiden nach oben in Richtung auf die Basis des Halses.
- Vorsichtig entlang der linken und rechten Seite des Brustkorbs vorsichtig, um zu vermeiden Trennen keine Blutgefäße, die in die Brusthöhle bluten können geschnitten. Entfernen der Rippenknochen durch Schneiden nach links und rechts durch die Membran und den oberen Abschnitten der Rippen.
- Mit einer Pinzette greifen die Luftröhre des Maus und nach vorne ziehen.
- Sever die Luftröhre mit Dissektion Schere und der Lunge zu entfernen von der Maus.
Hinweis: Das Herz kann in die Lunge angebracht bleiben. In diesem Fall sorgfältig sezieren Herzen von Lunge darauf achten, alle fünf Lappen zu sammeln (siehe Abbildung 1 - Waschen Sie sich leicht mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
- Gross Bewertung der Lungengewebe.
- Option 1: In-vivo-Bildgebung.
- Luciferase-Bildgebung, ~ 10 min vor der Bilderzeugung, geben den Tieren eine 150 mg / kg Dosis von Luciferin durch intraperitoneale (ip) Injektion. Bild Lunge in vivo bei anästhesierten Tieren oder beim Entfernen nach der Sektion (2) 5.
- Option 2: Brutto Auswertung.
- Untersuchen Lunge unter Stereomikroskop zur Tumorknoten zu visualisieren. Hinweis: Wenn Zellen GFP-markierten kann ein Fluoreszenz-Stereomikroskop in der Lage, die eine Lichtwürfel mit dem entsprechenden Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm), um GFP erkennen verwendet werden, um die Lunge für die Fluoreszenz vor der Verarbeitung stereoskopisch untersucht werden.
- Wenn die Lunge sind sofort analysiert werden, ist dem Kapitel 'RNA Isolation' fortzufahren. Andernfalls Snap freeze Gewebe unter Verwendung liquid Stickstoff oder Trockeneis. Bei -80 ° C.
- Option 1: In-vivo-Bildgebung.
2. RNA-Isolierung
Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde RNA mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit (siehe Materialliste) isoliert. Während die aktuelle Analyse eines bestimmten Herstellers Produkt verwendet, eine Vielzahl von Isolation Kits sind von verschiedenen namhaften Herstellern. Zusätzlich werden nicht-Kit auf Basis Zentrifugationsverfahren auch eine Option. cDNA sollte auch von einer positiven Kontroll-RNA Probe hergestellt werden, beispielsweise eine Zelllinie oder ein Plasmid, für Standard-Kurvenanalyse. Alternativ kann eine positive Kontrolle, die für das Primer Sondensatz erworben werden (siehe Materialliste).
- Wenn Sie zuvor gefrorenem Gewebe, sammeln gefrorenem Gewebe auf Trockeneis.
- Homogenisieren, mit einer der folgenden Methoden, wie beispielsweise Gewebe: Mörser Schleifen von Hand über Trockeneis nach dem Einfrieren Gewebe in flüssigem Stickstoff durchgeführt wird; Gewebehomogenisator oder mechanische Dissoziation Gerätpro Hersteller Vorschlag; Beschallung oder andere bevorzugte Methode.
Hinweis: Für die repräsentative Analyse, ist die bevorzugte Methode der Homogenisierung Beschallung.- Für die Analyse in Figur 3 dargestellt, herzustellen Lysepuffer (in RNA Isolation Kit bereitgestellt) und 2-Mercaptoethanol im Verhältnis von 20 ul 2-Mercaptoethanol für je 1 ml Lysepuffer. Resuspendieren Gewebe in 300 ul Lysepuffer ergänzt mit 2-Mercaptoethanol für jede 30 g Gewebe, und mit Ultraschall 10 s mit Beschallungsgerät bei 30% Amplitude eingestellt.
- Wenn Sie nach dem Schleifen Mörser und Stößel, resuspendieren Grundgewebe in 300 ul Lysepuffer.
- Zugabe von 10 & mgr; l Proteinase K bis 590 & mgr; l TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Fügen Sie 600 ul Proteinase K-Lösung, um alle 300 & mgr; l (dh für jede 30 mg) von Gewebe. Inkubation für 10 min bei RT.
Hinweis: Aufschlusszeit kann variieren. - Centrifuge Proben bei ≥13.000 g für 10 min, um Trümmer zu entfernen.
- Überstand in ein neues Röhrchen.
- Mit 450 & mgr; l Ethanol (96% -100%) für jeweils 900 & mgr; l des Überstands, um RNA auszufällen.
- Übertragen 700 ul des Lysats / Ethanol Mischung auf die Säule.
- Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 1 min, um RNA zu Säule bindet.
- Entsorgen flüssiger Abfall und fügen verbleibende Überstand zur Spalte wieder zu spinnen.
- Sobald das gesamte Lysat durch die Säule geschleudert, mit 350 ul Waschpuffer 1 an dem oberen Abschnitt der Säule und Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 30 sec.
- Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen.
- Vorbereitung DNase durch Mischen von 5 Einheiten DNase I-Enzym mit 5 ul von 10x DNase und 40 ul DNase / RNase freiem Wasser pro Probe (Gesamtvolumen von 50 ul / Probe).
- Dann werden 50 ul DNase mischen, um jede Spalte und Inkubation für 15 min bei RT.
- Fügen Sie 350 ul Waschpuffer 1 bis Säule und zentrifugieren samsätze bei ≥13,000 g für 30 Sekunden.
- Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen.
- Mit 600 & mgr; l Waschpuffer 2 an die Säule und Spin 30 sec bei ≥13,000 g.
- Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen.
- Fügen Sie 250 ul Waschpuffer 2 und Zentrifuge für 2 min bei ≥13,000 g.
- Setzen Sie Teil der Kolonne in neuen Sammelröhrchen und entsorgen Sie alte Sammelröhrchen.
- In 50 bis 100 & mgr; l RNase / DNase freies Wasser zur Säule und Inkubation für 1 min.
- Spin für 1 min bei ≥13,000 g.
- Re-run bis Spalte gesammelten Eluats auf RNA-Ausbeute zu erhöhen.
- Für den sofortigen Einsatz, halten Proben auf Eis und zur Quantifizierung. Für die spätere Verwendung, Snap freeze auf Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. Bei -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt.
3. Erststrangsynthese
Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde die Reverse Transkriptase (RT) -Reaktion durchgeführt a First cDNA-Synthese-Kit für QRT-PCR entwickelt (siehe Materialliste).
- Wenn Proben wurden zuvor gesammelten, tauen Röhrchen auf Eis.
- Messen Sie RNA-Menge mit einem Spektralphotometer.
- Verwendung 0,5-2 ug Gesamt-RNA, führen die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA Lager zu erzeugen.
- In sterile, RNase / DNase-frei PCR-Gefäße / Platten, bereiten Sie die Reaktionsmischung (Tabelle 1). Vorsichtig mischen und zentrifugieren. Programmieren Sie eine Standard-PCR-Maschine (Tabelle 2).
- Verdünnen Sie fertigen Reaktion auf gewünschte Lautstärke (in der Regel 50 bis 100 & mgr; l) mit sterilen Nuklease-freies Wasser.
4. Echtzeit-PCR
Hinweis: Für die repräsentative Analyse, SYBR Green verwendet wurde. Jedoch kann jede bevorzugte Methode im Ermessen des Benutzers ersetzt werden.
- Verwendung eines positiven Steuer cDNA, richten Sie eine Standardkurve für jedes Primerpaar.
- Für die Analyse gezeigt, in Abbildung 3, bereiten Sie die Standardkurve für den menschlichen HER2 mit dem Hersteller empfohlene positive Kontroll cDNA (siehe Materialliste). Für Maus GAPDH, verwenden Sie die Negativkontrolle Lungen-cDNA um eine Standardkurve zu erzeugen. Für jede Sonde, seriell verdünnter die cDNA 1: 4 bis 5-Norm zu erzeugen.
- Berechnen der Gesamtzahl der Proben, die der Standardkurve und die experimentellen Proben enthalten sollte.
Hinweis: Für die Analyse hier beschrieben, wurden 2-3 experimentellen Wiederholungen pro Probe analysiert. Standardkurvenanalyse durchgeführt, um ein einfaches lineares Regressionsmodell, die angewendet werden, um die relative Menge von HER2 und GAPDH pro Probe zur endgültigen normierte Größe berechnen bestimmen zu erzeugen. Diese Analyse wird auch dafür sorgen, dass der Primer Effizienz angemessen für die Analyse bei der Hand ist. - In einem sterilen, RNase / DNase-frei Rohr, bereiten Master-Mix (Tabelle 3).
- Berechnen Mastermix amount pro Probe. Scale-up für mehr als eine Probe. Verwenden Sie einen Master-Mix für jeden experimentellen Gen von Interesse, als auch als interne Kontrolle, wie GAPDH. Verwenden Primer für GAPDH in einer Endkonzentration von 200 nM.
Hinweis: Der interne Kontrolle ist besonders nützlich, wenn versucht wird, zwischen Mensch und Maus-Zell Ursprungs zu unterscheiden.
Hinweis: Primer-Konzentration für HER2 wurde optimiert und durch den Hersteller bestimmt.
- Berechnen Mastermix amount pro Probe. Scale-up für mehr als eine Probe. Verwenden Sie einen Master-Mix für jeden experimentellen Gen von Interesse, als auch als interne Kontrolle, wie GAPDH. Verwenden Primer für GAPDH in einer Endkonzentration von 200 nM.
- Bereiten Testplatte, die 1 & mgr; l cDNAs entsprechend jeder Standard- oder Versuchsprobe. Hierbei mindestens 1 cDNA-Probe / Vertiefung für jedes Primersonde. In 19 ul des Master-Mix pro Vertiefung für jedes Primersonde.
Anmerkung: Für den repräsentativen Daten in Abbildung 3 wurden die cDNA-Proben in zweifacher Ausführung für jeden Primer Sonde analysiert und als der Mittelwert der zwei Proben grafisch dargestellt. - Führen Reaktion in QRT-PCR-Maschine mit den empfohlenen oder zuvor PCR-Protokoll getestet. Siehe Tabelle 4 Abbildung 3 und 4 verwendeten PCR-Protokoll.
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Representative Results
Über die Zeit, die für den anfänglichen Inokulation von Tumorzellen in das Versuchstier und durchzuführen, wenn die Durchführung ist ein 1-2 Tag Verfahren primären Tumor in vivo Analyse der Gewebeernte, RNA-Isolierung und qRT-PCR-Analyse (Figur 1) .
Ein Beispiel für eine grobe Analyse ist Biolumineszenz-Bildgebung, um Tumorzellen im Lungengewebe zu bewerten. Hier wurde eine Brusttumorgenese Experiment durchgeführt, um zu bewerten, ob ein Prüfpräparat Agent, der die Gap Junction Protein Connexin43, genannt ACT1 abzielt, würde spontane Metastasierung von 4T1-luc Mammatumorzellen in die Lunge beeinträchtigen. Nach mehreren Wochen der Behandlung, Tiere, die Placebo oder die Testsubstanz erhalten wurden mit Luciferin injiziert und geopfert. Nach Dissektion wurden die Lungen auf Luciferase-Biolumineszenz visualisiert. Aus den repräsentativen Bildern scheint es, dass die Lungen von der Drogebehandelten Tiere negativ auf Luciferase-Aktivität, die anzeigt, dass keine Tumorzellen vorhanden sind, in der Lunge, was auf eine Hemmung der Metastasierung nach ACT1 Behandlung (2A). Der Hauptzweck dieser repräsentativen Bilder ist es zu zeigen, daß biolumineszente Bildgebung ist ein geeignetes Verfahren für den Nachweis einer Metastasierung. Jedoch nach detaillierte Untersuchung der H & E Abschnitte Lungen von Tieren, die mit ACT1 behandelten Mikro identifiziert, die nicht von der Luciferase-Bildgebung (2B) belichtet wurden, möglicherweise darauf hindeutet, daß diese Art der Bildgebung nicht empfindlich genug sein, um niedrige Zahlen von Tumor zu erkennen Zellen innerhalb der Lunge eingebettet. Im Idealfall würde ein Begleiter-Analyse für QRT-PCR durchgeführt werden, um diese Ergebnisse zu bestätigen.
Der QRT-PCR-Analyse hier vorgestellten verwendet eine Sonde, die für die menschliche HER2 an menschlichen Tumorzellen in der Lunge von HER2 + JIMT-1-Zellen,wurden ursprünglich in das Brustfettpolster von Wirtstieren (Abbildung 3) verpflanzt. Metastasen aufgetreten spontan nach der Tumorentwicklung. Nach der Dissektion, wenn unter einem Stereomikroskop betrachtet, keine deutlich sichtbaren Metastasen wurden auf jedem der Lunge beobachtet. Jedoch auf der Grundlage der nachfolgenden qRT-PCR-Analyse geht hervor, dass zwei von den elf Lungen von Tumor-tragenden Tieren beherbergten Metastasen, die durch die Pfeile in Figur 3 bezeichnet geerntet, was darauf hindeutet, dass Tumorzellen, die durch die Visualisierung unentdeckt wurden vorliegen. cDNA, die aus einem Stück JIMT-1 abgeleiteten Tumor abgeleitet wurde als positive Kontrolle für die HER2 Expression (Abbildung 3, (+)) und einer Lunge von einer Maus, die nicht mit Tumorzellen injiziert worden war, wurde als negative Kontrolle verwendet (Fig 3 (-)). Ein Maus-spezifischen Sonde für GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet, um den Anteil von menschlichen Tumorzellen, Gesamtmauslungengewebe zu bestimmen. Die positive KontrolleProbe wurde normalisiert auf GAPDH-Ebenen von der Steuer Lunge als Referenz. Eine alternative Normalisierungs Strategie wäre Durchschnitt der Menge an GAPDH in allen Lungenproben konsistentere Normalisierungsstufen für die Kontrollproben erhalten. Alternative Sonden für nicht-Maus und nicht-menschliche Gene, wie GFP könnte eingesetzt werden, um Tumorzellen, die entsprechend vor der Einführung in die Maus markiert worden sind, zu detektieren.
Eine Sekundäranalyse wurde ebenfalls durchgeführt, um eine relative Quantifizierung der in der Lunge vorhandenen Gesamttumorzellzahl. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Hier wurde eine Standardkurve Analyse vorbereitet, um die relative HER2 Menge Mauslunge GAPDH in einer Zellzahl normiert Reihe bestimmen. In der Theorie ermöglicht dies dem Forscher, die relative Menge an HER2 in 1x10 6 bestimmen, 1x10 5, 1x10 4 1x10
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Lunge Präparation und Analyse. Die Maus-Lunge enthält 5 Lappen, wie durch den Einsatz vergrößerte Zeichnung angegeben. Von Dissektion der Analyse der QRT-PCR-Verfahren dauert in der Regel 1-2 Tage, um abzuschließen.ge.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Brutto-Analyse der Metastasierung. (A) Repräsentative Biolumineszenz Bilder der Lunge von Tieren, die mit 4T1-luc-Zellen injiziert und mit entweder Placebo oder ein Medikament namens ACT1, die das Gap Junction Protein, Connexin43 zielt behandelt wurden. (B). Schnitt einer Mikrometastasierung in der repräsentativen H & E Lunge von einem Tier mit einer 4T1 Tumor, der mit ACT1 behandelt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative QRT-PCR-Analyse. Bargraphdie die quantifizierten Daten aus der QRT-PCR-Analyse der menschlichen HER2 im JIMT-1 menschlichen Brustkrebszelllinie Geschenk-Gen. Menschliche HER2 Niveaus in der Lunge sind normiert auf Maus GAPDH. (+) Zeigt positive Kontrolle. (-) Bezeichnet Negativkontrolle. Die Ergebnisse werden auf einer log-Skala aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Repräsentative qRT-PCR-Analyse von Zellzahl Analyse. (A) Diagramm darstellt HER2 Ebenen in Bezug auf die Zellzahl Menge JIMT-1-Zellen von 1x10 6 bis 10 Zellen. (B) Balkendiagramm, die quantifizierten Daten aus dem QRT-PCR-Analyse der menschlichen HER2 im JIMT-1 menschlichen Brust ein Geschenk Gencer-Zelllinie. Menschliche HER2 Niveaus in der Lunge sind normiert auf Maus GAPDH. (+) Zeigt positive Kontrolle. (-) Bezeichnet Negativkontrolle. Die Ergebnisse werden auf einer log-Skala aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Matrizen-RNA | 0,5-2 & mgr; g |
| iScript Supermix | 4 ul / Probe |
| Nuklease-freies Wasser | bis zu 20 & mgr; l / Probe |
Tabelle 1 First Strand Synthesis Reaktionsmischung Komponenten (Schritt 3.3.1).
| Schritt 1: 25 ° C | 5 Minuten |
| Schritt 2: 42 ° C | 30 Minuten |
| Schritt 3: 85 ° C (Terminierung) | 5 Minuten |
Tabelle 2. PCR-Bedingungen für First Strand Synthesis (Schritt 3.3.3).
| iTAQ Master Mix | 10 ul / Probe |
| Primer Mix | 1 ul / Probe |
| bis zu 20 & mgr; l / Probe |
Tabelle 3 Echtzeit-PCR-Reaktionsgemisch-Komponenten (Schritt 4.3).
| Schritt 1 | Aktivierung | 95 ° C | 2 min | 1 Zyklus |
| Schritt 2 | Denaturierung | 95 ° C | 5 Sek | 40 Zyklen |
| Annealing / Erweiterung | 60 ° C | 30 sec | ||
| Schritt 3 | Schmelzen Curve (optional) | 65-95 ° C (0,5-Schritten) | 5 s / Schritt </ td> |
Tabelle 4. Echtzeit-PCR-Bedingungen (Schritt 4.5).
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt Verwendung von QRT-PCR, um Brust Metastasierung von Tumorzellen in die Lunge mit einem Xenograft Mausmodell zu bewerten. Es wird anerkannt, dass andere Techniken, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfügung und sind auch wirksam zum Erfassen Metastasierung obwohl ihre eigenen Werte und Grenzen. Die vorgestellten Daten zeigen, dass qRT-PCR stellt eine wirksame Maßnahme zum Nachweis von Tumor-abgeleitete mRNA im Lungengewebe zur Quantifizierung von Gesamt Metastasierung. Es wird vorgeschlagen, QRT-PCR-Analyse bietet eine sekundäre Methode, ergänzen können oder anstelle dieser bildgebenden Verfahren durchgeführt werden. Diese Technik kann am besten für Forschungsumgebungen mit begrenztem Zugang zu bestimmten Arten von Geräten oder für Arbeitsgruppen mit speziellen Interessen in metastatischen Last geeignet sein, aber nicht detaillierte mechanistische Studien.
Während informativ, das hier beschriebene QRT-PCR-Analyse hat seine Grenzen. Es ist nicht möglich, stromabwärts durchführen zusätzlicherAnalyse, einschließlich der Immunhistochemie (IHC) oder Immunfluoreszenz (IF) Färbung, weil die gesamte Lungengewebe ist für die RNA-Isolierung verwendet. Allerdings, wenn mit einem In-vivo-Imaging-Technik gepaart das Lungengewebe isoliert werden post-Bildgebung, um diese Sekundär Art von Analyse durchzuführen. Auch wird diese Technik zum Erfassen mRNA und damit die Proteinanalyse begrenzt ist nicht möglich, es sei denn, ein Multi-prep Isolation Kit wird verwendet, um das Lungengewebe vor. Die Analyse des resultierenden Proteins wird noch mit um eine Gesamtproteinmischung, die den Tumor und Lungensubstanz in einem Produkt umfasst, auszuwerten wohin IHC / IF ermöglicht dem Benutzer die Proteine in Tumorgewebe gefärbt von Färbung in Mausgewebe gefunden basierend auf der Abgrenzung beschränkt Visualisierung des IHC / IF-Färbung. Alternativ zur Verwendung des gesamten Lungen Beibehaltung Hälfte des Lungengewebes für weitere Analysen, wie die Histologie von Vorteil sein kann, sondern birgt die Gefahr von widersprüchlichen Ergebnisse, wenn die Metastasen in einem Teil der Lunge gekennzeichnet und nicht the anderen.
Einige Punkte der Änderung und Fehlerbehebung werden empfohlen. Die Genauigkeit der qRT-PCR-Daten ist abhängig von der Primer-Sonde, die für den Test und die Optimierung von Sonden ausgewählt ist, wird empfohlen, einschließlich der Verwendung eines geeigneten Standardkurve Analyse zur Quantifizierung Transkript. Zusätzlich ist es wichtig, die Qualität der RNA, die isoliert wird, zu messen. Über Verdauung des Gewebes mit Proteinase K können die Qualität der RNA zu verringern und somit die Optimierung basierend auf dem spezifischen Gewebe von Interesse und Verfahren zur RNA-Präparat empfohlen. Auswahl eines geeigneten Reinigungsservice Referenz-Gen ist auch wichtig. Während GAPDH ist eine häufig verwendete Referenzgens dient jedes Gen eine normale Funktion in der Zelle, die aufgrund der experimentellen Bedingungen verändert werden könnte (dh genetische Modifikation von Wirtstieren wie Gen-Knockout) und damit alternative Möglichkeiten sind nützlich. Einige gemeinsame Referenzgenen, die gemeldet werden, um allgegenwärtige Eil habenIonen und geringe Variation in der Menge sind die Gene, TATA-Box bindende Protein (TBP), Retinitis Pigmentosa 2 kodiert, (RP2), Actin-like protein (Act) und Tubby bipartite Transkriptionsfaktor (Tub) 11. Darüber hinaus sind die entscheidenden Schritte, die genaue Analyse zu gewährleisten, genaue Sezieren und Waschen der Lunge (Schritt 1.2.2-1.2.6), korrekte Quantifizierung der Gesamt-RNA isoliert (Schritt 3.2) und genaues Pipettieren während der QRT-PCR-Setup (Schritt 4.4). Verwendung eines Wiederholungspipette kann in diesem Prozess zu unterstützen.
Zusammenfassend zielt dieses Protokoll zu zeigen, dass QRT-PCR ist eine quantifizierbare Methode, um Lungenmetastasen zu identifizieren. Sowohl positiven Wert und Einschränkungen bei der Verwendung dieses Verfahrens identifiziert und kann es am besten geeignet, um mit einem sekundären Analysemethode gekoppelt werden. Allerdings könnte diese Methode eine geradlinig Verfahren der Quantifizierung für jene Forschungs laborator seinies mit spezifischen Forschungsbedarf oder das Fehlen von umfangreichen Ausstattung zur Metastasierung zu untersuchen. . Zukünftige Anwendungen dieses Verfahrens umfassen Modifikation für Metastasen in Zielorganen über die Lunge, wie Lymphknoten oder des Gehirns, die andere gemeinsame Gebiete von Metastasierung aussehen.
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Disclosures
ESY und MAA nicht durch FirstString Research Inc. verwendet und nicht ein finanzielles Interesse an der Gesellschaft halten. FirstString Research Inc. zur Verfügung gestellt, die die Luciferase Bilddaten, die in diesem Manuskript vorgestellt wurde. GSG ist Präsident und CEO von FirstString Research. CLG ist Mitarbeiter von FirstString Research. GSG und CLG haben Aktienoptionen durch FirstString Forschung ausgegeben.
Acknowledgments
Die Yeh Labor wird durch Forschungsmittel von einem American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) von einem Department of Defense Zuschuss an die Hollings Cancer Center an MUSC verliehen, durch Forschungsförderung (W81XWH-11-2- unterstützt 0229) bei MUSC und von einem preis vom Concern Foundation (zum ESY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
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