Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53340
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Abstract

يشار إلى سلوك الهجرة الخلية الاتجاه في ظل المباشر التيار الكهربائي الميدان (dcEF) على أنها انجذاب كهربي. وقد تجلى دور كبير الفسيولوجية dcEF في توجيه حركة الخلية أثناء تطور الجنين، تمايز الخلايا، والتئام الجروح في العديد من الدراسات. من خلال تطبيق رقائق ميكروفلويديك لمقايسة انجذاب كهربي، هو تقصير عملية التحقيق ويتم الحد من الأخطاء التجريبية. في السنوات الأخيرة، وأجهزة ميكروفلويديك المصنوعة من المواد البوليمرية (على سبيل المثال، البولى، PMMA، أو الاكريليك) أو (PDMS) polydimethylsiloxane استخدمت على نطاق واسع في دراسة ردود الخلايا لالتحفيز الكهربائي. ولكن، على عكس العديد من الخطوات اللازمة لصنع جهاز PDMS، وبناء بسيط وسريع للالصغرى الاكريليك فلوريدا رقاقة uidic يجعلها مناسبة لكلا النماذج الجهاز والإنتاج. إلا أن أيا من الأجهزة وذكرت تسهيل دراسة كفاءة المادة الكيميائية وهندسة المدنية في وقت واحدالآثار و على الخلايا. في هذا التقرير، وصفنا لدينا تصميم وتصنيع والمتعددة القائمة على الاكريليك المزدوج الكهربائي الميدان (MDF) رقاقة لدراسة تأثير المتزامنة الكيميائية والتحفيز الكهربائي على خلايا سرطان الرئة. يوفر رقاقة MDF ثماني مجموعات من التحفيز الكهربائية / الكيميائية في اختبار واحد. رقاقة ليس فقط يقصر كثيرا من الوقت تجريبي مطلوب ولكن أيضا يزيد من دقة في انجذاب كهربي الدراسات.

Introduction

يشار إلى سلوك الخلايا الملتصقة تتحرك باتجاه القطب الموجب أو السالب تحت المباشر التيار الكهربائي الميدان (dcEF) على أنها انجذاب كهربي. سلوك electrotactic الخلايا يلعب دورا هاما في تكوين الجنين، وتجديد الأعصاب، والتئام الجروح. وقد أظهرت 1 الخلايا السرطانية مثل خلايا سرطان البروستاتا الفئران، الخلايا السرطانية 2 الثدي، 3 والرئة خلايا غدية 4-8 الحركة electrotactic تحت dcEF تطبيقها . وقد تم قياس EF الفسيولوجية في أنسجة الغدة. كما تم الإبلاغ عن 9،10 انجذاب كهربي في الخلايا السرطانية، الغدة المرتبطة بها. 2،3 مجتمعة، ويعتبر انجذاب كهربي للخلايا السرطانية أن يكون عاملا ورم خبيث. 11 التحكم في التوجيه الكهربائي الخلايا السرطانية تحت dcEF قد تكون فكرة ممكنة لعلاج السرطان في المستقبل. ومع ذلك، اليوم، آلية جزيئية التفصيلية للانجذاب كهربي لا تزال موضع جدل. لذلك، تحقيقا في الوقود النووي المشعluence من التحفيز الكهربائي على الهجرة الخلايا السرطانية يمكن أن يسهل وضع استراتيجيات لعلاج السرطان.

مؤخرا، تم ملفقة الأجهزة الحيوية ميكروفلويديك لدراسة الاستجابات الخلوية في التدفق قوة القص، 12 التدرجات الكيميائية و 13 و الكهربائية المحفزات 4 في المختبر. وقد خفضت تصنيع الأجهزة الحيوية ميكروفلويديك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) أو البولى (PMMA، المعروف أيضا باسم الاكريليك) بنجاح على معدل فشل هذه التجارب. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام أجهزة ميكروفلويديك القائمة على الاكريليك كنموذج للتحقيق في موضوعات البيولوجية هو أبسط من استخدام PDMS رقائق البطاطس. وقد وضعت العديد من الوظائف في الأجهزة القائمة على الاكريليك لانجذاب كهربي الدراسة. ومع ذلك، فإن أيا من التصاميم السابقة وتمكن من اختبار في وقت واحد آثار الظروف الكيميائية المختلفة و-الحقل الكهربائي في الخلايا للانجذاب كهربي الدراسة. وهكذا، قمنا بتطوير جهاز لميكروفلويديك موltichannel المزدوج الكهربائي الميدان (MDF) أربع قنوات ثقافة مستقلة وثمانية ظروف تجريبية مختلفة في رقاقة واحدة تحتوي على رقاقة.

وMDF رقاقة القائمة على الاكريليك، لاول مرة من قبل هوى وآخرون، 8 يدمج التحفيز الكهربائي وعدة قنوات معزولة كيميائيا. هذه القنوات معزولة كيميائيا يمكن استخدامها لثقافة أنواع مختلفة من الخلايا في تجربة واحدة. يتم إنتاج dcEF في القنوات التي كتبها إمدادات الطاقة الكهربائية. حقلين الكهربائية المستقلة، واحدة مع التطبيقية القوة الكهربائية الميدان (EFS) وآخر مع 0 EFS، تجري في كل قناة معزولة كيميائيا. وبهذه الطريقة، يوفر رقاقة EF التعايش أفضل تسيطر عليها والتحفيز الكيميائي. وعلاوة على ذلك، نتائج المحاكاة العددية للنشر الكيميائية داخل الرقاقة MDF تشير إلى أن عدم وجود تلوث عبر وقعت بين القنوات بعد فترة تجريبية 24 ساعة. 8

مقارنة ديفيم ذكرت لي وآخرون، 14 رقاقة MDF يوفر مساحة الثقافة الأوسع، والذي يسمح لمزيد من التحليل الكيميائي للخلايا حفز كهربائيا. بالإضافة إلى ذلك، مع منطقة مراقبة أكبر شريحة MDF، والمزيد من الخلايا يمكن ملاحظة في الاختبار، وبالتالي فإن تحليل سرعة الهجرة أو توجيه الأعضاء من الخلايا حفز كهربائيا هو أكثر دقة. تصاميم رقاقة على قناة واحدة من الدراسات السابقة التي أبلغ عنها هوانغ وآخرون. (4) وتساي وآخرون 15 تسمح سوى نوع واحد من الخلايا او كيميائية لفحصها. ومع ذلك، فإن رقاقة MDF يمكن استخدامها لتحقيق آثار المواد الكيميائية المختلفة على انجذاب كهربي، فضلا عن آثار التحفيز الكهربائي على أنواع مختلفة من الخلايا. وبعبارة أخرى، فإن رقاقة MDF يسمح لدراسة كفاءة تبعيات الجرعة الكيميائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم وتصنيع رقاقة MDF

  1. رسم نمط طبقة الاكريليك الفردية باستخدام البرمجيات التجارية، مثل أوتوكاد، وحفظ النمط.
    1. إعادة النظر في تصميم نمط ورقة الاكريليك أربعة الطبقات في الشكل 1A وتأكيد الروابط بين طبقة.
  2. افتعال كل أوراق الأكريليك والشريط على الوجهين من قبل الاستئصال بالليزر باستخدام الليزر الناسخ CO 2 (أرقام 1B، 2A، 2B و). 16
    1. بدوره على الناسخ الليزر وتوصيل الجهاز إلى جهاز الكمبيوتر المحمول السيطرة.
    2. تشغيل البرمجيات التجارية وفتح نمط تصميم في الخطوة 1.1 بالنقر على "ملف نمط تصميم".
    3. ضع قطعة من الاكريليك ورقة فارغة أو الشريط على الوجهين على المسرح XYZ من الناسخ ليزر.
    4. ضبط تركيز شعاع الليزر على سطح ورقة الاكريليك أو الشريط على الوجهين مع لصناعة السيارات في alignmenر عصا المقدمة من قبل الشركة المصنعة للخطاط الليزر.
    5. إرسال نمط تصميم للخطاط ليزر لتصنيع الآلات مباشرة من الاكريليك ورقة أو الشريط على الوجهين.
  3. إزالة ورقة واقية من أوراق الأكريليك باستخدام ملقط وضربة على سطح نظيف مع غاز النيتروجين.
  4. كومة من أوراق الأكريليك والسندات معا تحت ضغط من 2 كجم / سم 2 في بوندر الحراري لمدة 45 دقيقة في 110 ° C لتشكيل تدفق / الكهربائية التجمع قناة التحفيز.
  5. إعداد غطاء زجاجي المجهر والركيزة ثقافة خلية في رقاقة.
    1. وضع غطاء زجاجي في وعاء تلطيخ وملء جرة مع تخفيف عشرة أضعاف من المنظفات المدرجة في قائمة المواد.
    2. وضع غطاء زجاجي وجرة تلطيخ في بالموجات فوق الصوتية ستيري نظافة وتنظيف الزجاج غطاء لمدة 15 دقيقة.
    3. صب المنظفات المخفف للخروج من جرة تلطيخ، إعادة ملء الجرة بالماء المقطر، وكرر الخطوة 1.5.2 3 مرات.
    4. تجفيف غطاء زجاجي تنظيف هبوبها مع غاز النيتروجين قبل الانضمام إلى الشريط على الوجهين.
  6. التمسك الزجاج غطاء تنظيفها لتدفق / الكهربائية التجمع قناة التحفيز مع الشريط على الوجهين نمط في الخطوة 1.2.
  7. التمسك 13 قطعة من محولات الاكريليك لفتحات الفردية في طبقة 1 من الجمعية رقاقة MDF مع الغراء عظمى. الجمعية رقاقة MDF اكتمال ثم (الشكل 2D).
  8. تعقيم كامل التجمع رقاقة MDF مع 30 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية قبل استخدامها.

2. إعداد شبكة جسر ملح رقاقة MDF

  1. قبل استخدامها، وتعقيم جميع الأنابيب البلاستيكية والمكسرات الاصبع ضيق، وأنابيب microcentrifuge هو مبين في الشكل 3B عن طريق تحديد وقت إجراء مدة 15 دقيقة في 121 ° C في الأوتوكلاف.
  2. توصيل أنابيب fluoroplastic (الشكل 3B-I) إلى التجمع رقاقة MDF عبر مدخل المتوسطومحولات منفذ هو مبين في الشكل 1A.
  3. ربط تفتق لور من مدخل متوسطة ومخرج أنابيب بلاستيكية في الشكل 3B-ط 3-الطريق الصمامات.
  4. تأخذ 2.5 مل من CO 2 -equilibrated الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام حقنة 3 مل وتوصيل حقنة ل3-الطريقة محبس من أنبوب بلاستيكي مدخل. توصيل فارغة 3 مل حقنة ل3-الطريقة محبس من أنبوب من البلاستيك منفذ. وهكذا مترابطة المحاقن اثنين من خلال رقاقة MDF.
    ملاحظة: احتضان PBS في 37 ° C 5٪ -co 2 خلية حاضنة الثقافة O / N للحصول CO 2 -equilibrated PBS.
  5. اغلاق فتحات الأزرق ومحولات الخضراء (الشكل 1A) على ورقة PMMA طبقة 1 مع المكسرات الاصبع ضيق صلبة بيضاء (الشكل 3B-ج).
  6. ملء قنوات جسر الملح وغرف الثقافة مع CO 2 -equilibrated PBS في حقنة وصفها في الإعداد خطوة 2.4. تجنبتشكيل فقاعات.
  7. بعد ذلك، وضع CO 2 -equilibrated PBS التي تحتوي على رقاقة MDF في 37 ° C 5٪ -co 2 خلية ثقافة حاضنة لO / N الحضانة. هذا يسمح للهواء الذائبة في الشريط على الوجهين لتشكيل فقاعات في الدوائر.
  8. طرد بعيدا فقاعات في القنوات التي تدفق PBS السريع في القناة باستخدام الحقن اثنين. ضخ PBS ذهابا وإيابا إذا لزم الأمر.
  9. استنزاف PBS في القنوات عبر 3-الطريقة محبس متصلا أنبوب مخرج المتوسط.
  10. باستخدام 3 مل حقنة جديدة، تأخذ 2.5 مل من CO 2 -equilibrated Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) (راجع الخطوة 3.5)، واستبدال حقنة متصلة مدخل مع واحدة جديدة. إعادة ملء قنوات مع المتوسط.
  11. إعداد شبكة جسر الملح.
    1. مؤقتا إزالة المكسرات الصلبة (الشكل 3B-III) على المحولات الخضراء (الشكل 1A) وحقن 3٪ الساخنة (> 70 ° C) الاغاروز في بري الملحقناة DGE من خلال فتحة في محولات الخضراء (الشكل 1A).
      ملاحظة: إعداد الاغاروز الساخنة: حل 1.5 غرام من مسحوق الاغاروز في 50 مل من برنامج تلفزيوني. تعقيم عن طريق تحديد وقت عقد 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية في الأوتوكلاف.
    2. وقف حقن الاغاروز عندما يملأ السائل ثلاثة أرباع طول القناة جسر الملح.
    3. اغلاق المسام على محولات الخضراء (الشكل 1A) من خلال الشد المكسرات الصلبة (الشكل 3B-ج) بعد حقن الاغاروز.
    4. استبدال المكسرات الصلبة على محولات الزرقاء (الشكل 1A) مع المكسرات الاصبع ضيق أنبوبي شفافة (الشكل 3B).
    5. تحميل 3٪ قبل تسخينها-الاغاروز في المكسرات أنبوبي (الشكل 3B-IV).
    6. تضمين الأقطاب حج / أجكل (الشكل 3B-V) في المكسرات أنبوبي (الشكل 3B-IV) قبلالتصلب من الاغاروز.
  12. بعد الانتهاء من الإعداد للشبكة جسر الملح، حقن خلايا سرطان الرئة CL1-5 في غرف الثقافة، غرفة واحدة في وقت واحد.

3. إعداد خلايا السرطان وإعداد لElectrotactic التجربة

  1. ثقافة العادية من سرطان الرئة خط الخلية CL1-5.
    1. ثقافة الخلايا السرطانية CL1-5 الرئة، والتي تم الحصول عليها من الأستاذ عموم Chyr يانغ، 17 في المتوسط ​​كاملة في قارورة الثقافة خلية 75T في 37 ° C في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. يتكون المتوسطة كاملة من DMEM و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). ثقافة فرعية الخلايا كل 3-4 أيام. الخلايا المستخدمة لإجراء التجارب انجذاب كهربي أقل من 25 مقاطع من المصدر الأصلي.
  2. إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين عازلة للخلايا CL1-5 تنمو باطراد واحتضان لمدة 2 دقيقة في 37 ° C 5٪ -co 2 خلية ثقافة حاضنة لdetachmen الخليةت.
  3. إنهاء العملية مفرزة مع 6 مل من 10٪ FBS DMEM وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة 5 دقائق على RT. ثم تجاهل المتوسطة وتعليق بيليه الخلية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. حساب عدد الخلايا في برنامج تلفزيوني. ثم تأخذ 1 × 10 6 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
  5. تجاهل PBS. تعليق الخلايا مع CO 2 قبل تحسنت -equilibrated DMEM وضبط كثافة الخلية لتكون 1 × 10 6 خلية / مل.
    ملاحظة: احتضان المتوسطة كاملة في 37 ° C 5٪ -co 2 خلية حاضنة الثقافة O / N للحصول على CO 2 -equilibrated DMEM.

4. إعداد لElectrotactic التجربة

  1. من مخرج رقاقة MDF، حقن 0.3 مل، 1 × 10 6 / مل من الخلايا في رقاقة.
  2. احتضان MDF رقاقة الخلية المصنفة في حاضنة الثقافة الخلية (التي حددت في 37 ° C و 5٪ CO 2) لمدة 2-4 ساعة.
  3. الإعداد لMDF الصغيرنظام فلويديك.
    1. تثبيت نظام ميكروفلويديك MDF على شفاف الإنديوم أكسيد القصدير والزجاج (ITO) سخان. قياس درجة حرارة رقاقة MDF مع الحرارية K-نوع يثقب بين رقاقة MDF والزجاج ITO. السيطرة على سخان ايتو مع وحدة تحكم متناسبة-لا يتجزأ المشتقة (PID). تعيين MDF ميكروفلويديك درجة حرارة النظام الحضانة إلى 37 ° C مع وحدة تحكم PID.
      ملاحظة: تصنيع سخان ايتو والإعداد للنظام زراعة الخلايا التدفئة ويرد في تقارير سابقة 18،19.
    2. جبل الجمعية رقاقة MDF التحكم في درجة حرارته على XYZ مرحلة الآلية الكمبيوتر التي تسيطر عليها على مجهر مقلوب. يوصف استخدام في مرحلة الآلية في الخطوة 5.1. ضخ المتوسطة كاملة في غرف الثقافة من خلال مداخل مع أربع قنوات ضخ حقنة.
  4. ضخ المتوسطة كاملة في رقاقة MDF بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة. النفايات الثقافة من خارجيتيح يتم جمعها في أنابيب microcentrifuge (كما هو موضح "النفايات" في الشكل 3A).
  5. احتضان الخلايا لمدة 16-18 ساعة أخرى في 37 ° C في رقاقة MDF.
  6. لتحل محل المتوسطة، ضخ المتوسطة التي تحتوي على 50، 25، 5 و 0 ميكرومتر كيناز، على التوالي، في كل غرفة الثقافة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: إعداد 10 ملي حل الأوراق المالية من رو يرتبط البروتين كيناز Y27632 بإضافة 3 مل من الماء المعقم إلى 10.6 ملغ كيناز. تمييع الحل الأسهم 10 ملم إلى 50، 25، و 5 ميكرومتر، على التوالي، وذلك باستخدام 10٪ FBS DMEM المتوسطة.
  7. احتضان الخلايا في مثبط كيناز لمدة 60 دقيقة أخرى في 37 ° C. ضبط معدل التدفق المتوسط ​​إلى 20 ميكرولتر / ساعة. استخدام نفس درجة الحرارة الثقافة ومعدل المذكورة أعلاه في خطوات لاحقة التدفق.
  8. استخدام الأسلاك الكهربائية لتوصيل إمدادات الطاقة DC إلى شرائح MDF عبر الأقطاب حج / أجكل على رقاقة.
  9. ربط متسلسل وأنا مقياس التيار الكهربائين الدوائر الكهربائية. استخدام مقياس التيار الكهربائي لرصد التيار الكهربائي في رقاقة MDF.
  10. بدوره على DC امدادات الطاقة وضبط مقياس التيار الكهربائي الحالي إلى 86.94 أمبير عن طريق ضبط الجهد امدادات الطاقة إلى ما بين 15 و 19 V.
    ملاحظة: نظرا قانون أوم، E = I / (الزراعة العضوية EFF)، حيث I هو التيار الكهربائي التي تتدفق من خلال المواد السائبة، أي مستنبت في غرفة electrotactic، σ (= 1.38 Ω -1 م - 1) هو التوصيل من مستنبت، A ممثل المؤسسة (= 0.21 ملم 2 لعرض 3 مم × 0.07 ملم الارتفاع) هو منطقة مستعرضة فعالة للغرفة electrotactic، والتيار الكهربائي (I) اللازمة لتوليد 300 فولت / مم EF في رقاقة MDF هو 86.94 أمبير.

5. اكتساب وتحليل خلية صور

  1. السيطرة على مرحلة الآلية باستخدام برنامج MATLAB واجهة المستخدم الرسومية. مع نظام ميكروفلويديك MDF التي شنت على microscoالمؤسسة العامة، نقل الشريحة إلى مناطق المراقبة باستخدام مرحلة الآلية.
  2. صور خلية سجل باستخدام الرقمية أحادية العدسة العاكسة (SLR) كاميرا محمولة على المجهر.
  3. التقاط صور مجهرية باستخدام عدسة الهدف 4X على فترات من 15 دقيقة لمدة 2 ساعة.
  4. تحليل الهجرة الخلية.
    1. تشغيل NIH يماغيج 1.47 V.
    2. تحليل المسافة من الأول إلى المواقف النهائية من النقطه الوسطى الخلية.
    3. انتقل إلى "ملف" → "استيراد" → "تسلسل الصور"، واستيراد تسع صور لتحليل الهجرة الخلية. الصورة الأولى هي نتيجة من الزمن صفر، والصورة الأخيرة هي نتيجة ل120 دقيقة.
    4. انتقل إلى "تحليل" → "تعيين القياسات" وعلامة في المربع بجانب "النقطة الوسطى"
    5. انقر على "حر مختارات" رمز.
    6. تصوير حافة الخلايا المحددة في الصورة الأولى.
    7. انتقل إلى "تحرير" → "اختيار" → "إضافة إلى مدير"
    8. انتقل إلى الصورة التاسعة وتصوير حافة نفس الخلايا المحددة في الصورة الأولى. مواقف خلية يمكن أن تعزى باستخدام الثانية إلى الثامنة الصور.
    9. انتقل إلى "تحرير" → "اختيار" → "إضافة إلى مدير"
    10. كرر الخطوات من 5.4.5 إلى 5.4.9 لجمع البيانات 90-100 الخلايا.
    11. انتقل إلى "تحليل" → "قياس" للحصول على النتيجة من المواقف المبدئية والنهائية من الخلايا المحددة.
      ملاحظة: يتم تعريف سرعة الهجرة حيث بلغ متوسط ​​طول حركة الخلية في الساعة. يتم تعريف توجيه الأعضاء كما جيب التمام، حيث هي الزاوية بين متجه من dcEF (من الأنود إلى الكاثود) ومتجه من نقطة البداية من خلية إلى موقفها النهائي. وتوجيه الأعضاء هو -1 لالخلايا المهاجرة نحو القطب الموجب و+1 لالخلايا المهاجرة نحو القطب السالب. لمجموعة من ميل عشوائياصريف الخلايا، وتوجيه الأعضاء هو 0. 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصنيع وتجميع الجهاز MDF

ويظهر رسم تخطيطي للMDF رقاقة الاكريليك ومقرها في الشكل 1A. استخدمت أربع صفائح الاكريليك والزجاج غطاء واحد، 13 محولات الاكريليك، وقطعة من الشريط على الوجهين في التجمع من الشريحة MDF الانتهاء (الشكل 2D). هناك أربعة فقط من خلال القنوات ثقافة مستقلة في الجهاز MDF. ومع ذلك، فإن شبكة جسر الملح على رقاقة يخلق ثمانية ظروف تجريبية مختلفة في ثمانية قطاعات من الشريحة. ثلاثة جسور الملح (القنوات الزرقاء في طبقة 2 من الشكل 1A)، و 79، و 90، و 80 ملم في الطول، واقترنت إلى الطبقة الثانية من الشريحة MDF دون التدخل مع ملاحظة الصورة. مسام صغيرة (قنوات بوضع مكعبات زرقاء في طبقات 3 و 4 من الشكل 1A) بين شبكة جسر الملح والدوائر والثقافة، والتي لديها 00.25 مم 2 المقطع العرضي المنطقة، التقليل من تدفق السوائل في جسر الملح أثناء التجربة. منطقة ثقافة شريحة MDF حوالي 74 ملم 2 في كل قطاع. في هذه المظاهرة، وتتكون الدوائر ثقافة خلية من خلايا الجهاز MDF من الشريط وغطاء سميك من الزجاج على الوجهين 70 ميكرون. ومع ذلك، إذا المختلفة ظروف زراعة الخلايا (على سبيل المثال، وهو شرط الكولاجين طلاء، وانخفاض تدفق القص، أو كبيرة الحجم مستنبت في غرفة الثقافة) هناك حاجة للبحث انجذاب كهربي، فإن كلا من ركائز الثقافة والأشرطة يمكن الاستعاضة عنها بسهولة. لذلك، وأنواع مختلفة من الخلايا يمكن استخدامها لانجذاب كهربي الدراسة ضمن رقاقة MDF.

تكوين نظام ميكروفلويديك MDF

ويتضح MDF إعداد النظام ميكروفلويديك في الشكل 3A. المكونات هو مبين في الشكل 3B هي شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لإنشاء تدفق المتوسط ​​والشبكة الحالية الكهربائية في نظام ميكروفلويديك MDF. أنابيب متصلة مع المكسرات الاصبع ضيق جوفاء (الأحمر والأخضر) والتناقص التدريجي لور (البني) في الشكل 3B-ط تستخدم لنقل متوسطة إلى شبكة تدفق MDF. بعد توصيل الحقن إلى التناقص التدريجي لور واستقر على مضخة أربع قنوات، كان نظام تدفق خط أنابيب الكامل. ويتم نقل مستنبت والنفايات من خلال نظام خطوط الأنابيب. لأن يتم تثبيتها الاتصال بين الأنابيب ومحولات الاكريليك من الروابط ثمل، يمكن للشبكة المتوسطة MDF يتسامح مع الضغط الهيدروليكي أعلى من يمكن للنظام PDMS. بسبب انخفاض نفاذية الهواء الشديدة للأوراق الأكريليك والأنابيب، يتم حظر أي اتصال بين الشبكة المتوسطة والبيئة الخارجية. ولذلك، فإن قيمة الرقم الهيدروجيني للمتوسط ​​في النظام لا تزال مستقرة، والخلايا يمكن تربيتها باستخدام نظام ميكروفلويديك MDF خارج CO 2 الحاضنة. منذ الفصل MDFيتم تثبيت الملكية الفكرية في مرحلة الآلية، يمكن التقاط صور خلية مرور الزمن من ثمانية أقسام الفردية. هي التي شنت على أنابيب microcentrifuge مفتوحة القاع (الشكل 3B-II) على المكسرات الاصبع ضيق أنبوبي شفافة (الشكل 3B-IV) لزيادة سعة وحدة التخزين من الاغاروز. في هذه الطريقة، الأقطاب الكهربائية الكبيرة نسبيا يمكن إدراجها في الاغاروز لتوفير التحفيز الكهربائي مستقر إلى الخلايا لفترات أطول من الوقت.

جيل أشار الحقل الكهربائي التيار المباشر في الشريحة MDF

الجهد من كل غرفة يمكن قياسها عن طريق أقطاب كهربائية مزروعة في رقاقة الكهربائية الموصولة الدائرة. ومع ذلك، لم نكن قياس الجهد في الغرفة. بدلا من ذلك، نحن محاكاة الحقل الكهربائي في الشبكة جسر الملح والدوائر ثقافة خلية من الشريحة. وكانت أربع غرف electrotactic متسلسل يخدعnected في الدوائر الكهربائية. في هذه الطريقة، يتم الحفاظ على نفس التيار الكهربائي في كل من هذه الدوائر. وفقا لقانون أوم، وEFS يرتبط مجال المقطع العرضي للغرف في الجهاز ميكروفلويديك. بالإضافة إلى ذلك، ملفقة كافة الأوراق PMMA والأشرطة من قبل الناسخ ليزر CO 2. محاذاة رقاقة قطع التجميع هي دقيقة والعيوب الهيكلية للشريحة ضئيلة. وبالتالي، يجب أن EFS في كل غرفة تبقى مستقرة. وتشير نتائج المحاكاة الحقل الكهربائي توزيع متجانس من EFS مع 300 و 0 فولت / مم في النصفين الأول ونصفي المتبقية من غرف الثقافة في الجهاز (لا تظهر البيانات). سابقا، وتقارير من مختبرنا، وهوانغ آخرون. وتساي وآخرون، أثبتت أن الفرق في المقاسة والقيم EFS محاكاة كان أقل من 4٪. 4،15 هذه النتيجة تبين أنه في نظامنا، الحقل الكهربائي قياس يتوافق بشكل جيد مع قيمة المحاكاة. في هذا ثORK، أدخلنا كبيرة الأقطاب حج / أجكل لتوفير تيار كهربائي ثابت لإجراء تجربة طويلة. انخفض الحالية المطبقة على رقاقة MDF فقط 1.85 ± 0.19٪ بعد 7 ساعات من التحفيز EF في تجارب انجذاب كهربي. وعلاوة على ذلك، كانت أطول فترة من التحفيز الكهربائي 4 ساعات في دراستنا. وبالتالي، فإننا نعتقد يبقى التيار الكهربائي المدخلات مستقرة خلال اختبار انجذاب كهربي، ويتم مراقبتها الحقل الكهربائي في الدوائر electrotactic من الشريحة MDF بواسطة مقياس التيار الكهربائي مرتبطة بشكل متسلسل.

التحقيق في انجذاب كهربي من خلايا سرطان الرئة باستخدام نظام ميكروفلويديك MDF

وقد تجلى تنظيم electrotactic رو المصاحب ملفوف لفائف كيناز (ROCK) في الهامستر الصيني المبيض (CHO)، 20 البطانية و 21 و الخلايا العصبية 22 ولكن بعد لم يتم التحقيق للكشف عن سرطان الرئة جملتعلمي اللغة اإلنكليزية. ولذلك، فإن المانع ROCK، Y27632، تم تطبيقها على نظام ميكروفلويديك MDF لدراسة تأثيرها على انجذاب كهربي من خلايا سرطان الرئة. كما هو مبين في الشكل (4)، وأظهرت معاملة Y27632 أي تأثير في تغيير سرعة هجرة الخلايا مع أو بدون التحفيز الكهربائي. ومع ذلك، فإن تطبيق Y27632 إلى الخلايا السرطانية تحت dcEF (300 فولت / مم) انخفاضا كبيرا الهجرة انوديك بهم. في تركيز 50 ميكرومتر، والقضاء على مثبط ROCK حركة انوديك من خلايا سرطان الرئة ولكن لم يؤثر على سرعة هجرتهم. وعلاوة على ذلك، كان هناك علاقة تعتمد على الجرعة بين التركيزات الكيميائية التطبيقية ومؤشر توجيه الأعضاء (الشكل 4B). وتشير هذه النتائج إلى أن نظام ميكروفلويديك MDF هو موثوق بها وفعالة لدراسة انجذاب كهربي.

الشكل 1
الشكل 1. ديسIGN للرقاقة MDF. (A) رسم تخطيطي للرقاقة MDF. يتكون الجهاز MDF من أربع طبقات من أوراق الأكريليك (72 × 50 ملم)، 13 محولات الاكريليك (10 × 10 × 6 مم)، الشريط على الوجهين، وغطاء زجاجي (24 × 60 ملم). سمك الاكريليك ورقة طبقة 2 هو 2 مم والطبقات الثلاث الأخرى هي كل 1 مم. في الجزء الأسفل من ثلاث طبقات الاكريليك، جسر الملح وشبكات تدفق المتوسطة يتم تمثيل الكتل الزرقاء والحمراء، على التوالي. في أول طبقة الاكريليك ورقة، واستخدمت محولات الاكريليك الخضراء لحقن الاغاروز. تم استخدام محولات الاكريليك الزرقاء كاتصال إلى الأقطاب حج / أجكل. هناك أربع غرف زراعة الخلايا في رقاقة MDF. المنطقة وارتفاع كل غرفة زراعة الخلايا هي 148 مم 2 (3 × 46 مم) و 0.07 ملم، على التوالي. القنوات زرقاء صغيرة على طبقات 3 و 4 ربط شبكة جسر الملح إلى غرف الثقافة. المقطع العرضي لهذه القنوات اتصال 0.25 ملم وآخرون، 8 حقوق الطبع والنشر 2014، المعهد الأمريكي للفيزياء). (ب) صورة من جميع مكونات التجمع جهاز MDF، تضم ورقة PMMA، محولات الاكريليك، الشريط على الوجهين، وغطاء زجاجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
ومكتوب الرقم 2. MDF تصنيع رقاقة والتجمع العمليات. (A) أنماط من الاكريليك ورقة، والشريط على الوجهين التي كتبها CO 2 بالقطع الليزر. ملفقة (B) للفرد طبقات الاكريليك ورقة من CO 2 الليزر وفقا للرسم التصميم. (C) ورقة الاكريليك تنظيفوالمستعبدين الصورة معا باستخدام بوندر الحراري. (D) المنجزة التجمع MDF رقاقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نظام لانجذاب كهربي الدراسة. (A) رسم تخطيطي للنظام للتجربة انجذاب كهربي. تم استخدام أنابيب متصلة رقاقة MDF للتسريب المتوسط ​​وهروب رأس المال من النفايات. أجري dcEF في رقاقة من خلال حج / أجكل الأقطاب الكهربائية وإمدادات الطاقة. تم تثبيت إعداد الجهاز على محرك المرحلة XYZ المجهر. وقد أخذت صور خلية في رقاقة من قبل الكاميرا الرقمية SLR التجارية. (ب) صورة من مكونات شبكة تدفق المتوسطة والجيل dcEF في نظام ميكروفلويديك MDF، incluقرع (ط) في أنبوب موصل، (ب) أنابيب microcentrifuge مفتوحة القاع، (ج) بيضاء صلبة الجوز إصبع ضيق، (د) شفاف أنبوبي الجوز إصبع ضيق، و (ت) الأقطاب حج / أجكل. يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
تم تطبيق الرقم 4. تأثير Y27632 على خلية سرطان الرئة الهجرة تحت EFS من (A) صفر و (B) 300 فولت / مم. dcEF التحفيز بعد المعالجة 1 ساعة مع تركيز المشار إليه من Y27632. استمر التحفيز الكهربائي لمدة 2 ساعة. التحليل الكمي للتوجيه الأعضاء وسرعة هجرة الخلايا consititute تجربة تمثيلية. واستخدمت 90-100 الخلايا في تحليل البيانات. * لP <0.001. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± الخطأ المعياري لليعني (SEM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وجدنا عملية الانضمام محولات الاكريليك على طبقة 1 من الشريحة MDF إلى أن تكون خادعة. تطبيق فقط 1-2 ميكرولتر من الغراء سوبر كافية وثبتك على محول على رقاقة MDF. أدت كميات أكبر من الغراء في بلمرة غير مكتملة من الغراء عظمى، وعدم الالتزام. مرة واحدة تم الالتزام محولات الاكريليك بشدة على رقاقة MDF، ونادرا ما حدث تسرب السائل في نظام ميكروفلويديك. وبالإضافة إلى ذلك، ساعدت O / N الحضانة داخل فراغ الغرفة لإزالة الهواء المحبوس بين الشريط على الوجهين / الغطاء الزجاجي أو على الوجهين واجهة ورقة الشريط / الاكريليك. ونتيجة لذلك، فإن هذه العملية من شأنه أن يعزز الاستقرار في غرفة الثقافة في رقاقة MDF.

التحكم في درجة الحرارة من الاغاروز 3٪ خلال إعداد شبكة جسر الملح هو المهم. إذا كانت درجة الحرارة من الاغاروز ليست عالية بما فيه الكفاية خلال الحقن، فإن الاغاروز يصلب بسرعة داخل الحقنة، ويمكن لايتم حقنه في شبكة جسر الملح. وعلاوة على ذلك، خلال حقن الاغاروز، فمن المهم تجنب أي تشكيل فقاعة في شبكة جسر الملح. ظهور فقاعات يزيد كثيرا من المقاومة الكهربائية للشبكة ويؤدي إلى فشل التجربة. بالإضافة إلى ذلك، مرة واحدة يتصلب الاغاروز خلال الحقن، فإنه لا يمكن منع تماما تدفق السائل في القناة جسر الملح. على هذا النحو، يمكن للمواد الكيميائية ثم تسرب بسهولة إلى قنوات أخرى. أفضل نهج هو لحقن الاغاروز الساخن في الشبكة وثم السماح للالاغاروز ليصلب داخل القنوات جسر الملح.

حقن الخلايا هو عملية حاسمة في التجربة انجذاب كهربي. لضمان وجود عدد كاف من الخلايا للزرع خلية في غرفة الثقافة، ونحن حقن عدد الزائد من الخلايا. في هذا النهج، تم حقن الخلايا من منفذ. يجب أن تكون سرعة حقن بطيء وحتى لتجنب التوزيع غير المتكافئ خلية في غرفة الثقافة. بالإضافة إلى ذلك، لأنقنوات معزولة في رقاقة MDF، ويجب أن يتم حقن قناة واحدة في وقت واحد. وهكذا، واستكمال عملية حقن الخلايا تستغرق وقتا طويلا. في المستقبل، سيكون من الضروري إنشاء قناة حقن الخلايا الإضافية التي يمكن زرع الخلايا في وقت واحد في جميع الدوائر ثقافة الأربعة. وهذه العملية الجديدة تقلل من حجم العينة، وعدد من الخلايا اللازمة للحقن، ووقت التشغيل.

هناك العديد من المزايا في استخدام الأكريليك بدلا من PDMS مثل المادة لأجل افتعال الجهاز ميكروفلويديك. جهاز تستند الاكريليك يمكن تشغيلها مباشرة على سخان دون حاضنة. لأن النظام لا يتطلب أي CO 2 العرض، والخلايا يمكن زراعتها في رقاقة الحيوية ميكروفلويديك القائمة على الاكريليك على مجهر مقلوب منتظم مع سخان. فمن الأسهل لتسجيل الصور خلية في رقاقة خارج حاضنة. استخدمنا كاميرا SLR الرقمية التجارية على نطاق واسع لتسجيل الصور خلية في النظام. بالإضافة إلى ذلك، لينةوير اللازمة للسيطرة على برمجة الكاميرا غير متاحة بسهولة أيضا. وهذا يجعل التصوير الوقت الفاصل بين الخلايا برمجة بسهولة. ولذلك، فإن تكلفة بناء صناعة السيارات في تسجيل صورة النظام الحيوي ميكروفلويديك أقل بكثير من نظام التجاري. في المقابل، عند استخدام شريحة استنادا PDMS، يجب أن يتم تشغيل النظام في CO 2 الحاضنة. وبالتالي، يجب شراؤها صورة اضافية معدات التسجيل للعمل في الحاضنة. هذه المعدات باهظة الثمن، ضخمة نسبيا، وتحتل جزءا كبيرا من مساحة محدودة في حاضنة الثقافة الخلية. وفي جانب آخر، بالمقارنة مع عملية PDMS رقاقة تلفيق وافتراء من السهل والسريع للالصغرى الاكريليك فلوريدا رقاقة uidic مناسب لكلا النماذج الجهاز والإنتاج. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع جهاز يعمل بنظام PDMS، رقاقة ميكروفلويديك القائمة على الاكريليك هو هيكليا أكثر استقرارا وأكثر ملاءمة لبناء ثلاثي الأبعاد نظام شبكة ميكروفلويديك معقدة، كما كانأجريت مع رقاقة MDF في هذه الدراسة. لا يمكن أنتجت شبكة جسر الملح على رقاقة في رقاقة MDF بسهولة في جهاز يستند PDMS. هذا النظام شبكة يقلل من الحجم الإجمالي للرقاقة ميكروفلويديك ويجعل انجذاب كهربي البحوث أسهل وأسرع.

داخل الرقاقة MDF، ولدت لنا اثنين فقط من القوة الكهربائية الميدان (EFS، 0 و 300 فولت / مم) في كل قناة معزولة. ومع ذلك، فإن رقاقة MDF ورقاقة electrotactic متعددة الميدان، كما أفاد هوانغ آخرون، 4 حصة تصميم قناة مماثل في منطقة ثقافة الخلية. عن طريق تغيير الأشكال من غرفة الثقافة في رقاقة MDF، ويمكن أيضا أن تتولد EFSs متعددة على رقاقة MDF. مع هذه التعديلات، متعددة EFSs ومواد كيميائية متعددة يمكن أن تستخدم في نفس الاختبار. وبناء على ذلك، يمكن إنشاء نظام فحص إنتاجية عالية للتحقيق في انجذاب كهربي باستخدام الجهاز.

في تجربة واحدة فقط، ورقاقة MDF قادر على اختبار آثارالمواد الكيميائية المختلفة على الخلايا تحت dcEF، أو تأثيرات التحفيز الكهربائي على أنواع مختلفة من الخلايا. بل انه قد يكون من الممكن تنفيذ 20 قنوات موازية معزولة في رقاقة MDF دون زيادة كبيرة في حجم الجهاز. 8 كما هو موضح في هذا العمل، في تجربة واحدة، حصلنا على علاقة تعتمد على الجرعة كبير بين توجيه الأعضاء للهجرة الخلايا و Y27632 (الشكل 4). رقاقة MDF مع أربع قنوات ينص بشكل واضح على نهج فعال لدراسة انجذاب كهربي في الخلايا السرطانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM medium Gibco,Invitrogen, USA 12800-017
Fetal Bovine Serum Gibco,Invitrogen, USA 16000-044
Trypsin Gibco,Invitrogen, USA 25200-072
PBS Basic Life BL2651
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical Co 10005583
agarose LONZO, USA SeaKem LE AGAROSE
syringe Terumo 3 ml with Luer taper
3-way stopcock Nipro with Luer taper
PMMA (acrylic) HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan thickness 1mm, 2mm
acrylic adaptor KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan 1/4-28 port, 10x10x6 mm customized
nut Thermo Fisher Scientific Inc. UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Microscope cover glass Deckgläser, Germany 24x60 mm
double-sided tape 3M PET 8018
super glue 3M Scotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergent Franklab, France TFD4
ultrasonic steri cleaner LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonder KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan customized
CO2 laser scriber LTT group, Taiwan ISL-II
proportional-integral-derivative (PID) controller JETEC Electronics Co., Japen TTM-J40-R-AB,
K-type thermocouple TECPEL TPK-02A
4-channel syringe pump KdScientific, USA 250P
DC power supply GWInstek, Taiwan
X-Y-Z motor stage TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan customized
inverted microscope Olympus, Japan CKX41
digital SLR camera Canon, Japan 60D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  2. Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
  3. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
  4. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  5. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
  6. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
  7. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
  8. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
  9. Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
  10. Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
  11. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
  12. Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
  13. Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
  14. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  15. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
  16. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
  17. Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
  19. Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
  20. Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
  21. Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
  22. Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 106، أكريليك، ميكروفلويديك، انجذاب كهربي، السرطان الرئوي والكيميائية المتزامنة / الأثر الكهربائي، البولى، PMMA
الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J.… More

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (106), e53340, doi:10.3791/53340 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter