Abstract
El comportamiento de la migración celular direccional bajo una corriente de campo eléctrico directo (dcEF) se conoce como electrotaxis. El papel importante de dcEF fisiológica en guiar el movimiento celular durante el desarrollo embrionario, la diferenciación celular, la curación de heridas y se ha demostrado en muchos estudios. Mediante la aplicación de chips de microfluidos a un ensayo electrotaxis, el proceso de investigación se acorta y los errores experimentales se reducen al mínimo. En los últimos años, los dispositivos de microfluidos hechas de sustancias poliméricas (por ejemplo, polimetilmetacrilato, PMMA, o acrílico) o polidimetilsiloxano (PDMS) han sido ampliamente utilizados en el estudio de las respuestas de las células a la estimulación eléctrica. Sin embargo, a diferencia de los numerosos pasos requeridos para fabricar un dispositivo de PDMS, la construcción simple y rápida de los micro acrílicos fl chip de uidic hace que sea adecuado tanto para la creación de prototipos dispositivo y la producción. Sin embargo, ninguno de los dispositivos reportados facilitar el estudio eficiente de la sustancia química simultánea y DCEF efectos sobre las células. En este informe, describimos nuestro diseño y fabricación de un multicanal basado en acrílico de campo eléctrico dual (MDF) de chips para investigar el efecto simultáneo de química y la estimulación eléctrica de las células del cáncer de pulmón. El chip MDF proporciona ocho combinaciones de estímulos eléctricos / químicos en una sola prueba. El chip no sólo acorta considerablemente el tiempo experimental requerido sino también aumenta la precisión en electrotaxis estudios.
Introduction
El comportamiento de las células adherentes que se mueven hacia un ánodo o cátodo bajo una corriente de campo eléctrico directo (dcEF) se conoce como electrotaxis. El comportamiento electrotactic de las células juega un papel importante en la embriogénesis, la regeneración del nervio, y la curación de la herida. 1 Las células tumorales tales como células de cáncer de próstata de rata, células de cáncer de mama 2, 3 y pulmonares células de adenocarcinoma 4-8 han demostrado movimiento electrotactic bajo una dcEF aplicado . El EF fisiológica se ha medido en tejidos de la glándula. 9,10 electrotaxis También se ha informado en las células tumor de la glándula asociada a 2,3. Tomados en conjunto, los electrotaxis de células de cáncer se considera que es un factor de metástasis. 11 El control de la orientación eléctrica de las células cancerosas en virtud de dcEF puede ser un enfoque potencial para el tratamiento futuro de cáncer. Sin embargo, hoy en día, el mecanismo molecular detallado de electrotaxis sigue siendo controvertido. Por lo tanto, una investigación de la influence de la estimulación eléctrica sobre la migración de células de cáncer puede facilitar el desarrollo de estrategias para el tratamiento del cáncer.
Recientemente, los dispositivos bio-microfluidos se han fabricado para el estudio de las respuestas celulares a fluir la fuerza de corte, 12 gradientes químicos, 13 y eléctrica estímulos 4 in vitro. La fabricación de dispositivos de microfluidos utilizando bio-polidimetilsiloxano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA, también conocido como acrílico) ha reducido con éxito la tasa de fracaso de tales experimentos. Por otra parte, el uso de dispositivos de microfluidos de base acrílica como un prototipo para la investigación de temas biológicos es más simple que el uso de chips de PDMS. Varias funciones en los dispositivos de base acrílica se han desarrollado para electrotaxis estudio. Sin embargo, ninguno de los diseños anteriores son capaces de probar simultáneamente los efectos de varias condiciones químicas y el campo eléctrico en las células para electrotaxis estudio. Por lo tanto, hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos-multichannel doble de campo eléctrico (MDF) cuatro canales de cultivo independientes y ocho condiciones experimentales diferentes en un chip que contiene chips.
El chip de MDF de base acrílica, primero reportada por Hou et al., 8 integra la estimulación eléctrica y varios canales aislados químicamente. Estos canales aislados químicamente se pueden utilizar para la cultura diferentes tipos de células en un experimento. El dcEF en los canales es producida por una fuente de alimentación eléctrica. Dos campos eléctricos independientes, uno con la fuerza aplicada de campo eléctrico (EFS) y otro con 0 EFS, se llevan a cabo en cada canal aislado químicamente. De esta manera, el chip proporciona EF coexistente mejor controlado y la estimulación química. Además, los resultados de la simulación numérica de la difusión química dentro del chip MDF indican que no se produjo la contaminación cruzada entre los canales después de un periodo experimental de 24 hr. 8
En comparación con el Device reportado por Li et al., 14 el chip MDF proporciona un área de cultivo a mayor, lo que permite para su posterior análisis bioquímico de las células estimuladas eléctricamente. Además, con área de observación más grande del chip MDF, más células pueden ser observados en la prueba, por lo que el análisis de la velocidad de migración o direccionalidad de las células estimuladas eléctricamente es más preciso. Los diseños de chips de un solo canal de estudios previos reportados por Huang et al. 4 y Tsai et al. 15 sólo permiten un tipo de célula o químico a ensayar. Sin embargo, el chip MDF puede utilizarse para investigar los efectos de diversos productos químicos en electrotaxis, así como los efectos de la estimulación eléctrica en diferentes tipos de células. En otras palabras, el chip MDF permite el estudio de dosis eficaz de dependencias químicas.
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Protocol
1. Diseño y Fabricación de la viruta de MDF
- Dibuja un patrón de capa acrílica individual utilizando software comercial, tales como AutoCAD, y guardar el patrón.
- Revisar el diseño del patrón de lámina acrílica de cuatro capas en la Figura 1A y confirmar las conexiones entre capas.
- Fabrique todas las hojas de acrílico y la cinta de doble cara mediante ablación láser usando un láser scriber CO 2 (Figuras 1B, 2A y 2B). 16
- Encienda el Scriber láser y conectar el equipo a la computadora portátil de control.
- Ejecute el software comercial y abrir el patrón diseñado en el paso 1.1, haga clic en "archivo de patrones diseñados."
- Coloque un pedazo de hoja de acrílico blanco o cinta de doble cara en el escenario XYZ del scriber láser.
- Establecer el foco del haz de láser en la superficie de la lámina de acrílico o cinta de doble cara con un auto-alignment stick proporcionado por el fabricante de la punta de trazar láser.
- Enviar el patrón diseñado para la punta de trazar de láser para el mecanizado directo de la lámina de acrílico o cinta de doble cara.
- Retire el papel protector de las hojas de acrílico utilizando pinzas y soplar la superficie limpia con gas nitrógeno.
- Pila de las hojas de acrílico y unir juntos bajo una presión de 2 kg / cm 2 en un dispositivo de unión térmica durante 45 minutos a 110 ° C para formar el / conjunto de canal estimulación eléctrica de flujo.
- Preparar la cubierta de vidrio de microscopio como el sustrato de cultivo celular en el chip.
- Ponga la cubierta de vidrio a una cubeta y llenar el frasco con una dilución de diez veces del detergente que figuran en la lista de materiales.
- Ponga la cubierta de vidrio y jarra de tinción en una Steri-limpiador ultrasónico y limpiar la cubierta de vidrio durante 15 minutos.
- Vierta el detergente diluido fuera del tarro tinción, vuelva a llenar el recipiente con agua destilada y repetir el paso 1.5.2 3 veces.
- Se seca la cubierta de vidrio limpiado mediante soplado con gas nitrógeno antes de adherir a la cinta de doble cara.
- Pegue la cubierta de vidrio limpiado a la / conjunto de canal estimulación eléctrica de flujo con la cinta de doble cara con dibujos en el paso 1.2.
- Adherirse 13 piezas de adaptadores de acrílico a las aberturas individuales en la capa 1 del conjunto de chips MDF con pegamento. El conjunto de chips MDF es entonces completa (Figura 2D).
- Esterilizar el conjunto completo de chip MDF con 30 min de irradiación UV antes de su uso.
2. Configuración de la Red Puente La sal de la viruta de MDF
- Antes de su uso, esterilizar todos los tubos de plástico, las tuercas con los dedos, y tubos de microcentrífuga que se muestran en la Figura 3B mediante el establecimiento de un tiempo de retención de 15 min a 121 ° C en el autoclave.
- Conecte los tubos fluoroplástico (Figura 3B-i) a la asamblea chip de MDF a través de la entrada del medioy los adaptadores de salida muestran en la Figura 1A.
- Conecte el cono Luer de la entrada del medio y la salida de los tubos de plástico en la figura 3B-i a las llaves de paso de 3 vías.
- Tomar 2,5 ml de CO 2 salina tamponada con fosfato -equilibrated (PBS) usando una jeringa de 3 ml y conectar la jeringa a la llave de paso de 3 vías del tubo de plástico de entrada. Conectar una jeringa vacía de 3 ml a la llave de paso de 3 vías del tubo de plástico de salida. Las dos jeringas son así interconectados a través del chip MDF.
NOTA: Incubar la PBS en el 37 ° C 5% -CO 2 incubadora de células de cultivo O / N para obtener CO 2 -equilibrated PBS. - Selle las aberturas del azul y los adaptadores verdes (Figura 1A) en la hoja de PMMA Capa 1 con las tuercas con los dedos sólidos blancos (Figura 3B-iii).
- Llene los canales del puente de sal y cámaras de cultivo con el CO 2 -equilibrated PBS en la jeringa se describe en el paso de instalación 2.4. Evitarla formación de burbujas.
- A continuación, poner el CO 2 -equilibrated PBS que contiene chips de MDF en el 37 ° C 5% CO 2 incubadora de cultivo celular para O / N de incubación. Esto permite que el aire disuelto en la cinta de doble cara para formar burbujas en las cámaras.
- Enjuague de distancia las burbujas en los canales por un flujo rápido de PBS en el canal utilizando las dos jeringas. Bombear el PBS de ida y vuelta si es necesario.
- Escurrir el PBS en los canales a través de la llave de paso de 3 vías conectada al tubo de salida medio.
- Utilizando una nueva jeringa de 3 ml, tomar 2,5 ml de CO 2 -equilibrated Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (véase el paso 3.5), y reemplazar la jeringa conectada a la entrada con el nuevo. Vuelva a llenar los canales con el medio.
- Preparación de la red de puente de sal.
- Eliminar temporalmente las tuercas sólidos (Figura 3B-iii) en los adaptadores verdes (Figura 1A) e inyectar 3% caliente (> 70 ° C) de agarosa al bri salcanal dge a través de la abertura en la adaptadores verdes (Figura 1).
NOTA: Preparación de agarosa caliente: Disolver 1,5 g de polvo de agarosa en 50 ml de PBS. Esterilizar estableciendo un tiempo de retención de 20 min a 121 ° C en el autoclave. - Detener la inyección de la agarosa cuando el líquido llena tres cuartas partes de la longitud del canal de puente salino.
- Sellar los poros en los adaptadores verdes (Figura 1A) atornillando las tuercas de sólidos (Figura 3B-iii) después de la inyección de agarosa.
- Vuelva a colocar las tuercas sólidos sobre los adaptadores azules (Figura 1A) con las tuercas con los dedos tubulares translúcidos (Figura 3B).
- Cargue el 3% precalentado agarosa en las tuercas tubulares (Figura 3B-IV).
- Insertar los electrodos de Ag / AgCl (Figura 3B-V) en las tuercas tubulares (Figura 3B-iv) antes de lasolidificación de la agarosa.
- Eliminar temporalmente las tuercas sólidos (Figura 3B-iii) en los adaptadores verdes (Figura 1A) e inyectar 3% caliente (> 70 ° C) de agarosa al bri salcanal dge a través de la abertura en la adaptadores verdes (Figura 1).
- Después de completar la configuración de la red de puente de sal, inyectar las células de cáncer de pulmón CL1-5 en las cámaras de cultivo, una de las cámaras a la vez.
3. Preparación de las células cancerosas y puesta en marcha para el Experimento Electrotactic
- Cultura regular de línea celular de cáncer de pulmón CL1-5.
- Cultura de las células de cáncer de pulmón, CL1-5 obtenidos del Prof. Pan-Chyr Yang, 17 en el medio completo en un frasco de cultivo celular 75T a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. El medio completo se compone de DMEM y suero bovino fetal al 10% (FBS). Sub-cultivar las células cada 3 ó 4 días. Las células utilizadas para la realización de experimentos electrotaxis están a menos de 25 pasajes de la fuente original.
- Añadir 2 ml de tampón de tripsina 0,25% a las células en crecimiento exponencial CL1-5 y se incuba durante 2 min en el 37 ° C 5% -CO 2 incubadora de cultivo celular para detachmen celularest.
- Terminar el proceso de desprendimiento con 6 ml de DMEM 10% de FBS y centrifugar las células a 300 g durante 5 min a TA. Entonces desechar el medio y suspender el sedimento celular con 5 ml de PBS.
- Contar el número de células en el PBS. Luego tomar 1 x 10 6 células y centrifugar a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Deseche la PBS. Suspender las células con pre-calentado CO 2 -equilibrated DMEM y ajustar la densidad de las células a ser de 1 × 10 6 células / ml.
NOTA: Incubar el medio completo en el 37 ° C 5% CO 2 cultivo celular incubadora O / N para obtener el CO 2 -equilibrated DMEM.
4. Configuración para las Experimento Electrotactic
- Desde la salida del chip MDF, inyectar 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, de las células en el chip.
- Incubar el chip MDF sembrado de células en la incubadora de cultivo celular (fijado en 37 ° C y 5% de CO 2) durante 2-4 horas.
- Configuración de MDF microsistema fluídico.
- Instale el sistema de microfluidos MDF en un calentador de cristal de óxido de indio y estaño transparente (ITO). Medir la temperatura del chip de MDF con un termopar de tipo K recortado entre el chip MDF y vidrio ITO. Controle el calentador de ITO con un controlador proporcional-integral-derivativo (PID). Ajuste la temperatura de incubación de microfluidos sistema de MDF de 37 ° C con el controlador PID.
NOTA: La fabricación del calentador de ITO y la configuración del sistema de calentamiento de células de cultivo se describen en los informes anteriores 18,19. - Montar el conjunto de chip de MDF de temperatura controlada en la etapa motorizada XYZ controlada por ordenador en un microscopio invertido. El uso de la platina motorizada se describe en el paso 5.1. Bombear el medio completo en las cámaras de cultivo a través de las entradas con una bomba de jeringa de cuatro canales.
- Instale el sistema de microfluidos MDF en un calentador de cristal de óxido de indio y estaño transparente (ITO). Medir la temperatura del chip de MDF con un termopar de tipo K recortado entre el chip MDF y vidrio ITO. Controle el calentador de ITO con un controlador proporcional-integral-derivativo (PID). Ajuste la temperatura de incubación de microfluidos sistema de MDF de 37 ° C con el controlador PID.
- Bombear el medio completo en el chip MDF con un caudal de 20 l / hr. Los residuos cultura del cabolets se recoge en los tubos de microcentrífuga (que se muestran como "residuos" en la figura 3A).
- Se incuban las células para otro 16-18 horas a 37 ° C en el chip de MDF.
- Para reemplazar el medio, bombear el medio que contiene 50, 25, 5 y 0 inhibidor de quinasa mu M, respectivamente, en cada cámara de cultivo a una velocidad de flujo de 20 l / min durante 10 min.
NOTA: Preparar una solución madre 10 mM del inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho Y27632 mediante la adición de 3 ml de agua estéril para el inhibidor de 10,6 mg quinasa. Diluir la solución madre 10 mM a 50, 25, y 5 mM, respectivamente, utilizando 10% de medio FBS DMEM. - Se incuban las células en el inhibidor de la quinasa durante otros 60 min a 37 ° C. Ajuste el caudal medio de 20 l / h. Utilice la misma temperatura cultura y la tasa se ha descrito anteriormente en los pasos posteriores fluir.
- Utilice cables eléctricos para conectar una fuente de alimentación DC para el chip MDF a través de los electrodos de Ag / AgCl en el chip.
- Conectar en serie un i amperímetron el circuito eléctrico. Utilice el amperímetro para vigilar la corriente eléctrica en el chip de MDF.
- Encienda la fuente de alimentación de CC y ajuste el amperímetro actual a 86.94 mu mediante el ajuste de la tensión de alimentación de entre 15 y 19 V.
NOTA: Teniendo en cuenta la ley de Ohm, E = I / (s A eff), donde I es la corriente eléctrica que fluye a través del material a granel, es decir, el medio de cultivo en la cámara de electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) es el conductividad del medio de cultivo, A eff (= 0,21 mm 2 para una anchura de 3 mm x 0,07 mm de altura) es el área de sección transversal efectiva de la cámara de electrotactic, y la corriente eléctrica (I) necesaria para generar un 300 mV / mm EF en el chip de MDF es 86,94 mu.
5. Adquisición y Análisis de Imágenes celulares
- Controlar la platina motorizada mediante un programa MATLAB GUI. Con el sistema de microfluidos MDF montado en el microscope, mueva el chip a las regiones de observación mediante la platina motorizada.
- Imágenes de células registro utilizando una cámara digital réflex de lente única (SLR) montadas en el microscopio.
- Tomar imágenes microscópicas utilizando una lente objetivo 4X a intervalos de 15 min durante 2 horas.
- Análisis de la migración celular.
- Ejecute NIH ImageJ 1,47 V.
- Analizar la distancia desde la inicial a las posiciones finales de centroide de la célula.
- Ir a "Archivo" → "Importar" → "Secuencia de imágenes," e importar nueve imágenes para el análisis de la migración celular. La primera imagen es el resultado del tiempo cero, y la última imagen es el resultado de 120 min.
- Ir a "Analizar" → "Establecer Medidas" y marque la casilla junto a "centroide"
- Haga clic en el icono "Freehand Selecciones".
- Representar el borde de las celdas seleccionadas en la primera imagen.
- Ir a "Editar" → "Selección" → "Añadir a Manager"
- Ir a la novena imagen y representar el borde de las mismas células seleccionadas en la primera imagen. Las posiciones de células pueden ser rastreados utilizando el segundo a las imágenes octavo.
- Ir a "Editar" → "Selección" → "Añadir a Manager"
- Repita los pasos 5.4.5 al 5.4.9 para recopilar datos de 90 a 100 células.
- Ir a "Analizar" → "Medida" para obtener el resultado de las posiciones inicial y final de las celdas seleccionadas.
NOTA: La velocidad de migración se define como la longitud media de movimiento de la célula por hora. La direccionalidad se define como coseno, donde es el ángulo entre el vector de la dcEF (cátodo del ánodo al) y el vector desde el punto de partida de una célula a su posición final. La direccionalidad es -1 para las células que migran hacia el ánodo y 1 para las células que migran hacia el cátodo. Para un grupo de azar mirejilla de celdas, la direccionalidad es 0. 2
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Representative Results
Fabricación y montaje del dispositivo de MDF
Un diagrama esquemático del chip MDF de base acrílica se muestra en la Figura 1A. Cuatro hojas de acrílico, una cubierta de vidrio, 13 adaptadores de acrílico, y un trozo de cinta de doble cara se utilizan en el montaje del chip MDF completado (Figura 2D). Sólo hay cuatro canales independientes de cultivo en el dispositivo de MDF. Sin embargo, la red de puente de sal en el chip crea ocho condiciones experimentales diferentes en los ocho segmentos del chip. Tres puentes salinos (los canales de color azul en la capa 2 de la Figura 1A), 79, 90, y 80 mm de longitud, se acoplaron a la segunda capa del chip MDF sin interferir con la observación de la imagen. Los pequeños poros (canales cuboides azules en las capas 3 y 4 de la Figura 1A) entre la red de puente salino y de las cámaras de cultivo, que tienen un 00,25 mm 2 área de sección transversal, minimiza el flujo de fluido en el puente de sal durante el experimento. El área de la cultura del chip MDF es de aproximadamente 74 mm 2 en cada segmento. En esta demostración, las cámaras de cultivo de células del dispositivo de MDF se componen de la 70 m de espesor de cinta y la cubierta de cristal de doble cara. Sin embargo, si diferentes condiciones de cultivo celular (por ejemplo, un requisito recubrimiento de colágeno, la cizalladura de flujo bajo, o gran volumen medio de cultivo en la cámara de cultivo) se necesita para la investigación electrotaxis, tanto los sustratos de cultivo y las cintas podrían ser reemplazadas fácilmente. Por lo tanto, varios tipos de células se pueden utilizar para electrotaxis estudio dentro del chip de MDF.
Configuración del sistema de microfluidos MDF
La configuración del sistema de microfluidos MDF se ilustra en la Figura 3A. Los componentes mostrados en la Figura 3B son used para establecer el flujo medio y la red de corriente eléctrica en el sistema de microfluidos MDF. Los tubos conectados con las tuercas huecas con los dedos (rojo y verde) y cirios Luer (marrón) en la figura 3B-i se utilizan para el transporte de media a la red de flujo de MDF. Después de las jeringas se conectaron a los conos Luer y se establecieron en la bomba de cuatro canales, el sistema de flujo de la tubería fue completa. El medio de cultivo y los residuos son transportados a través del sistema de tuberías. Debido a que la conexión entre los tubos y adaptadores acrílicos se sujetan por medio de conectores roscados, la red de media MDF puede tolerar una mayor presión hidráulica que puede el sistema de PDMS. Debido a la extrema baja permeabilidad al aire de las hojas de acrílico y los tubos, cualquier contacto entre la red de media y el entorno exterior se bloquea. Por lo tanto, el valor de pH del medio en el sistema se mantiene estable, y las células pueden cultivarse utilizando el sistema de microfluidos MDF fuera de una incubadora de CO 2. Dado que el ch MDFIP está instalado en una platina motorizada, imágenes de células de lapso de tiempo se puede tomar de ocho secciones individuales. Los tubos de microcentrífuga de fondo abierto (Figura 3B-ii) están montados en las tuercas con los dedos tubulares translúcidos (Figura 3B-iv) para aumentar la capacidad de volumen de agarosa. De esta manera, relativamente grandes electrodos se pueden insertar en la agarosa para proporcionar estimulación eléctrica estable a las células durante períodos de tiempo más largos.
Generación de indicada campo eléctrico de corriente continua en el chip MDF
La tensión de cada cámara se puede medir a través de los electrodos implantados en el chip conectado circuito eléctrico. Sin embargo, no se midió la tensión en la cámara. Más bien, simulamos el campo eléctrico en la red de puente de sal y las cámaras de cultivo de células del chip. Cuatro cámaras electrotactic estaban en serie connectar en los circuitos eléctricos. De esta manera, la misma corriente eléctrica se mantiene en cada una de estas cámaras. Según la ley de Ohm, la EFS se correlaciona con el área de la sección transversal de las cámaras en el dispositivo de microfluidos. Además, todas las hojas de PMMA y cintas fueron fabricados por la punta de trazar láser de CO 2. La alineación de las piezas de montaje de chips es preciso y los defectos estructurales del chip son mínimos. Por lo tanto, las EFS en cada cámara debe permanecer estable. Los resultados de la simulación del campo eléctrico muestran una distribución homogénea de EFS con 300 y 0 mV / mm en las primeras mitades y las mitades restantes de las cámaras de cultivo en el dispositivo (datos no mostrados). Anteriormente, los informes de nuestro laboratorio, Huang et al. y Tsai et al., han demostrado que la diferencia en la medida y los valores simulados de EFS fue inferior a 4%. 4,15 Este resultado muestra que, en nuestro sistema, el campo eléctrico medido se corresponde bien con el valor simulado. En este work, insertamos grandes electrodos de Ag / AgCl para proporcionar corriente eléctrica estable durante un largo experimento. La corriente aplicada en el chip MDF sólo disminuyó 1,85 ± 0,19% después de 7 horas de EF estimulación en los experimentos electrotaxis. Por otra parte, el período más largo de la estimulación eléctrica fue de 4 horas en nuestro estudio. Por lo tanto, creemos que la corriente eléctrica de entrada se mantiene estable durante electrotaxis pruebas, y el campo eléctrico en las cámaras electrotactic del chip MDF son monitoreados por el amperímetro conectados en serie.
La investigación de los electrotaxis de las células del cáncer de pulmón que utilizan el sistema de microfluidos MDF
La regulación electrotactic de asociado-Rho espiral de la bobina quinasa (ROCK) se ha demostrado en células de ovario de hámster chino (CHO), 20 endotelial, 21 y 22 células neuronales, pero aún no se ha investigado para el cáncer de pulmón cells. Por lo tanto, el inhibidor de ROCK, Y27632, se aplicó al sistema de microfluidos MDF para estudiar su efecto sobre las electrotaxis de células de cáncer de pulmón. Como se muestra en la Figura 4, el tratamiento de Y27632 no mostró ningún efecto en la alteración de la velocidad de migración de las células con o sin estimulación eléctrica. Sin embargo, la aplicación de Y27632 a las células cancerosas bajo dcEF (300 mV / mm) redujo significativamente su migración anódica. A una concentración 50 mM-, el inhibidor de ROCA eliminó el movimiento anódica de las células cancerosas de pulmón, pero no afectó a su velocidad de migración. Por otra parte, hubo una correlación dependiente de la dosis entre las concentraciones químicas aplicadas y el índice de direccionalidad (Figura 4B). Estos resultados sugieren que el sistema de microfluidos MDF es confiable y eficiente para el estudio de electrotaxis.
Figura 1. Design del chip MDF. (A) Esquema del chip MDF. El dispositivo de MDF consta de cuatro capas de láminas de acrílico (72 × 50 mm), 13 adaptadores acrílicas (10 × 10 × 6 mm), cinta de doble cara, y una cubierta de vidrio (24 × 60 mm). El espesor de la lámina de acrílico de capa 2 es 2 mm y los otros tres capas son cada uno 1 mm. En las tres capas inferiores de acrílico, el puente de sal y redes de flujo medio, están representados por los bloques de color azul y rojo, respectivamente. En la primera capa de la lámina acrílica, se utilizaron adaptadores acrílico verdes para la inyección de agarosa. Adaptadores azul de acrílico se utilizaron como la conexión a los electrodos de Ag / AgCl. Hay cuatro cámaras de cultivo celular en el chip de MDF. El área y la altura de cada cámara de cultivo celular son 148 mm 2 (3 × 46 mm) y 0,07 mm, respectivamente. Los pequeños canales azules en las capas 3 y 4 conectan la red de puente salino a las cámaras de cultivo. La sección transversal de estos canales de conexión es de 0,25 mm
Figura 2. MDF fabricación de chips y montaje procesos. (A) Los patrones de la hoja de acrílico y cinta de doble cara se describe por el CO 2 de mecanizado láser. (B) Las capas de lámina acrílica individuales fueron fabricados por un láser CO 2 de acuerdo con el dibujo del diseño. (C) La hoja de acrílico limpiados se unen entre sí mediante un dispositivo de unión térmica. (D) Terminado el montaje de chips MDF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Sistema para electrotaxis estudio. (A) Diagrama esquemático del sistema para el experimento electrotaxis. Los tubos conectados al chip MDF se utilizaron para la infusión de medio y flujo de salida de residuos. El dcEF en el chip se llevó a cabo a través de la Ag / AgCl electrodos y fuente de alimentación. La configuración del dispositivo se ha instalado en el escenario del motor XYZ de un microscopio. Imágenes celulares en el chip fueron tomadas por una cámara réflex digital comercial. (B) Fotografía de los componentes de la red de flujo del medio y la generación dcEF en el sistema de microfluidos MDF, including (i) el conector del tubo, (ii) tubos de microcentrífuga de fondo abierto, (iii) sólido blanco tuerca con los dedos, (iv) la tuerca con los dedos tubular translúcido, y (v) Los electrodos de Ag / AgCl. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Efecto de Y27632 sobre la migración celular de cáncer de pulmón en las EFS de (A) cero y (B) 300 mV / mm. DcEF estimulación se aplicó después de un tratamiento previo 1 h con la concentración indicada de Y27632. La estimulación eléctrica se prolongó durante 2 hr. El análisis cuantitativo de la direccionalidad y la velocidad de la migración de células consititute un experimento representativo. 90-100 células se utilizaron en el análisis de datos. * para P <0,001. Los datos se expresan como la media ± error estándar dela media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nos pareció que el proceso de adherirse adaptadores de acrílico en la capa 1 del chip MDF a ser complicado. La aplicación de sólo 1 a 2 l de pegamento es suficiente para adherirse firmemente el adaptador en el chip de MDF. Grandes cantidades de cola como resultado una polimerización incompleta del pegamento y la falta de adhesión. Una vez que los adaptadores de acrílico estaban firmemente adherido sobre el chip MDF, fuga de líquido en el sistema de microfluidos rara vez se produjo. Además, O / N de incubación dentro de la cámara de vacío ayudó a eliminar el aire atrapado entre la cinta de doble cara / cubierta de vidrio o de la interfaz de hoja de cinta / acrílico de doble cara. En consecuencia, este proceso mejora la estabilidad de la cámara de cultivo en el chip MDF.
El control de temperatura de la agarosa 3% durante la preparación de la red de puente salino es importante. Si la temperatura de la agarosa no es lo suficientemente alta durante la inyección, la agarosa se solidifique rápidamente dentro de la jeringa y no puedeser inyectado en la red de puente de sal. Por otra parte, durante la inyección de agarosa, es importante para evitar cualquier formación de burbujas en la red de puente de sal. La aparición de burbujas aumenta en gran medida la resistencia eléctrica de la red y conduce al fracaso experimental. Además, una vez que la agarosa se solidifica durante la inyección, no puede bloquear completamente el flujo de líquido en el canal de puente salino. Como tal, los productos químicos pueden entonces filtrarse fácilmente en otros canales. El mejor enfoque consiste en inyectar agarosa caliente en la red y luego permitir que la agarosa se solidifique dentro de los canales de puentes de sal.
Inyección de la célula es un proceso crítico en el experimento electrotaxis. Para asegurar un número suficiente de células para la siembra de células en la cámara de cultivo, se inyecta el exceso de número de células. En este enfoque, las células se inyectaron de la toma. La velocidad de inyección debe ser lenta y uniforme para evitar una distribución desigual de células en la cámara de cultivo. Además, debido a lacanales están aislados en el chip de MDF, la inyección se debe hacer un canal a la vez. Por lo tanto, el proceso de la inyección de células completa es mucho tiempo. En el futuro, será necesario para crear un canal de la inyección de células adicionales que pueden simultáneamente células implante en las cuatro cámaras de cultivo. Este nuevo proceso reducirá volumen de la muestra, el número de células requeridas para la inyección, y el tiempo de operación.
Hay varias ventajas en el uso de acrílico en lugar de PDMS como el material para fabricar el dispositivo de microfluidos. Un dispositivo de base acrílica se puede operar directamente sobre un calentador sin una incubadora. Dado que el sistema no requiere suministro de CO 2, las células se pueden cultivar en un chip microfluídico-bio de base acrílica en un microscopio invertido regular con el calentador. Es más fácil para grabar imágenes de células en el chip fuera de una incubadora. Se utilizó una cámara réflex digital comercial ampliamente disponible para grabar las imágenes de células en el sistema. Además, el suavevajilla necesaria para el control programable de la cámara también es fácilmente disponible. Esto hace time-lapse de las células fácilmente programable. Por lo tanto, el costo de construcción del sistema de imagen de grabación automática-bio de microfluidos es mucho menor que la de un sistema comercial. En contraste, cuando se utiliza un chip a base de PDMS, el sistema debe ser operado en una incubadora de CO 2. Por lo tanto, la imagen de más equipo de grabación se debe comprar para su funcionamiento en la incubadora. Tal equipo es caro, relativamente voluminoso, y ocupa una gran porción del espacio limitado en la incubadora de cultivo celular. En otro aspecto, en comparación con el proceso de PDMS fabricación de chips, la fabricación fácil y rápida de los micro acrílicos fl chip de uidic es adecuado tanto para la creación de prototipos dispositivo y la producción. Además, en comparación con el dispositivo de PDMS basado en, el chip de microfluidos de base acrílica es estructuralmente más estable y más adecuado para la construcción de un sistema de red de microfluidos tridimensional complicada, como erarealizado con el chip de MDF en este estudio. La red de puente de sal en el chip en el chip MDF no se puede producir fácilmente en un dispositivo basado en PDMS. Este sistema de red minimiza el tamaño total del chip microfluídico y hace electrotaxis investigación más fácil y más rápido.
En el interior del chip de MDF, generamos sólo dos puntos fuertes de campo eléctrico (EFS, 0 y 300 mV / mm) en cada canal aislado. Sin embargo, el chip y el chip MDF electrotactic multi-campo, según lo informado por Huang et al., 4 comparten un diseño de canal similar en la región de cultivo celular. Al alterar la forma de la cámara de cultivo en el chip MDF, múltiples SDEs también se pueden generar en el chip MDF. Con estas modificaciones, múltiple SDEs y múltiples productos químicos se pueden utilizar en la misma prueba. Por consiguiente, un sistema de cribado de alto rendimiento podría ser creada para investigar electrotaxis utilizando el dispositivo.
En sólo un experimento, el chip MDF es capaz de probar los efectos dediferentes productos químicos en las células bajo dcEF, o las influencias de la estimulación eléctrica en diferentes tipos de células. Incluso puede ser posible implementar 20 canales paralelos aislados en el chip de MDF sin aumentar significativamente el tamaño del dispositivo. 8 Como se demostró en este trabajo, en un experimento, se obtuvo una correlación dependiente de la dosis significativa entre la direccionalidad de la migración celular y Y27632 (Figura 4). El chip de MDF con cuatro canales proporciona claramente un enfoque eficaz para el estudio de electrotaxis en las células cancerosas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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