Introduction
细胞迁移是高度协调和至关重要的许多生理过程，如组织发育，修复和再生，以及病理过程，如癌症转移和动脉硬化1。细胞迁移的理解是特别相关的用于修复受损的组织和治疗的病理状态，包括细胞移植技术和人工组织嫁接2新兴疗法。鉴于间充质干细胞（MSCs）在介导组织修复3，用分析是严格计量的，适应性强，具有成本效益的感兴趣量化这些细胞的迁移能力的作用，目前的利息。重要的是，这样的测定必须是足够敏感的损害后，以检测在细胞迁移能力相对微妙的变化。目前的方法用于定量细胞的迁移，包括刮测定法，反式井迁移测定（Boyden小通道琥珀），微柱阵列，和细胞排除区检测具有一系列在再现性，可定制，量化，和成本效益-1,4,5-限制。此处所描述的优化划痕试验表明健壮的结果，量化的和基于图像的分析能力，成本效益，并适应其它应用。
划痕试验已被用于多种能力来评估不同的实验条件下5细胞迁移和增殖。该检测限嗣继承播种指定的细胞，他们成长，完成或接近汇合，和刮擦产生的单层用消毒针头或吸管尖6。是最常见的，在随机选择的位置7-9比较所述划痕在多个时间点的宽度进行分析。尽管其突出使用，划痕试验通过与重现性和定量的问题混淆。变异代划痕不仅改变细胞的微环境，而且还可以通过破坏该板面和底层的细胞外基质5阻碍细胞的迁移。测定是经常进行了超过7〜12小时，但对于细胞株显示较慢的迁移和更长的实验时间，增殖成为一个混杂变量7,10。最后，通过划痕过程中产生的衰老细胞中可以释放与缩小差距，在单层1所需的细胞外信令干扰因素。优化划痕测定需要创建一个一致的间隙不与表面性质干扰，减少分析时间长度，并防止操作过程中不希望的细胞死亡。止动基础的分析是小区排除区域测定的优化。该测定法利用塞子放置在排除细胞生长的孔的中间，但是允许细胞可围绕中心隔离区电镀。为了评估迁移，挡块被删除，并将所得排除区提供了用于迁移发生的表面。然而，该测定是困难的定制或调整10和对于一些应用，这种技术也可以成本过高。
在对比划痕测定和它们的衍生物，反-井迁移测定（或Boyden小室测定法）通过定量细胞移动从一个腔室的数目，通过微孔滤膜过滤，到含有趋化剂8,11的室评估迁移 ， 12。这种技术具有有限的效用为贴壁细胞如间充质干因为以下通过多孔膜的迁移，细胞粘附在膜侧暴露于趋化剂，并且可能很难准确量化。虽然检测是能够研究一些三维的迁移模式，受限制的细 胞类型，这就是它能够准确量化细胞迁移限制其效用10。另一替代划伤试验采用了微柱阵列，它通过一个三维空间使用细胞变形并迁移到数组作为替代的能力测量细胞运动。聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体固化过精密模具和用臭氧处理和纤连蛋白产生均匀和不可降解的微环境。根据需要，以评估细胞的进入阵列 4的能力的微柱间距也可以变化。模具是通过硅晶片的深反应离子蚀刻创建以创建高宽比阵列 13的负版本。虽然试验是由它的可定制性加强，能够通过细胞迁移的直接可视化模型的三维迁移和分析，难以产生微柱阵列在经济上阻碍了它的广泛使用。
在本协议中所描述的优化划痕试验提供了一个高效，COS叔有效的制造方法，可以使用免费提供的软件进行分析一致划痕。而不是之前和细胞迁移后，整个从头做起简单的宽度测量，该软件能够使用户在迁移前后测定总划伤的地方。这个前进限制了试图确定何处划痕宽度测量应采取的问题，以及是否划痕的宽度是沿着它的长度是均匀的。此外，细胞数，细胞融合和类型和损伤造成对细胞的程度的谨慎的优化，以便进一步优化测定法进行了讨论。
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Protocol
注意：对于该研究中，肺间质基质细胞（LR-的MSC）从远端肺组织中分离或者基于它们的细胞表面标记物的表达（CD45 阴性 ，CD31 阴性 ，的Sca-1的高，EPCAM 负）14,15，用植出生长16，或使用酶消化17。粘附LR-的MSCs培养在DMEM高糖和无谷氨酰胺，15％FBS，1×抗生素/抗 真菌剂，和2mM谷氨酰胺（此后完全培养基）并在37℃，5％的CO 2。 LR-MSCs的传代3-4次，以确保细胞群与用于迁移测定相对同质生长特性。
1.准备一个融合的单层
- 分离从标准的100毫米培养皿中的MSC，洗涤细胞，用10毫升37℃的预热的PBS中，吸出PBS并加入胰蛋白酶4毫升（0.25％）。孵育在37℃培养箱中3-5分钟。吸的CELLS到锥形管中，以300g添加完全培养基，离心等体积为5分钟以沉淀下来的细胞。
注意：在胰蛋白酶长孵育可以改变细胞表面受体，并可能影响迁移。 - 吸媒体和悬浮细胞，新鲜完整的媒体。计数细胞，用台盼蓝染色排除死细胞和板50万间充质干细胞在4毫升完整的媒体对60毫米的细胞培养皿。
注意：根据细胞的来源上，测试可能是必要的，以确定所需要的细胞的最佳数量。 - 孵育细胞，直到板为90％融合了最佳的细胞附着和增殖，一般48-72小时的干细胞。
注：100％融合，不推荐，因为许多锚定依赖性细胞的体验接触抑制，这可能会改变他们的迁移能力。板的小于80％汇合，将导致不能使用的照片，因为图像分析软件将解释间隙细胞作为划痕的周边的部分之间秒（ 见图1D）。 - 后的细胞达到90％汇合时，损伤细胞以适合应用。为了评估暴露于可溶性香烟烟雾提取物（CSE）后的细胞损伤，经到25 ml完全培养基在Buchner瓶超过2分钟，18吸引来自肯塔基大学的1个研究香烟（3R4F）烟雾产生100％的自定义搜索引擎。
- 孵育细胞24小时4毫升1-4％CSE稀释在完全培养基中。培养后，用4毫升温无菌PBS洗细胞两次，用4ml新鲜完全培养基更换之前。
注：毁伤能力的细胞具有高浓度的香烟烟雾提取物（> 5％），可大大降低汇合。
2.创建暂存
- 在一个无菌的环境，请从受损的干细胞的60毫米的钢板盖，并奠定了直边（例如无菌塑料尺）交流罗斯板的顶部边缘。如果不取出介质，使用消毒200μl枪头进行无菌直边引导，使整个板块差一分四点平行划痕大约间隔5毫米，50毫米长。
注：直边最小化所需要的板材，当它是在显微镜舞台上旋转的调整量。当务之急是划痕出现在屏幕上完全垂直（或水平）。在60毫米的钢板产生多个划痕不会改变，影响细胞迁移（数据未显示）的方式的微环境，但也可以是对其它细胞类型的考虑。使用更小的孔的不推荐，因为细胞生长接近井的边缘的变异性变得更加明显，并且可能影响均匀代划痕。 - 吸媒体，轻轻用2ml预热完整的媒体，以防止细胞粘到划痕的中心洗平板，并以除去细胞s表示已松动的的刮伤。更换用4毫升新鲜完整的媒体。
- 用无菌永久性标记，标号1-4在板的下侧的每个刮在不会与成像划痕干扰位置。
注意：从同一个临时图像迁移前后进行比较是很重要的，因为可以有变化的划痕宽度。
3.以暂存的初始图像
注意：如果划痕试验是在多个板中进行，所以建议在单个板的所有划痕初始图像被拍摄之前划痕上的下一个板制成。
- 使用倒置相差显微镜用照相机以生成分析所需的图像。
- 定位在显微镜的培养板，并使用低功率物镜（10X）来定位刮＃1。如果缩合在培养板的盖子妨碍清晰IMAGE中的细胞，用加热的阶段设定为37℃。
- 保持刮完全水平和在视场的中心，得到尽可能多的图像作为必要在包括90％的划痕长度的。获得的耐擦伤不同的部分图像的图像之间没有重叠。
注意：光在培养皿的边缘上的折射曝光过度的图像，使它们不可能分析。因此，不从第一个拍摄图像和最后划痕的长度的5％。 - 保存每个从无到有的图像在一个单独的文件夹中。
- 重复步骤3.2-3.4是否有划痕2，3和4。
- 最初的影像后立即返回板的孵化器。让细胞迁移4-7小时。
注：评估干细胞受损与CSE时7小时是最佳的。孵化细胞大于7小时不建议，因为细胞的增殖可以作为细胞迁移混杂变量（参见下面的可选注8.2）。
- ImageJ的下载和安装伤口愈合工具插件（请参阅的材料/设备表）。
- 在打开ImageJ的图像文件，然后单击“进程”和“查找边缘”突出周边划伤的伤口愈合工具来计算临时区域（ 图2B）的细胞。接下来，单击“图片”，“调整”，“颜色阈值”，并在标有“门槛颜色”下拉菜单值更改为“B＆W”。
- 在“颜色阈值”菜单，同时调整亮度阈值滑块，直到从无到有，小区前的最佳的对比度达到。要允许尝试创建图像的对比度，完全移动底部滑块向右（全黑图像），然后调整顶部滑块产生最大对比度时，最大的范围内。
- 慢慢调整前BRIghtness滑块从左至右直到图像干净地显示划痕（图2C）的轮廓。一旦划伤的边缘已经确定，单击“更多选项”，在ImageJ的工具栏，在下拉菜单中选择“MRI_Wound_Healing_Tool”，然后按“M”键（将出现在ImageJ的工具栏）突出刮开区并输出所计算的区域中一个结果弹出出窗口（图2D）。
- 复制并从结果窗口 （图2E）的所有号码粘贴到Excel电子表格。请务必将数据从单独划痕分开。
5.与划痕的最终图像
- 在细胞迁移（4-7小时），重复步骤3.2-3.4。图像以相同的顺序它们被划伤，使细胞在每个板上有相等的时间迁移的板。
注：细胞可以在多个时间点进行成像，这取决于它们的森西拉了一到温度和pH值的变化。或者，活细胞成像可以用于跟踪单元的实时，因为它们迁移。
6.分析最终划痕图片
- 最终划痕图像重复步骤4.2-4.5。
7.计算刮开区量化迁移
- 通过平均各刮痕的初始面积值计算的平均预迁移区域。
- 减去最后的迁移区域的每个图像，在步骤6中计算出的，从平均迁移前区域（步骤7.1）计算迁移的总量。生成值的每一个从无到有代表迁移变化的列表。
- 池相同的测试组（ 如对细胞的所有板和所有的划痕暴露在0％CSE）内多处抓痕的数据。使用方差测试的分析方法来分析实验组之间的差异。
- 如果细胞迁移慢并且需要较长的培育时间划伤（大于10〜12小时）后，执行的BrdU或EDU掺入法19，以确定是否细胞中，其中移民法正在发生期间发生的任何扩散。选择迁移实验时间，以避免显著细胞增殖。
8.可选
- 为了评估显著细胞衰老是否发生如划痕过程的结果，搔抓19之后执行在测试板上的衰老相关的β-半乳糖苷酶测定在预定的时间。
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Representative Results
这里介绍的划痕试验用鼠肺间质居民基质细胞（LR-MSCS）进行，分离引用在协议中说明。在LR-MSCs的接种500,000个细胞在60毫米组织培养皿的密度，并在48小时生长至90％汇合。为了产生损害，4％CSE（如上所述）中的与细胞一起培养24小时后的初始播种期间，但在划痕试验前。对于每个测定，用200μl移液管尖端部中产生的划痕。最初的图像拍摄已产生的划痕后，任何松散的细胞和碎片已经被冲走完整的媒体。 如图1A和 B，适当合流重要的是要确保成像软件可以正确识别划伤的边界。 如图1C所示，细胞不是充分汇合（因为接种密度不足的任，不足增量ubation倍，或过度损伤），这可能会导致划痕与不是容易由成像软件（图1D）区分异构边界。 图2展示了图像采集和分析。 图2A示出了分析前的原始图象。 图2B示出在“进程”菜单中的“查找边缘”工具的结果（步骤4.2）和图2C显示图像如下调整“颜色阈值”滑动条（步骤4.3）中。 图2D显示了运行MRI_Wound_Healing_Tool后的最终分析的图像插件（步骤4.4）。 图2E示出的结果弹出窗口，突出（红色框）生成的数字。代表前和迁移后的图像示于图3中，与由成像软件定义对应草稿区的边界。 图4克raphically说明4％CSE损伤后出现在LR-干细胞改变的迁移能力。 图 4A 和 B中，平均计算刮擦区域（像素）的每个的4划痕跨越LR-MSC的一个板制成，在95％汇合前或迁移后，用曝光向0％CSE或4％ CSE进行了比较。 图4C比较擦伤面积所计算的平均变化（迁移后的面积从预迁移区域中减去）在LR-的MSC暴露于0％或4％的CSE，展示出较少迁移（较低的平均变化在草稿区）暴露于4％CSE后。
图1：正确的融合是强劲的重现性划痕试验的产生是至关重要的。 （ 一）鼠LR-干细胞在95％汇合，适合于SCRatching。 （B）一个成功的划痕在95％汇合。 （C）LR-干细胞在70％汇合，过低的成功划伤。 （D）在70％汇合图像采集可产生假的边界。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：代表性的图像展示图像采集与分析（一）原始图像。 （二）图像继“查找边缘”工具下的“进程”菜单（步骤4.2）的应用程序。 （C）图片如下调整“颜色阈值”滑动条（步骤4.3）的。运行MRI_Wound_Healing_Tool插件（步骤4.4）后（D）的图像。 （E）Results弹出窗口高亮（红色框）的每个区域生成的数字。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：从比较划痕试验代表性的图像划伤LR-干细胞在迁移前后（A）代表原始图像的预迁移。 （二）大纲计算刮开区迁移前的。 （ 三）代表原始图像后迁移。 （D）大纲计算刮开区迁移后的。 请点击此处查看该图的放大版本。
<IMG ALT =“图4”SRC =“/文件/ ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg”/>
图4：从之前和LR-MSC迁移后对比划伤面积的量化划痕试验，和暴露于0％或4％的CSE代表性的结果 。 （ 一）平均计算刮开区的图形表示（像素）的每4划痕跨越LR-MSC的一个盘发在95％汇合前或迁移后，暴露于0％CSE，以显示为数据平均值和标准偏差。 （B）的平均计算出的临时区域的图形表示（像素）的每个的4划痕跨越LR-MSC的一个板制成，在95％汇合前或迁移后，在暴露于4％的CSE，以呈现为数据平均值和标准偏差。在LR-干细胞在临时区域（后迁移前）计算出的平均值的变化（C）的比较暴露于0％或4％CSE，这表明在SCR少迁移（较低的平均变化ATCH区）暴露于4％CSE，以表示为均值和标准差的数据后，* P = 2.99×10 -8。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里描述的协议提供了一个强大的定量，标准化的方法来执行和分析划痕试验。简单划痕测定法常规使用的在研究的许多不同领域，研究细胞迁移。然而，传统上的划痕试验一直缺乏标准化设置和定量协议，这已导致问题重复性7,10。许多的修改和优化用于提高划痕试验的减少这些问题，包括个人的活细胞成像，标准化塞为基础的测定，和三维微柱测定-4,8,10。但是，这些测定法可能难以定制或调整10和对于一些应用，这些技术也可以成本过高。
以产生标准化的划痕测定方案，存在需要对细胞invol特定信息在协议几个关键步骤这里提出基于相关细胞特征VED，以及将分析的优化。特别是，它以优化，以达到均匀的单层在90-100％汇合的测定（步骤1.3和步骤1.4）所需要的细胞的数量和在必要培养的时间是很重要的。太少细胞（小于90％汇合），细胞不会形成足够的单层。这不仅会影响到细胞微环境，但它也将影响正确识别划伤的边缘的成像软件的能力。与此相反，太多的细胞单层（100％汇合，或堆叠的细胞）可能导致接触抑制，并因此改变细胞的迁移特性。划痕试验方案的一些变推荐细胞生长至100％融合并没有考虑对某些接触敏感的细胞，如间充质干8这个潜在的限制。相同的问题应被应用到损伤的程度是infli反恐执行局对细胞（步骤1.5）。这里所描述的协议被设计通过暴露于在迁移能力的MSC可溶性香烟烟雾损害后，以评估改变细胞迁移，但该测定可以是在评估许多不同类型的对细胞迁移的损害的效果同样有用。重要的是，受灾损害足以提供实验组和对照组之间的统计区别。然而，过多的损害也可能导致减少的细胞融合，这再次可能影响正确识别划伤的边缘的成像软件的能力。
两者细胞衰老和细胞增殖可以是混杂因素，可以虚假地改变划痕试验的结果。特别是，刮的产生应慎重考虑，以避免过度的损伤周围细胞可能会导致衰老那个。用塑料移液管尖刮擦而非皮下组织集成电路针或手术刀避免过量损坏同时也保留了培养板表面的迁移区和胞外基质（步骤2.1）的完整性。此外，时间在其上的细胞迁移允许发生的长度必须仔细考虑，以避免显著细胞增殖作为混杂变量（步骤3.7）。对于LR-MSC迁移的分析，评估细胞受损与CSE时7小时是最佳的。孵育细胞为大于12小时，一般不建议，然而，这可能并不适用于所有类型的细胞，特别是那些具有非常低的倍增速率。为了评估这两种细胞衰老和细胞的增殖，可以在细胞在试验19的端部执行衰老相关的β-半乳糖苷酶和BrdU或EDU掺入的组合。重要的是，这里所描述的协议是可以访问的实验室与技术能力有限，只需要一个良好的质量倒置相差显微镜和照相机。该试剂是价格低廉，并且成像软件是开源的。然而，为了确保从该测定最佳的结果，其中包括良好的再现，并执行严格的统计分析的能力，仔细优化，应考虑在尝试进行每个新的细胞类型或实验损伤情形。
优化本协议地址提出了一些存在于做划痕试验规范前期工作的局限性。尽管划痕试验的协议采取传统的划痕宽度测量，从临时8,9的快照，这里提出的协议使用沿着从无到有的整个长度采取增加统计的严谨性，并考虑到不一致的宽度图像面积测量最初的划痕。基于反复试验（数据未示出），划痕宽度不能假定为在其整个长度完全一致的。日迁移后，其边缘Ë划痕变得更加异类，使得越来越难以准确计算的划痕宽度，并进一步必要面积计算。该协议使用MRI_Wound_Healing_Tool，一个专门的计算机程序，以便减少主观性和当分析划痕面积增加的一致性。虽然它是未知的简单计算宽度是否能产生足够的特定到期之前CSE或其他破坏性迁移的细微差别来区分的结果，该协议证明了这种敏感性。在这个协议中提出的优化重整共同划痕试验来解决这些限制在经济可行的方式，提供对定制选项，并提供额外的技术来证明灵敏度和验证的结果。
在这个协议中所描述的优化的量化划痕试验仍在考虑的细胞群体的限制，而不是个别的细胞。这种技术assum上课，该细胞群体是相对同质，并认为这将导致相对均匀的迁移特性。根据应用的不同，也可能是更为相关考虑单个细胞而不是8的迁移。此外，这里所描述的划痕测定方案是依赖于细胞不会增殖足够迅速地混淆迁移分析过4-7小时的时间内的群体。细胞系可在这短暂的时间内广泛增殖将不适合使用这种技术分析。尽管有这些限制，这种定量划痕试验协议具有用于在许多不同的应用中使用的潜力。例如，一个细胞损伤为基础的检测可能被优化，然后用于评价特定的治疗，以限制细胞损伤的能力。可替代地，该测定可能与癌细胞系用于评估潜在的治疗，以限制迁移能力，并且因此转移潜能，邻˚F这些细胞。这种优化的划痕试验也仍然是不可避免的产生划痕可能干扰到细胞微环境的限制。然而，通过仔细选择的细胞汇合水平，增加细胞凋亡和细胞片层已部分地分离上划痕的边缘的产生可以被避免。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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