Introduction
세포 이동은 조직 개발, 수리 및 재생뿐만 아니라, 암의 전이 및 동맥 경화 1과 병리학 적 과정 등 많은 생리 학적 과정에 매우 조정 및 중요합니다. 세포 이동의 이해는 손상된 조직을 복구하고 세포 이식 기술과 인공 조직 2 접목을 포함한 병리학 적 조건을 치료하는 데 사용 신흥 치료에 특히 관련이있다. , 조직 복구 3을 매개 엄격 정량화 적응 및 경제적 인 관심의 분석을 이용하여 이들 세포의 이주 능력을 정량화 간엽 기질 세포 (MSC들)의 역할에 관심을 주어 현재. 중요한 것은, 이러한 분석은 손상 후 세포의 철새 용량 상대적으로 미묘한 변화를 감지 할 수있을만큼 충분히 민감해야합니다. 스크래치 분석, 트랜스 웰 마이그레이션 분석을, 세포 이동을 정량화 포함한 현재의 방법 (보이든의 채널ambers) micropillar 어레이 및 셀 배제 영역 분석법은 재현성, 커스터마이즈, 정량화 및 경제성 1,4,5 한계의 범위를 갖는다. 여기에 설명 된 최적화 된 스크래치 분석은 강력한 결과, 정량화 및 이미지 기반 분석 기능, 비용 효율성 및 기타 응용 프로그램에 대한 적응성을 보여줍니다.
스크래치 분석은 다른 실험 조건 하에서 5 세포 이동과 증식을 평가하기 위해 여러 용량으로 사용되어왔다. 분석은 또는 가까운 합류를 완료하기 위해 그들을 성장, 지정된 세포를 파종하고, 멸균 바늘 또는 피펫 팁 6 결과 단층를 긁적 수반한다. 분석은 가장 일반적으로 무작위로 위치 7-9에서 여러 시간 지점 위에 스크래치의 폭을 비교함으로써 수행된다. 그것의 저명한 사용에도 불구하고, 스크래치 분석은 재현성과 정량 문제에 의해 혼동된다. 의 변동성흠집의 발생뿐만 아니라, 세포의 미세 환경을 변화뿐만 아니라, 플레이트 표면과 기저 세포 외 매트릭스 (5)의 손상에 의해 세포 이동을 저해 할 수있다. 분석법 빈번 그러나 느린 이동 및 더 긴 분석 시간을 표시하는 세포주에 대해, 12 시간에 걸쳐 진행되는 7, 증식 교란 변수 7,10된다. 마지막으로, 찰과 공정에 의해 생성 된 노화 세포는 단층 1 격차를하는데 필요한 세포 외 신호에 방해 요인을 해제 할 수있다. 스크래치 시험을 최적화하면 분석 시간 길이를 최소화하고, 조작 동안 원치 않는 세포 사멸을 방지하는 표면 특성을 방해하지 않는 일관 갭의 생성을 필요로한다. 스토퍼 기재 분석법은 세포 배제 영역 분석법의 최적화이다. 이 분석은 세포 성장을 배제 웰의 중앙에 배치 된 스토퍼를 이용하지만, 세포가 배제 중앙 영역의 주위에 도금 될 수있다.마이그레이션을 평가하기 위해, 스토퍼가 제거되며, 생성 된 배타 존은 마이그레이션이 발생하기위한 표면을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 사용자 또는 10 적응 어렵고 일부 애플리케이션의 경우,이 기술은 엄청난 비용이 될 수있다.
스크래치 시험 법 및 이들의 유도체, 트랜스 웰 마이그레이션 분석 (또는 보이든 챔버 분석법) 대조적 화성 제 8,11 함유 챔버에, 미 공성 여과막을 통해, 하나의 챔버로부터 이동 세포 수를 정량함으로써 마이그레이션을 평가 (12). 다공성 막을 통한 마이그레이션 다음, 세포가 주 화성 제제에 노출 막 측에 부착하고 정확하게 정량화하기 어려울 수 있기 때문에 이러한 기술은 중간 엽 줄기 세포에 대한 부착 성 등 유틸리티를 한정 하였다. 분석은 어떤 입체 이주 패턴을 검사 할 수 있지만, 제한된 세포 유형은 그것을 정확하게 세포 이동 한계는 유틸리티를 정량화 할 수있다 (10). 스크래치 시험 법에 대한 다른 대안은 변형 및 대리 배열에 마이그레이션하는 세포의 능력을 이용하여 3 차원 공간을 통해 세포 운동성을 측정 마이크로 필러 배열을 사용한다. Polydimethlysiloxane (PDMS) 엘라스토머는 정밀 몰드 위에 경화와 오존으로 처리하고 피브로넥틴이 균일 및 비 분해성 미세 환경을 생성한다. 어레이 (4)를 입력하는 세포의 능력을 측정하기 위해 필요에 따라 마이크로 필러 간격 또한 변경 될 수있다. 주형은 높은 종횡비의 어레이 (13)의 음의 버전을 생성하도록 실리콘 웨이퍼의 깊은 반응성 이온 에칭을 통해 생성된다. 그 분석은 커스터마이즈에 의해 강화되지만, 이주 능력 세포 직접적인 시각화를 통해 입체 마이그레이션 및 분석을 모델링하는, 마이크로 필러 어레이를 생성하는데 어려움이 경제적으로 널리 사용을 방해한다.
이 프로토콜에 설명 된 최적화 스크래치 분석은 효율적 COS를 제공자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수 일관된 흠집 제조 t 효율적인 방법. 대신 전 세포 이동 후 스크래치 걸쳐 만든 단순한 폭 측정, 소프트웨어는 마이그레이션 전과 후의 총 스크래치 영역을 결정하기 위해 사용자를 가능하게한다. 이 진보가 여기서 폭 측정들이 취해 져야한다 스크래치 판단하려고하는 문제를 제한하고, 스크래치의 폭의 여부의 길이를 따라 균일하다. 또한, 세포 수, 세포 유형과 합류하고 세포에 가해진 손상의 정도는 더욱 신중한 최적화 분석을 최적화하기 위해 논의된다.
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Protocol
참고 : 사용, 말초 폐 조직에서이 연구, 폐 중간 엽 기질 세포 (LR-중간 엽 줄기 세포)의 경우 분리되었다 중 자신의 세포 표면 마커의 발현 (CD45의 NEG, CD31의 NEG, 무서-1 고,는 EpCAM의 NEG) 14, 15을 기준으로 이식편 밖으로 성장 (16), 또는 효소 소화 (17)를 사용하여. 자기편 LR-중간 엽 줄기 세포는 높은 혈당없이 글루타민, 15 % FBS, 1X / 항생제 항진균제, 2 mM의 글루타민 (이제부터는 완전한 미디어)와 DMEM에서 배양하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양 하였다. LR-중간 엽 줄기 세포 마이그레이션 분석에 대한 상대적으로 균일 한 성장 특성과 세포 집단을 보장하기 위해 3 ~ 4 번 계대 하였다.
1. 합류 단층을 준비
- 표준 100mm 배양 접시에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하기 위해, 37 ° C 미리 예열 PBS의 10 ㎖로 세포를 씻어 PBS를 기음과 트립신의 4 ㎖ (0.25 %)를 추가합니다. 37 °의 C 배양기에서 3 ~ 5 분을 품어. C를 대기음5 분 세포를 펠렛하는 원뿔 튜브에 ELL 학생은 300 g에서 완전한 매체와 원심 분리기의 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다.
주 : 트립신 길어 배양은 세포 표면 수용체를 변경 잠재적 이동에 영향을 미칠 수있다. - 기음 미디어와 신선한 전체 미디어에 resuspend 세포. 세포를 트리 판 블루 배제 개수를 사용하여 사균을 제외하고 60mm 세포 배양 접시에 완전한 미디어의 4 ml의 50 간엽 기질 세포를 접시.
주 : 세포의 소스에 따라, 테스트는 필요한 세포의 최적의 수를 결정하는 것이 필요할 수있다. - 플레이트는 최적의 세포 부착과 증식에 90 %의 합류, 중간 엽 줄기 세포에 대한 일반적으로 48 ~ 72 시간까지 세포를 품어.
참고 : 100 % 합류가 자신의 철새 용량을 변경할 수 많은 고정 의존 세포 경험 연락처 억제하기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이미지 분석 소프트웨어가 갭을 해석하기 때문에 80 % 미만의 합류점과 플레이트 불가능한 포토 초래할 것처음의 둘레의 한 부분으로 세포 사이의 (그림 1D 참조). - 세포가 90 % 합류에 도달 한 후에, 애플리케이션을위한 적절한 세포를 손상. 수용성 담배 연기 추출 (CSE)에 노출 된 후 세포 손상을 평가하기 위해, 2 분 18 세 이상 뷰 흐너 플라스크에 전체 미디어의 25 ml를 통해 1 켄터키 대학의 연구 담배 (3R4F)에서 연기를 그려 100 % CSE를 생성합니다.
- 전체 미디어에 희석 4 ml의 1~4%의 CSE에서 24 시간 동안 세포를 품어. 배양 후, 4 ㎖의 신선한 완전한 매체와 교체하기 전에, 따뜻한 멸균 PBS의 4 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
참고 : 담배 연기 추출물의 높은 농도 (> 5 %)에 손상을 입히는 세포를 실질적으로 합류를 줄일 수 있습니다.
2. 스크래치 만들기
- 무균 환경에서 손상된 중간 엽 줄기 세포의 60mm 판에서 뚜껑을 제거하고 AC (예 : 멸균 플라스틱 통치자에 대한) 직선을 마련로스 플레이트의 상부 림. 미디어를 제거하지 않고, 약 5mm 간격 판에서 1-4 병렬 긁힌 자국과 긴 50mm를 만들기 위해 멸균 직선 가장자리에 의해 인도 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용합니다.
주 : 직선 에지는 현미경 스테이지에있을 때 판에 필요한 회전 조정의 양을 최소화한다. 이는 상처가 화면에 완전하게 수직 (또는 수평) 표시하는 것이 필수적이다. 60mm 접시에 여러 상처 생성하는 세포 이동을 (데이터는 도시하지 않음)에 영향을 미치는 방식으로 미세 환경을 변경하지 않고, 다른 종류의 세포에 대한 고려 될 수있다. 우물의 가장자리에 성장하는 세포의 변화가 더욱 두드러지고 상처의 균일 한 세대에 영향을 미칠 수 있기 때문에 작은 우물의 사용은 권장되지 않습니다. - 미디어를 대기음 부드럽게 스크래치의 중심에 부착 세포를 방지하기 위해 미리 예열 전체 미디어의 2 ㎖로 접시를 세척하고, 세포를 제거하기 위해긁힘에 의해 완화 된의. 신선한 전체 미디어의 4 ㎖로 교체합니다.
- 멸균 영구 마커를 사용하여 흠집을 이미징을 간섭하지 않는 위치에서 상기 플레이트의 밑면에 각각 1-4 스크래치 라벨.
참고 : 스크래치 폭의 변화가있을 수 있기 때문에 그것은, 같은 처음부터 이미지가 이전과 마이그레이션 후 비교하는 것이 중요하다.
3. 스크래치의 초기 이미지를 촬영
참고 : 스크래치 분석 여러 판에서 수행되는 경우,이 상처는 다음 접시에되기 전에 하나의 접시에 모든 상처의 초기 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다.
- 분석에 필요한 이미지를 생성하는 카메라 역 위상차 현미경을 사용한다.
- 현미경의 문화 판을 놓고 스크래치 번호를 찾기 위해 낮은 전력 목적 (10X)를 사용하여 1. 배양 접시의 뚜껑에 응축 맑은 IMAG을 방해하는 경우세포의 전자는 37 ℃로 가열 된 무대 세트를 사용합니다.
- 필요한만큼의 화상을 얻기 완전히 수평 시야의 중심에 스크래치를 유지하는 스크래치의 길이의 90 %를 포함한다. 이미지 사이에 중복으로 스크래치의 서로 다른 부분의 이미지를 얻습니다.
참고 : 배양 접시의 가장자리에 빛의 굴절을 분석하기가 불가능하고, 이미지를 overexposes. 따라서, 처음부터 이미지를 가지고 스크래치의 길이의 5 %를 지속되지 않습니다. - 별도의 폴더에 각각 처음부터 이미지를 저장합니다.
- 반복 흠집 2, 3 3.2-3.4, 4 단계를 반복합니다.
- 즉시 초기 이미징 후 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 세포가 4-7 시간 동안 이동하자.
참고 : CSE와 손상 중간 엽 줄기 세포를 평가할 때 7 시간이 최적입니다. 세포 증식은 세포의 이동에 대한 혼란 변수로 작용할 수 있기 때문에보다 7 시간 동안 세포를 배양 (아래 옵션 참고 8.2 참조)하지 않는 것이 좋습니다.
- (재료 / 장비의 표 참조) ImageJ에 다운로드 및 상처 치유 도구 플러그인을 설치합니다.
- ImageJ에있는 이미지 파일을 연 다음 상처 치유 도구 스크래치 영역 (그림 2B)을 계산하기위한 스크래치를 둘러싸고있는 세포를 강조하기 위해 "가장자리 찾기" "프로세스"를 클릭합니다. 다음, "이미지", "조정", "컬러 임계 값"과 "임계 값 색상"이라고 표시된 드롭 다운 메뉴에서 값 변경을 클릭합니다 "B & W를."
- 스크래치 및 세포 앞 사이의 최적의 대비가 달성 될 때까지 "컬러 임계 값"메뉴 내에서 모두 밝기 임계 값 슬라이더를 조정합니다. 이미지의 대비를 만들 수있는 권리 (완전히 검은 이미지) 완전히 바닥 슬라이더를 이동 한 다음 최대 대비를 생성하기 위해 상단 슬라이더를 조정하려는 가장 큰 범위를 허용합니다.
- 천천히 상단 BRI를 조정이미지가 깨끗하게 스크래치 (그림 2C)의 윤곽이 표시 될 때까지 왼쪽에서 오른쪽으로 ghtness 슬라이더. 스크래치의 가장자리가 확인되고 나면, 스크래치 영역을 강조하기 위해, 드롭 다운 메뉴에서 "MRI_Wound_Healing_Tool"를 선택하고 "M"버튼 (즉 ImageJ에 도구 모음에 나타납니다)를 누르면 ImageJ에 툴바에서 "추가 도구"를 클릭 출력 결과 팝 아웃 창 (그림 2D)에서 계산 된 영역입니다.
- 복사 및 엑셀 스프레드 시트에 결과 창 (그림 2E)의 모든 번호를 붙여 넣습니다. 개인의 상처에서 데이터를 분리해야합니다.
5. 스크래치의 최종 이미지를 촬영
- 세포 (4-7 시간) 마이그레이션 한 후, 반복 3.2-3.4 단계를 반복합니다. 이미지 각 접시에 세포가 이동하는 동일한 시간을 준 있도록 그들이 긁힌 것과 같은 순서로 판.
주 : 세포를 여러 시점에서 이미징 될 수있는, 그들의 SENSI에 따라모두 온도와 pH를 변화 tivity. 대안 적으로, 생균 촬상 그들이 마이그레이션 실시간으로 세포를 수행하는데 사용될 수있다.
6. 최종 스크래치 이미지 분석
- 반복 최종 스크래치 이미지 4.2-4.5 단계를 반복합니다.
7. 마이그레이션을 정량화하기 위해 스크래치 영역을 계산
- 각 스크래치의 초기 면적 값을 평균함으로써 평균 사전 이주 면적을 계산한다.
- 평균 사전 이주 영역 (단계 7.1)에서, 단계 6에서 계산 된 각 이미지에 대한 최종 이동 영역을 빼서 이주의 총량을 계산한다. 마이그레이션의 변화를 나타내는 각 스크래치의 값의리스트를 생성한다.
- (즉, 셀의 모든 판과 모든 상처 0 %에 노출 CSE) 동일한 시험 군 내에서 여러 상처로부터 데이터를 풀. 실험 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 분산 시험의 분석을 사용한다.
- 세포는 이동 속도가 느린 경우및 (보다 10-12 시간 이하) 긁 후 긴 배양 시간을 필요로, 세포 이동 분석법이 발생하는 기간 중에 증식을 겪고 있는지의 BrdU 또는 듀 혼입 분석 (19)를 결정하기 위해 수행. 상당한 세포 증식을 방지하기 마이그레이션 분석 시간을 선택한다.
선택 (8)
- 중요한 세포 노화가 찰 절차의 결과로 발생 여부를 평가하기 위해, 19 긁힘 후 미리 정해진 시간에 시험 접시에 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 분석을 수행합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 스크래치 분석은 쥐의 폐 상주 중간 엽 기질 세포를 (LR-중간 엽 줄기 세포)를 사용하여 수행 및 프로토콜 노트에서 참조로 분리되었다. LR-엽 줄기 세포는 60mm 조직 배양 접시에서 500,000 세포의 밀도로 시딩하고, 48 시간에 90 % 합류로 성장시켰다. 손상을 생성하기 위해 4 % CSE는 (상술 한) 초기 시드 기간 다음 24 시간 동안이지만 스크래치 시험 전에 세포와 함께 배양 하였다. 각각의 분석을 위해, 처음에는 200 μL 피펫 팁을 사용하여 생성 하였다. 스크래치가 발생했다 후 초기 이미지를 촬영하고, 느슨한 세포와 파편이 완료 미디어 씻겨했다. 도 1A 및 B에 도시 된 바와 같이, 적절한 합류 이미징 소프트웨어가 정확하게 스크래치의 경계를 식별 할 수 있도록하는 것이 중요하다. 도 1C에 도시 된 바와 같이, 셀 (어느 인해 불충분 파종 밀도 불충분 INC 충분히 합류하지 않은. 쉽게 이미징 소프트웨어 (그림 1D)에 의해 구별되지 않는 이질적인 경계에 흠집이 발생할 도표 2 수 ubation 시간, 또는 과도한 손상), 이미지 수집 및 분석을 보여줍니다. 그림 2a는 분석 전에 원본 이미지를 나타낸다. 2B 쇼 그림 "프로세스"메뉴에서 "가장자리 찾기"도구의 결과는 (4.2 단계) 및도 2c는 "컬러 임계 값"슬라이드 바를 (단계 4.3)의 조정 다음과 같은 이미지를 보여줍니다. 그림 2D는 MRI_Wound_Healing_Tool을 실행 한 후 최종 분석 이미지를 묘사 플러그인 (단계 4.4). 그림 2E는 결과 팝 아웃 창, 강조 (빨간색 상자) 생성 된 번호를 나타낸다. 주제 전후 이동 이미지는 이미징 소프트웨어에 의해 정의 된 스크래치 영역 경계와 대응하는,도 3에 도시되어있다.도 4graphically 4 % CSE와 손상 후 LR-엽 줄기 세포에서 본 용량 변경 이동성을 나타낸다. 0 % CSE 또는 4 % 중 하나에 노출 된 95 %의 합류 중 사전 또는 사후 이주에 LR-중간 엽 줄기 세포의 접시에 걸쳐 만든 스크래치 4, 각각의 그림 4A와 B (픽셀)의 평균을 계산 스크래치 지역에서는 CSE는 비교된다. 그림 4c는 스크래치 영역에서 0 % 또는 4 % CSE 중 하나에 노출 LR-중간 엽 줄기 세포에서 (사전 이주 지역에서 차감 마이그레이션 후 지역) 스크래치 영역에서 계산 된 평균 변화, 덜 마이그레이션을 보여주는 (낮은 평균 변화를 비교 ) 4 % CSE 조사 후.
그림 1 : 올바른 합류는 강력한 재현 스크래치 분석의 생성을위한 중요합니다. (A) 쥐 LR-중간 엽 줄기 세포 95 % 합류, SCR에 적합atching. (B) 95 %의 합류에 성공 스크래치. 성공적인 스크래치에 대한 (C) LR-중간 엽 줄기 세포 70 %의 합류가 너무 낮. 70 %의 합류 (D) 영상 획득이 거짓의 경계를 생성 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 이미지 수집 및 분석을 보여주는 대표 이미지 (A) 원본 이미지.. (B) "프로세스"메뉴 (4.2 단계) 아래에있는 "가장자리 찾기"도구의 응용 프로그램에 다음과 같은 이미지. (C) 이미지 "색상 임계 값"슬라이드 바를 (단계 4.3)의 조정 다음과 같습니다. MRI_Wound_Healing_Tool 플러그인 (4.4 단계)를 실행 한 후 (D) 이미지. (E) Results 팝업 창 강조 (빨간색 상자) 각 영역에 대해 생성 된 번호를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 비교 스크래치 분석에서 대표 이미지는 이전과 마이그레이션 후 LR-중간 엽 줄기 세포를 상처 (A) 대표 원본 이미지 사전 마이그레이션.. 계산 된 스크래치 영역 사전 마이그레이션 (B) 개요. (C) 대표 원본 이미지 마이그레이션 후. 계산 된 스크래치 영역 사후 이주의 (D) 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4 : 0 % 또는 4 % CSE 중 하나에 스크래치 전 LR-MSC 마이그레이션 후 스크래치 영역의 정량을 비교 분석하고, 노출 대표 결과. 으로 표시하고 데이터를 0 % CSE에 노출 된 95 %의 합류 중 사전 또는 사후 이주에 LR-중간 엽 줄기 세포의 접시에 걸쳐 만든 스크래치 4 각 (A) (픽셀) 평균 계산 스크래치 영역의 그래픽 표현, 평균과 표준 편차. 으로 표시하고 데이터를 4 % CSE에 노출 된 95 %의 합류 중 사전 또는 사후 이주에 LR-중간 엽 줄기 세포의 접시에 걸쳐 만든 스크래치 4 각 (B) (픽셀) 평균 계산 스크래치 영역의 그래픽 표현, 평균과 표준 편차. LR-중간 엽 줄기 세포의 스크래치 영역 (후 사전 마이그레이션)에서 계산 된 평균 변화 (C) 비교 SCR 덜 마이그레이션 (낮은 평균 변화를 보여, 0 % 또는 4 % CSE 중 하나에 노출평균과 표준 편차로 표현 된 데이터와 4 % CSE에 노출 후 ATCH 영역), * P = 2.99 × 10 -8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜을 수행하고 스크래치 시험 법을 정량적으로 분석 할 수있는 견고하고 표준화 된 방법을 제공한다. 간단한 스크래치 분석은 정기적으로 세포의 이동을 조사하는 연구의 다양한 분야에서 사용된다. 그러나 전통적으로 스크래치 분석은 재현성 7,10에 문제하게되었다 표준화 된 설정 및 정량 프로토콜을 결여하고있다. 변형 및 스크래치 시험을 향상 최적화 많은 개별 라이브 세포 이미징 표준화 스토퍼 기반 분석법, 및 입체 마이크로 필러 분석법 4,8,10 포함한 이러한 문제를 감소시켰다. 그러나 이러한 분석은 사용자 또는 열을 적용하기 어려울 수 있고, 몇몇 응용을 위해, 이러한 기술들은 엄청난 비용이 될 수있다.
표준화 된 스크래치 분석 프로토콜을 생산하는 세포의 invol에 대한 특정 정보를 필요로 여기에 제시된 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다중요한 세포 특성에 기초하여 분석의 VED 및 최적화. 특히, 분석 용 90-100% 합류 (단계 1.3 및 1.4을 공정)에서 균일 한 단층을 달성하기 위해 필요한 셀들의 수 및 필요한 배양 시간을 최적화하는 것이 중요하다. 너무 적은 세포 (90 % 미만 합류)와, 세포 단층을 형성하기에 충분하지 않을 것이다. 뿐만 아니라,이 세포 미세 환경에 영향을주는 것뿐만 아니라 올바르게 스크래치의 에지를 식별하기 위해 이미지 소프트웨어의 능력에 영향을 미칠 것이다. 대조적으로, 단일 층이 너무 많은 세포 (100 % 합류 또는 누적 세포) 잘 접촉 억제 결과, 따라서 세포의 이동성 특성을 변경할 수있다. 스크래치 분석 프로토콜의 일부 변화는 100 % 합류로 세포 성장을 추천 등의 중간 엽 줄기 세포 (8)과 같은 특정 접촉에 민감한 세포에 대한이 잠재적 인 제한을 고려하지 않는다. 동일한 문제는 infli 인 손상도 적용해야세포 cted (150 단계). 여기에 설명 된 프로토콜이 이동성 용량 엽 줄기 세포에 대한 가용성 담배 연기 노출에 의한 손상 이후 세포 이동의 변화를 평가하도록 설계되어 있지만,이 분석은 세포 이동에 대한 손상의 많은 다른 유형의 효과를 평가하는데 똑같이 유용하게 사용될 수있다. 이는 고통받는 손상 실험과 대조군 사이에 통계적인 차이를 제공하기에 충분하다는 것이 중요하다. 그러나, 너무 많은 피해도 올바르게 다시 처음의 에지를 식별하기 위해 이미지 소프트웨어의 능력에 영향을 미칠 수있는 감소 된 세포의 합류, 발생할 수있다.
모두 세포 노화 및 세포 증식 거짓 스크래치 분석의 결과를 변경할 수있는 교란 요인이 될 수있다. 특히, 스크래치의 발생이 심하게 노화 초래할 수 주변 셀에 과도한 손상을 방지하기 위해 고려되어야한다. hypoderm보다는 플라스틱 피펫 팁 긁또한 이주 영역과 세포 외 매트릭스 (단계 2.1)에서 배양 접시 표면의 무결성을 유지하면서 IC 바늘 또는 메스 과도한 손상을 방지한다. 또한, 세포의 이동이 발생하도록 허용되는 동안의 시간 길이는 심하게 교란 변수 (단계 3.7)으로 상당한 세포 증식을 방지하기 위해 고려되어야한다. CSE로 손상된 세포를 평가할 때 LR-MSC 마이그레이션의 분석을 위해, 7 시간은 최적입니다. 일반적으로 권장되지 않는 이상 12 시간 동안 세포를 배양, 그러나이 모든 종류의 세포로 매우 낮은 두 배 속도로, 특히 적용되지 않을 수도 있습니다. 모두 세포 노화 및 세포 증식, 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 및 BrdU의 혼입 또는 듀의 결합 분석 (19)의 끝에서 세포상에서 수행 될 수있다을 평가. 중요한 것은, 여기에 설명 된 프로토콜은 양질 도립 위상차 현미경과 카메라를 필요로하는 제한된 용량을 갖는 기술 연구소에 접근 할 수있다. 그만큼시약은 저렴하고, 이미징 소프트웨어는 오픈 소스이다. 그러나, 양호한 재현성 및 엄격한 통계 분석을 수행하는 기능을 포함하여이 분석에서 최적의 결과를 보장하기 위해 조심 최적화 시도마다 새로운 세포 유형 또는 실험 시나리오의 손상을 고려하여야한다.
최적화는이 프로토콜 주소에 스크래치 분석을 표준화하기 위해 수행 이전 작업에 존재하는 몇 가지 제한 사항을 발표했다. 스크래치 시험 프로토콜 전통적 스크래치 8,9의 스냅 샷에서 스크래치 폭 측정을 수행하는 반면, 여기에 제시된 프로토콜은 통계적인 엄격함을 증가시키고의 폭을 고려하여 불일치를 고려하는 스크래치의 전체 길이를 따라 촬영 된 영상에서 공간 측정들을 사용 초기 스크래치. 반복 된 실험에 기초하여 (데이터는 미도시), 스크래치의 폭은 그 길이에 걸쳐 일관된 완벽하다고 가정 할 수 없다. 일의 마이그레이션 후, 가장자리즉, 스크래치는 점점 어려워 정확하게 스크래치 너비를 계산하고, 상기 계산 영역을 필요로 할 수있게, 더 균질해진다. 이 프로토콜은 주관성을 감소시키고 스크래치 영역을 분석 할 때 일관성을 높이기 위해, MRI_Wound_Healing_Tool, 특수 컴퓨터 프로그램을 사용한다. 간단 폭의 계산으로 인해 이전에 CSE 또는 다른 손상에 마이그레이션에 미묘한 차이를 구별 할만큼 특정 결과를 얻을 수 있는지 여부를 알 수 있지만,이 프로토콜이 감도를 보여줍니다. 이 프로토콜에 제시된 최적화는 사용자 정의에 대한 옵션을 제공하고, 감도를 보여 결과를 확인하기 위해 추가 기술을 제공하기 위해, 경제적으로 실현 가능한 방식으로 이러한 한계를 해결하기 위해 공통의 스크래치 분석을 개편.
이 프로토콜에 설명 된 최적화 된 정량 분석 스크래치는 여전히 개별적인 세포보다 세포 집단을 고려하여 제한된다. 이 기술의 assum세포 집단이 비교적 균질하고,이 비교적 균질 마이그레이션 특성을 초래할 것이라는 것을 말이지. 응용에 따라, 개별 셀들 대신에도 8의 이동을 고려하는 것이 더 관련 될 수있다. 또한, 여기에 설명 된 스크래치 시험 프로토콜은 4-7 시간 동안 이동의 분석을 혼동 할 정도로 빠르게 확산되지 세포 집단에 의존한다. 이 짧은 기간 동안 광범위하게 증식있다 세포주는이 기술을 사용하여 분석하기에 적합하지 않을 것이다. 이러한 제한에도 불구하고,이 스크래치 정량 분석 프로토콜은 다양한 어플리케이션에 사용하기위한 잠재력을 가진다. 예를 들어, 세포 손상 기반 분석은 최적화 후 세포 손상을 제한하는 특정 치료법의 능력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 대안 적으로, 상기 분석은 O, 이동성 용량, 따라서 전이 가능성을 제한 할 가능성을 평가하기 위해 치료 암 세포주와 함께 사용될 수있는이 세포 F. 이 최적화 된 스크래치 분석은 여전히 스크래치를 생성 피할 수있는 세포 미세 환경에 가능한 장애에 의해 제한된다. 그러나, 신중 셀 합류 수준 증가 및 세포 사멸 부분적 스크래치의 가장자리상에서 분리 한 세포 시트의 생성을 선택함으로써 피할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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