Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

घाव स्क्रैच परख का अनुकूलन घुलनशील सिगरेट के धुएं निकालें द्वारा क्षति के बाद Murine Mesenchymal stromal सेल प्रवासन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए

Published: December 3, 2015 doi: 10.3791/53414
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biology, College of the Holy Cross
* These authors contributed equally

Introduction

सेल प्रवास ऐसी ऊतक विकास, मरम्मत और उत्थान, साथ ही इस तरह के कैंसर मेटास्टेसिस और धमनीकाठिन्य 1 के रूप में रोग प्रक्रियाओं के रूप में कई शारीरिक प्रक्रियाओं को अत्यधिक समन्वित और महत्वपूर्ण है। सेल प्रवास की समझ क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत और कोशिका प्रत्यारोपण प्रौद्योगिकियों और कृत्रिम ऊतक 2 ग्राफ्टिंग सहित रोग की स्थिति, इलाज के लिए इस्तेमाल उभरते उपचार के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। , ऊतकों की मरम्मत 3 मध्यस्थता कड़ाई से, मात्रात्मक अनुकूलनीय, और लागत प्रभावी ब्याज की बात यह है कि एक परख का उपयोग कर इन कोशिकाओं के प्रवासी क्षमता बढ़ाता में mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) की भूमिका में मौजूदा ब्याज को देखते हुए। महत्वपूर्ण बात है, इस तरह के एक परख क्षति के बाद सेलुलर प्रवासी क्षमता में अपेक्षाकृत सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील होना चाहिए। खरोंच assays, ट्रांस-अच्छी तरह से पलायन assays, सेल प्रवास बढ़ाता सहित के लिए मौजूदा तरीकों (Boyden चर्चाAmbers), micropillar सरणियों, और सेल अपवर्जन क्षेत्र assays के reproducibility, customizability, मात्रा का ठहराव, और लागत प्रभावशीलता 1,4,5 में सीमाओं की एक सीमा होती है। यहाँ वर्णित अनुकूलित खरोंच परख मजबूत परिणामों, मात्रात्मक और छवि के आधार पर विश्लेषण क्षमताओं, लागत प्रभावशीलता, और अन्य अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलन क्षमता को दर्शाता है।

स्क्रैच assays के विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों 5 के तहत सेल प्रवास और प्रसार का आकलन करने के लिए कई क्षमताओं में इस्तेमाल किया गया है। परख या पास संगम को पूरा करने के लिए उन्हें बढ़ रही है, नामित कोशिकाओं बोने, और एक बाँझ सुई या pipet टिप 6 के साथ परिणामी monolayer scratching पर जोर देता। विश्लेषण सबसे आम तौर पर बेतरतीब ढंग से चयनित स्थानों 7-9 पर कई बार अंक से अधिक खरोंच की चौड़ाई की तुलना द्वारा किया जाता है। इसकी प्रमुख उपयोग के बावजूद, खरोंच परख reproducibility और मात्रा का ठहराव के साथ मुद्दों से चकित है। में परिवर्तनशीलताखरोंच की पीढ़ी न केवल कोशिकाओं के microenvironment को बदल देता है, लेकिन यह भी प्लेट की सतह और अंतर्निहित कोशिकी मैट्रिक्स 5 को नुकसान पहुँचाए से सेल प्रवास बाधित कर सकते हैं। Assays अक्सर हालांकि धीमी प्रवास और अब परख बार प्रदर्शित सेल लाइनों के लिए, 12 घंटा के लिए 7 पर आयोजित कर रहे हैं, प्रसार एक confounding चर 7,10 हो जाता है। अन्त में, scratching प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं monolayer 1 में अंतर को बंद करने के लिए आवश्यक बाह्य संकेतन के साथ हस्तक्षेप करने वाले कारकों में जारी कर सकते हैं। खरोंच परख अनुकूलन परख समय की लंबाई को कम करने, और हेरफेर के दौरान अवांछित कोशिका मृत्यु को रोकने, सतह के गुणों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक सुसंगत अंतराल के सृजन की आवश्यकता है। डाट आधारित परख के लिए एक सेल अपवर्जन क्षेत्र परख के एक अनुकूलन है। इस परख सेल के विकास को शामिल नहीं है कि अच्छी तरह से के बीच में रखा एक डाट इस्तेमाल करता है, लेकिन कोशिकाओं केंद्रीय अपवर्जन क्षेत्र के आसपास चढ़ाया जा करने के लिए अनुमति देता है।पलायन का आकलन करने के लिए, डाट निकाल दिया जाता है, और उसके एवज में अपवर्जन क्षेत्र पलायन घटित करने के लिए एक सतह प्रदान करता है। हालांकि, इस परख अनुकूलित या 10 अनुकूल करने के लिए मुश्किल होता है और कुछ अनुप्रयोगों के लिए, इस तकनीक को भी अत्यधिक लागत हो सकता है।

खरोंच assays और उनके डेरिवेटिव, ट्रांस-अच्छी तरह से पलायन assays के (या Boyden कक्ष assays) के विपरीत कीमोटैक्टिक एजेंटों 8,11 युक्त एक कक्ष में, एक microporous फिल्टर झिल्ली के माध्यम से, एक कक्ष से कदम है कि कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता द्वारा पलायन का आकलन, 12। झरझरा झिल्ली के माध्यम से पलायन के बाद, कोशिकाओं कीमोटैक्टिक एजेंटों के संपर्क झिल्ली पक्ष का पालन करना, और सही ढंग से यों के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि इस तकनीक MSCs तरह पक्षपाती कोशिकाओं के लिए उपयोगिता सीमित है। परख कुछ तीन आयामी प्रवास पैटर्न की जांच करने में सक्षम है, वहीं प्रतिबंधित प्रकार की कोशिकाओं, जिसके लिए यह सही सेल प्रवास की सीमा इसकी उपयोगिता यों करने में सक्षम है 10। खरोंच assays के लिए एक अन्य विकल्प ख़राब करना और एक किराए के रूप सरणी में विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का उपयोग कर एक तीन आयामी अंतरिक्ष के माध्यम से सेलुलर गतिशीलता उपाय जो एक माइक्रो-स्तंभ सरणी का उपयोग करता है। Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomers एक सटीक मोल्ड पर ठीक हो और ओजोन के साथ इलाज किया और फ़ाइब्रोनेक्टिन एक समरूप और गैर degradable microenvironment पैदा करता है। सरणी 4 दर्ज करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता आंकने के लिए जरूरत के रूप माइक्रो-स्तंभ रिक्ति भी अलग किया जा सकता है। ढालना उच्च पहलू अनुपात सरणी 13 की नकारात्मक संस्करण बनाने के लिए सिलिकॉन वेफर्स के गहरे प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी के माध्यम से बनाई गई है। परख अपनी customizability से मजबूत है, वहीं क्षमता पलायन कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के माध्यम से तीन आयामी प्रवास, और विश्लेषण करने के लिए मॉडल, माइक्रो-स्तंभ सरणियों बनाने में कठिनाई आर्थिक रूप से इसकी व्यापक उपयोग में बाधा उत्पन्न करती।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुकूलित खरोंच परख एक कुशल, क्योंकि प्रदान करता हैस्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है कि लगातार खरोंच के उत्पादन के लिए टी-प्रभावी तरीका। इसके बजाय पहले और सेल प्रवास के बाद खरोंच भर में किए गए सरल चौड़ाई माप की, सॉफ्टवेयर से पहले और प्रवास के बाद कुल खरोंच क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है। यह उन्नति जहां चौड़ाई माप लिया जाना चाहिए खरोंच निर्धारित करने की कोशिश करने के मुद्दे को सीमित करता है, और खरोंच की चौड़ाई कि क्या यह लंबाई के साथ एक समान है। इसके अलावा, सेल नंबर, सेल संगम और प्रकार और कोशिकाओं को दिए गए नुकसान की डिग्री से सावधान अनुकूलन आगे परख का अनुकूलन करने के क्रम में चर्चा की है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: का उपयोग कर, बाहर का फेफड़े के ऊतकों से इस अध्ययन, फेफड़े mesenchymal stromal कोशिकाओं (एलआर-MSCs) के लिए अलग थे तो उनके कोशिका की सतह मार्कर की अभिव्यक्ति (CD45 neg, CD31 neg, SCA-1 उच्च, EpCAM neg) 14,15 पर आधारित explant बाहर विकास 16, या enzymatic पाचन 17 का उपयोग कर। पक्षपाती एलआर-MSCs उच्च ग्लूकोज और कोई glutamine, 15% FBS, 1x / एंटीबायोटिक कवकनाशी, और 2 मिमी glutamine (अब पूरा मीडिया) के साथ DMEM में सुसंस्कृत थे और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में incubated। एलआर-MSCs पलायन परख के लिए अपेक्षाकृत समरूप विकास विशेषताओं के साथ कोशिकाओं की आबादी सुनिश्चित करने के लिए 3-4 बार passaged थे।

1. मिला हुआ Monolayer तैयारी

  1. मानक 100 मिमी संस्कृति व्यंजन से MSCs को अलग करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने पीबीएस महाप्राण और trypsin के 4 मिलीलीटर (0.25%) जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 3-5 मिनट सेते हैं। ग महाप्राण5 मिनट कोशिकाओं नीचे गोली के लिए एक शंक्वाकार ट्यूब में एल, 300 ग्राम पर पूरा मीडिया और सेंट्रीफ्यूज की बराबर मात्रा में जोड़ें।
    नोट: ट्रिप्सिन में अब ऊष्मायन कोशिका की सतह रिसेप्टर्स को बदलने और संभावित पलायन को प्रभावित कर सकते हैं।
  2. महाप्राण मीडिया और ताजा पूरा मीडिया में resuspend कोशिकाओं। , कोशिकाओं की गणना trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कर मृत कोशिकाओं को छोड़कर और एक 60 मिमी सेल संस्कृति डिश पर पूरा मीडिया के 4 मिलीलीटर में 500,000 mesenchymal stromal कोशिकाओं थाली।
    नोट: कोशिकाओं के स्रोत पर निर्भर करता है, परीक्षणों की जरूरत कोशिकाओं की अधिकतम संख्या निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. प्लेटों इष्टतम सेल लगाव और प्रसार के लिए 90% मिला हुआ, MSCs के लिए आम तौर पर 48-72 घंटा कर रहे हैं जब तक कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: 100% संगम उनके प्रवासी क्षमता को बदल सकता है, जो कई लंगर निर्भर कोशिकाओं अनुभव संपर्क निषेध, के बाद से, अनुशंसित नहीं है। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खाई व्याख्या होगी क्योंकि कम से कम 80% संगम के साथ प्लेटों व्यर्थ तस्वीरों में परिणाम होगाखरोंच की परिधि के एक भाग के रूप में कोशिकाओं के बीच एस (चित्रा -1 देखें)।
  4. कोशिकाओं 90% संगम तक पहुँच चुके हैं, आवेदन के लिए उचित रूप में कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा। घुलनशील सिगरेट का धुआँ निकालने (सीएसई) से संपर्क के बाद सेल नुकसान का आकलन करने के लिए, 2 मिनट 18 से अधिक एक Büchner फ्लास्क में पूरा मीडिया के 25 मिलीलीटर के माध्यम से एक विश्वविद्यालय केंटकी के अनुसंधान सिगरेट (3R4F) से धुआं ड्राइंग द्वारा 100% सीएसई उत्पन्न करते हैं।
  5. पूरा मीडिया में पतला 4 मिलीलीटर 1-4% सीएसई में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, 4 मिलीलीटर ताजा पूरा मीडिया के साथ की जगह पहले, गर्म बाँझ पीबीएस के 4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    नोट: सिगरेट का धुआँ निकालने की उच्च सांद्रता (> 5%) के साथ हानिकारक कोशिकाओं काफी संगम कम कर सकते हैं।

2. स्क्रैच बनाना

  1. एक बाँझ वातावरण में क्षतिग्रस्त MSCS की 60 मिमी प्लेट से ढक्कन हटा, और एसी (उदाहरण के एक निष्फल प्लास्टिक शासक के लिए) एक सीधे बढ़त रखनारॉस प्लेट के ऊपर रिम। मीडिया को हटाने के बिना, लगभग 5 मिमी के अलावा थाली भर में 1-4 समानांतर खरोंच और लंबे समय तक 50 मिमी बनाने के लिए बाँझ सीधे बढ़त के द्वारा निर्देशित एक बाँझ 200 μl pipet टिप का उपयोग करें।
    नोट: एक सीधे बढ़त यह खुर्दबीन मंच पर जब प्लेट करने की जरूरत बारी-बारी से समायोजन की राशि को कम करता है। यह खरोंच स्क्रीन पर पूरी तरह से खड़ी (या क्षैतिज) दिखाई देते हैं कि जरूरी है। एक 60 मिमी प्लेट पर कई खरोंच सृजन सेल प्रवास (नहीं दिखाया डेटा) को प्रभावित करता है कि एक तरह से microenvironment में परिवर्तन नहीं करता है, लेकिन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक विचार हो सकता है। अच्छी तरह के किनारे के करीब बढ़ कोशिकाओं की परिवर्तनशीलता और अधिक स्पष्ट हो जाता है और खरोंच के वर्दी पीढ़ी को प्रभावित कर सकता है क्योंकि छोटे कुओं का उपयोग अनुशंसित नहीं है।
  2. मीडिया Aspirate और धीरे खरोंच के केंद्र का पालन करने से कोशिकाओं को रोकने के लिए पूर्व गर्म पूरा मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ प्लेटें धोने, और सेल को दूर करने के लिएscratching द्वारा ढीला कर दिया है कि एस। ताजा पूरा मीडिया के 4 एमएल के साथ बदलें।
  3. एक बाँझ स्थायी मार्कर का उपयोग करना, खरोंच इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा उस स्थान पर प्लेट के नीचे पर 1-4 से प्रत्येक खरोंच लेबल।
    नोट: खरोंच चौड़ाई में भिन्नता हो सकती है, क्योंकि यह एक ही खरोंच से छवियों से पहले और प्रवास के बाद तुलना कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है।

3. स्क्रैच की प्रारंभिक छवियों को लेने

नोट: खरोंच परख कई प्लेटों पर किया जाता है, तो यह खरोंच अगले प्लेट पर किया जाता है से पहले एक ही थाली पर सभी खरोंच के प्रारंभिक छवियों लिया जाता है कि सिफारिश की है।

  1. विश्लेषण के लिए आवश्यक छवियों को उत्पन्न करने के लिए एक कैमरा के साथ एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. माइक्रोस्कोप पर संस्कृति थाली स्थिति, और खरोंच # पता लगाने के लिए कम बिजली उद्देश्य (10X) का उपयोग करें 1। संस्कृति की थाली के ढक्कन पर संक्षेपण एक स्पष्ट imag बाधा है तोकोशिकाओं की ई, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म मंच सेट का उपयोग करें।
  3. आवश्यक के रूप में कई चित्र प्राप्त करने, पूरी तरह से क्षैतिज और देखने के क्षेत्र के केंद्र में खरोंच रखते हुए खरोंच की लंबाई के 90% धरना। छवियों के बीच कोई ओवरलैप के साथ खरोंच के अलग भागों की छवियों को प्राप्त करते हैं।
    नोट: संस्कृति डिश के किनारों पर प्रकाश के अपवर्तन का विश्लेषण करने के लिए उन्हें असंभव बना रही है, छवियों overexposes। इसलिए, पहले से चित्र लेने और खरोंच की लंबाई के 5% तक नहीं है।
  4. एक अलग फ़ोल्डर में प्रत्येक खरोंच से छवियों को बचाओ।
  5. दोहराएँ खरोंच 2, 3 के लिए 3.2-3.4, और 4 कदम।
  6. तुरंत प्रारंभिक इमेजिंग के बाद इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें। कोशिकाओं 4-7 घंटे के लिए विस्थापित करते हैं।
    नोट: सीएसई के साथ क्षतिग्रस्त MSCs का आकलन करते समय 7 घंटा इष्टतम है। सेल प्रसार सेल प्रवास के लिए एक confounding चर के रूप में कार्य कर सकते हैं, क्योंकि अधिक से अधिक से अधिक 7 घंटे के लिए कोशिकाओं incubating (नीचे वैकल्पिक नोट 8.2 देखें) की सिफारिश नहीं है।
  1. (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) ImageJ डाउनलोड और घाव भरने उपकरण प्लगइन स्थापित करें।
  2. ImageJ में छवि फ़ाइल खोलें, फिर घाव भरने उपकरण खरोंच क्षेत्र (चित्रा 2 बी) की गणना करने के लिए खरोंच आसपास की कोशिकाओं को उजागर करने के लिए "किनारों को खोजने के" "प्रक्रिया" क्लिक करें और। इसके बाद, "छवि", "समायोजित" "रंग थ्रेसहोल्ड" और "सीमा रंग" लेबल लटकती मेनू में मूल्य को बदलने के लिए क्लिक करें "बी और डब्ल्यू।"
  3. खरोंच और सेल सामने बीच इष्टतम विपरीत हासिल की है, जब तक "रंग थ्रेसहोल्ड" मेनू के भीतर, दोनों चमक दहलीज स्लाइडर्स समायोजित। , छवि के विपरीत बनाने के अधिकार (पूरी तरह से काला छवि) के लिए पूरी तरह से नीचे स्लाइडर ले जाते हैं, और फिर अधिकतम विपरीत उत्पन्न करने के लिए शीर्ष स्लाइडर को समायोजित करने की कोशिश कर जब बड़ी रेंज के लिए अनुमति देने के लिए।
  4. धीरे-धीरे शीर्ष Bri समायोजितछवि की सफाई से खरोंच (चित्रा -2) के समोच्च को प्रदर्शित करता है जब तक बाएं से दाएं ghtness स्लाइडर। खरोंच के किनारों की पहचान की गई है, एक बार खरोंच क्षेत्र को उजागर करने के लिए, लटकती मेनू से "MRI_Wound_Healing_Tool" का चयन करें, और 'एम' बटन (कि ImageJ उपकरण पट्टी में दिखाई देगा) प्रेस ImageJ उपकरण पट्टी में "अधिक उपकरण" पर क्लिक करें और उत्पादन एक परिणाम पॉप बाहर खिड़की (चित्रा 2 डी) में गणना क्षेत्र।
  5. कॉपी और एक एक्सेल स्प्रेडशीट में परिणाम विंडो (चित्रा 2 ई) से सभी नंबरों को पेस्ट करें। व्यक्तिगत खरोंच से डेटा को अलग करने के लिए सुनिश्चित करें।

5. स्क्रैच की अंतिम छवियों ले रहा है

  1. कोशिकाओं (4-7 घंटा) माइग्रेट करने के बाद, फिर से 3.2-3.4 कदम। छवि एक थाली पर कोशिकाओं की ओर पलायन करने के लिए बराबर समय दिया है ताकि वे खरोंच थे उसी क्रम में प्लेटें।
    नोट: कोशिकाएं कई बिंदुओं पर समय imaged किया जा सकता है, उनकी Sensi पर निर्भर करता हैदोनों तापमान और पीएच परिवर्तन करने के लिए tivity। वैकल्पिक रूप से, जीना सेल इमेजिंग वे विस्थापित के रूप में वास्तविक समय में कोशिकाओं का पालन करने के लिए इस्तेमाल कर सकते हैं।

6. अंतिम स्क्रैच छवियाँ का विश्लेषण

  1. दोहराएँ अंतिम खरोंच छवियों के लिए 4.2-4.5 कदम।

7. प्रवासन यों स्क्रैच क्षेत्रफल की गणना

  1. संबंधित खरोंच के प्रारंभिक क्षेत्र मूल्यों के औसत से मतलब पूर्व पलायन क्षेत्र की गणना करें।
  2. औसत पूर्व पलायन क्षेत्र (कदम 7.1) से, 6 चरण में गणना प्रत्येक छवि के लिए अंतिम माइग्रेशन क्षेत्र, घटा कर पलायन की कुल राशि की गणना करें। प्रवास में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व प्रत्येक खरोंच के लिए मूल्यों की एक सूची उत्पन्न।
  3. (यानी कोशिकाओं पर सभी प्लेटों और सभी खरोंच 0% सीएसई के संपर्क में) एक ही परीक्षण समूह के भीतर कई खरोंच से डेटा पूल। प्रयोगात्मक समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण करने के लिए विचरण परीक्षण के एक विश्लेषण का प्रयोग करें।
  4. कोशिकाओं की ओर पलायन करने के लिए धीमी गति से कर रहे हैंऔर (अधिक से अधिक 10-12 घंटे की तुलना में) scratching के बाद एक लंबी ऊष्मायन समय की आवश्यकता है, कोशिकाओं पलायन परख होने वाली है, जिसमें अवधि के दौरान किसी भी प्रसार के दौर से गुजर रहे हैं कि क्या एक BrdU या edu समावेश परख 19 निर्धारित करने के लिए करते हैं। महत्वपूर्ण सेल प्रसार से बचने के लिए एक प्रवास परख समय चुनें।

वैकल्पिक 8.

  1. महत्वपूर्ण सेल वार्धक्य scratching प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में हो रहा है कि क्या आकलन करने के लिए, 19 scratching के बाद पूर्व निर्धारित समय पर एक परीक्षण की थाली पर एक वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase परख करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ प्रस्तुत खरोंच assays के murine फेफड़ों निवासी mesenchymal stromal कोशिकाओं (एलआर-MSCs) का उपयोग किया है और प्रोटोकॉल नोट में संदर्भित के रूप में अलग-थलग पड़ गए थे। एलआर-MSCs एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान में 500,000 से कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता प्राप्त, और 48 घंटे में 90% संगम बड़े हो रहे थे। क्षति उत्पन्न करने के लिए, 4% सीएसई (ऊपर वर्णित) प्रारंभिक बोने अवधि के बाद 24 घंटे के लिए, लेकिन खरोंच परख से पहले कोशिकाओं के साथ incubated था। प्रत्येक परख के लिए, खरोंच एक 200 μl pipet टिप का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था। खरोंच उत्पन्न किया गया था के बाद प्रारंभिक छवियों ले जाया गया है, और किसी भी ढीली कोशिकाओं और मलबे पूरा मीडिया के साथ धुल गया था। चित्रा 1 ए और बी में दिखाया गया है, उचित संगम इमेजिंग सॉफ्टवेयर सही ढंग से खरोंच की सीमाओं की पहचान कर सकते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 1C में दिखाया गया है, कोशिकाओं (क्योंकि या तो अपर्याप्त बोने घनत्व के, अपर्याप्त इंक पर्याप्त मिला हुआ नहीं हैं। आसानी से इमेजिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा -1) द्वारा प्रतिष्ठित नहीं कर रहे हैं कि विषम सीमाओं के साथ खरोंच में परिणाम 2 समझ सकते हैं जो ubation बार, या अत्यधिक क्षति), छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दर्शाता है। चित्रा 2A विश्लेषण से पहले मूल छवि को दर्शाया गया है। 2 बी से पता चलता है "प्रक्रिया" मेनू के तहत "किनारों को खोजने के" उपकरण का परिणाम (4.2 चरण) और चित्रा -2 "रंग थ्रेसहोल्ड" Slidebar (4.3 चरण) के समायोजन के बाद छवि को दर्शाता है। चित्रा 2 डी MRI_Wound_Healing_Tool चलाने के बाद अंतिम विश्लेषण किया छवि को दर्शाया गया प्लगइन (चरण 4.4)। चित्रा 2 ई परिणामों पॉप बाहर खिड़की पर प्रकाश डाला (लाल बॉक्स) उत्पन्न कर रहे हैं कि संख्या को दर्शाया गया है। प्रतिनिधि पूर्व और बाद पलायन छवियों इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित के रूप में खरोंच क्षेत्र की सीमाओं इसी के साथ, 3 चित्र में दिखाया गया है। 4 जी चित्राraphically 4% सीएसई के साथ नुकसान के बाद एलआर-MSCs में देखा बदल प्रवासी क्षमता को दिखाता है। 0% सीएसई या 4% या तो करने के लिए जोखिम के साथ 95% संगम या तो पूर्व या बाद पलायन पर एलआर-MSCS की एक थाली भर में किए गए 4 खरोंच, से प्रत्येक के लिए चित्रा -4 ए और बी, (पिक्सेल में) औसत से गणना की खरोंच क्षेत्रों में सीएसई तुलना कर रहे हैं। चित्रा 4C खरोंच क्षेत्र में 0% या 4% सीएसई या तो के संपर्क में एलआर-MSCs में (पूर्व पलायन क्षेत्र से घटाया के बाद पलायन क्षेत्र) खरोंच क्षेत्र में गणना की औसत परिवर्तन, कम से प्रवास का प्रदर्शन (कम औसत परिवर्तन तुलना ) 4% सीएसई से संपर्क के बाद।

आकृति 1
चित्रा 1: सही संगम मजबूत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य खरोंच परख की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। (ए) Murine एलआर-MSCs 95% संगम पर, एससीआर के लिए उपयुक्तatching। (बी) 95% संगम पर एक सफल खरोंच। एक सफल खरोंच के लिए (सी) एलआर-MSCs 70% संगम पर, बहुत कम है। 70% संगम पर (डी) छवि अधिग्रहण झूठी सीमाओं का उत्पादन कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: छवि अधिग्रहण और विश्लेषण का प्रदर्शन छवियों प्रतिनिधि (ए) मूल छवि।। (ख) "प्रक्रिया" मेनू (4.2 कदम) के तहत "किनारों को खोजने के" उपकरण के आवेदन निम्न छवि। (सी) छवि "रंग थ्रेसहोल्ड" Slidebar (4.3 चरण) के समायोजन के बाद। MRI_Wound_Healing_Tool प्लगइन (चरण 4.4) चलाने के बाद (डी) छवि। (ई) आरesults पॉप-अप विंडो पर प्रकाश डाला (लाल बॉक्स) प्रत्येक क्षेत्र के लिए उत्पन्न कर रहे हैं कि संख्या। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: की तुलना खरोंच परख से प्रतिनिधि छवियों से पहले और प्रवास के बाद एलआर-MSCs खरोंच (ए) प्रतिनिधि मूल छवि पूर्व प्रवास।। गणना की खरोंच क्षेत्र पूर्व पलायन (बी) को रेखांकित करें। (सी) प्रतिनिधि मूल छवि पोस्ट प्रवास। गणना की खरोंच क्षेत्र के बाद पलायन (डी) को रेखांकित करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<आइएमजी alt = "चित्रा 4" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 53,414 / 53414fig4.jpg" />
चित्रा 4: 0% या 4% सीएसई के लिए या तो खरोंच से पहले और एलआर-एमएससी प्रवास के बाद खरोंच क्षेत्र की मात्रा का ठहराव की तुलना परख, और जोखिम से प्रतिनिधि परिणाम है। के रूप में प्रस्तुत आंकड़ों के साथ 0% सीएसई के लिए जोखिम के साथ 95% संगम या तो पूर्व या बाद पलायन पर एलआर-MSCS की एक थाली भर में किए गए 4 खरोंच से प्रत्येक के लिए (ए) (पिक्सेल में) औसत की गणना खरोंच क्षेत्र की चित्रमय प्रतिनिधित्व, मतलब है और मानक विचलन। के रूप में प्रस्तुत आंकड़ों के साथ 4% सीएसई के लिए जोखिम के साथ 95% संगम या तो पूर्व या बाद पलायन पर एलआर-MSCS की एक थाली भर में किए गए 4 खरोंच से प्रत्येक के लिए (बी) (पिक्सेल में) औसत की गणना खरोंच क्षेत्र की चित्रमय प्रतिनिधित्व, मतलब है और मानक विचलन। एलआर-MSCs में खरोंच क्षेत्र (पोस्ट-पूर्व माइग्रेशन) में गणना की औसत परिवर्तन (सी) तुलना एससीआर में कम प्रवास (कम औसत परिवर्तन का प्रदर्शन, 0% या 4% सीएसई या तो से अवगत करायामतलब है और मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत आंकड़ों के साथ 4% सीएसई, से संपर्क के बाद atch क्षेत्र), * पी ​​= 2.99 x 10 -8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन और खरोंच assays के विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक मजबूत, मानकीकृत तरीका प्रदान करता है। सरल खरोंच assays नियमित तौर पर सेलुलर प्रवास जांच करने के लिए अध्ययन के कई अलग अलग क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है। हालांकि, पारंपरिक रूप से खरोंच परख reproducibility 7,10 के साथ मुद्दों के लिए प्रेरित किया, जो एक मानकीकृत सेट-अप और मात्रा का ठहराव प्रोटोकॉल, कमी रह गई है। संशोधनों और खरोंच परख में सुधार के लिए अनुकूलन के कई अलग-अलग रहते सेल इमेजिंग, मानकीकृत डाट आधारित assays, और तीन आयामी सूक्ष्म स्तंभ assays के 4,8,10 सहित इन मुद्दों को कम कर दिया। हालांकि, इन assays अनुकूलित या 10 अनुकूल करने के लिए मुश्किल हो सकता है और कुछ अनुप्रयोगों के लिए, इन तकनीकों में भी अत्यधिक लागत हो सकता है।

एक मानकीकृत खरोंच परख प्रोटोकॉल का उत्पादन करने के लिए, कोशिकाओं पूर्णकालिक बारे में विशेष जानकारी की आवश्यकता है कि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंप्रासंगिक सेलुलर विशेषताओं के आधार पर परख के वेद, और अनुकूलन। विशेष रूप से, यह परख के लिए 90-100% संगम (1.3 कदम और 1.4 चरण) पर एक समान monolayer को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या और आवश्यक संस्कृति में समय का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। बहुत कुछ कोशिकाओं (कम से कम 90% मिला हुआ) के साथ, कोशिकाओं को एक पर्याप्त monolayer फार्म नहीं होगा। इतना ही नहीं इस सेलुलर microenvironment को प्रभावित करेगा, लेकिन यह भी सही ढंग से खरोंच के किनारों की पहचान करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर की क्षमता को प्रभावित करेगा। इसके विपरीत, monolayer में भी कई कोशिकाओं (100% मिला हुआ है, या खड़ी कोशिकाओं) को अच्छी तरह से संपर्क निषेध में परिणाम है, और इसलिए कोशिकाओं के प्रवासी विशेषताओं को बदल सकता है। खरोंच परख प्रोटोकॉल के कुछ विविधताओं 100% संगम सेल के विकास को सलाह देते हैं और इस तरह के MSCs 8 के रूप में कुछ संपर्क के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं के लिए इस संभावित सीमा पर विचार नहीं है। एक ही चिंता infli है कि नुकसान की डिग्री करने के लिए लागू किया जाना चाहिएकोशिकाओं पर cted (1.5 चरण)। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रवासी क्षमता MSCs पर घुलनशील सिगरेट के धुएं के संपर्क में से क्षति के बाद सेल प्रवास में परिवर्तन का आकलन करने के लिए बनाया गया है, लेकिन इस परख सेल प्रवास पर क्षति के कई अलग अलग प्रकार के प्रभाव का आकलन करने में समान रूप से उपयोगी हो सकता है। यह पीड़ित क्षति प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के बीच एक सांख्यिकीय गौरव प्रदान करने के लिए पर्याप्त है कि महत्वपूर्ण है। हालांकि, बहुत ज्यादा नुकसान भी फिर से सही ढंग से खरोंच के किनारों की पहचान करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर की क्षमता को प्रभावित कर सकता है जो कम सेल संगम में हो सकता है।

दोनों सेलुलर वार्धक्य और सेलुलर प्रसार झूठा खरोंच परख के परिणाम बदल सकते हैं कि कारकों हो सकता है। विशेष रूप से, खरोंच की पीढ़ी को ध्यान से वार्धक्य में परिणाम हो सकता है कि आसपास की कोशिकाओं को अत्यधिक क्षति से बचने के लिए विचार किया जाना चाहिए। एक hypoderm के बजाय एक प्लास्टिक विंदुक टिप के साथ scratchingयह भी पलायन क्षेत्र और बाह्य मैट्रिक्स (2.1 कदम) में संस्कृति की थाली सतह की अखंडता बनाए जबकि आईसी सुई या छुरी अतिरिक्त नुकसान से बचा जाता है। इसके अलावा, सेल प्रवास होने की अनुमति दी है, जिस पर समय की लंबाई को ध्यान से एक confounding चर (3.7 चरण) के रूप में महत्वपूर्ण सेल प्रसार से बचने के लिए विचार किया जाना चाहिए। सीएसई के साथ क्षतिग्रस्त कोशिकाओं का आकलन करते समय एलआर-एमएससी माइग्रेशन के विश्लेषण के लिए, 7 घंटा इष्टतम है। आम तौर पर की सिफारिश नहीं है, अधिक से अधिक से अधिक 12 घंटे के लिए कोशिकाओं incubating, लेकिन इसमें सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए बहुत कम दोहरीकरण दरों के साथ विशेष रूप से उन लोगों पर लागू नहीं हो सकती है। दोनों सेलुलर वार्धक्य और सेल प्रसार, वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase और BrdU या edu समावेश का एक संयोजन परख 19 के अंत में कोशिकाओं पर किया जा सकता आकलन करने के लिए। महत्वपूर्ण बात है, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल केवल एक अच्छी गुणवत्ता औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप और कैमरे की आवश्यकता सीमित तकनीकी क्षमता के साथ प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है।अभिकर्मकों सस्ती कर रहे हैं, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर खुला स्रोत है। हालांकि, अच्छा reproducibility और कठोर सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता सहित इस परख से इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के क्रम में, सावधान अनुकूलन का प्रयास है कि प्रत्येक नए सेल प्रकार या प्रयोगात्मक क्षति परिदृश्य के लिए विचार किया जाना चाहिए।

अनुकूलन इस प्रोटोकॉल पते में खरोंच assays के मानकीकरण करने के लिए किया जाता पिछले काम में वर्तमान सीमाओं के कुछ प्रस्तुत किया। खरोंच परख प्रोटोकॉल परंपरागत रूप से खरोंच 8,9 के एक स्नैपशॉट से खरोंच चौड़ाई माप लेने जबकि, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सांख्यिकीय कठोरता को बढ़ाने के लिए और की चौड़ाई में विचार विसंगतियों में लेने के लिए खरोंच की पूरी लंबाई के साथ लिया छवियों से क्षेत्र माप का उपयोग करता है प्रारंभिक खरोंच। बार-बार परीक्षण के आधार पर (नहीं दिखाया डेटा), खरोंच चौड़ाई इसकी लंबाई भर में पूरी तरह से लगातार हो नहीं माना जा सकता। वें के प्रवास के बाद, किनारोंई खरोंच यह तेजी से मुश्किल सही रूप में एक खरोंच चौड़ाई की गणना, और आगे क्षेत्र की गणना की जरूरत है, जिससे अधिक विषम हो जाते हैं। इस प्रोटोकॉल आत्मीयता कम होती है और खरोंच क्षेत्र का विश्लेषण करते समय स्थिरता को बढ़ाने के लिए, MRI_Wound_Healing_Tool, एक विशेष कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग करता है। यह सरल चौड़ाई गणना की वजह से पहले सीएसई या अन्य हानिकारक के लिए प्रवास में सूक्ष्म अंतर के बीच भेद करने के लिए पर्याप्त विशिष्ट परिणाम निकल सकता है कि क्या अज्ञात है, इस प्रोटोकॉल इस संवेदनशीलता को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत अनुकूलन अनुकूलन के लिए विकल्पों की पेशकश करने के लिए, और संवेदनशीलता का प्रदर्शन और परिणाम को मान्य करने के लिए अतिरिक्त तकनीक उपलब्ध कराने के लिए एक आर्थिक रूप से व्यवहार्य तरीके से इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए आम खरोंच परख सुधार।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुकूलित मात्रात्मक खरोंच परख अभी भी बल्कि व्यक्तिगत कोशिकाओं की तुलना में, एक सेल की आबादी पर विचार करके ही सीमित है। इस तकनीक Assumसेल की आबादी अपेक्षाकृत समरूप है, और यह अपेक्षाकृत समरूप पलायन विशेषताओं में परिणाम होगा कि कि तों। आवेदन के आधार पर, यह व्यक्ति की कोशिकाओं के बजाय 8 प्रवास पर विचार करने के लिए और अधिक प्रासंगिक हो सकता है। इसके अलावा, यहां वर्णित खरोंच परख प्रोटोकॉल एक 4-7 घंटे की अवधि में पलायन के विश्लेषण को उलझाने के लिए तेजी से पर्याप्त पैदा करना नहीं होगा कि कोशिकाओं की आबादी पर निर्भर है। इस छोटे से समय की अवधि के दौरान बड़े पैमाने पर पैदा करना हो सकता है कि सेल लाइनों इस तकनीक का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं होगा। इन सीमाओं के बावजूद, इस मात्रात्मक खरोंच परख प्रोटोकॉल कई अलग अलग अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए क्षमता है। उदाहरण के लिए, एक कोशिका क्षति आधारित परख अनुकूलित और फिर सेल नुकसान को सीमित करने के लिए विशेष उपचार की क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस परख ओ, प्रवासी क्षमता है, और इसलिए metastatic क्षमता को सीमित करने का संभावित उपचार का आकलन करने के लिए कैंसर सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैइन कोशिकाओं च। यह अनुकूलित खरोंच परख भी अभी भी खरोंच पैदा करने में अपरिहार्य हैं कि सेल microenvironment के लिए संभव गड़बड़ी द्वारा सीमित है। हालांकि, ध्यान से सेल संगम स्तर में वृद्धि हुई, apoptosis और आंशिक रूप से खरोंच के किनारे पर अलग कर दिया है कि कोशिकाओं की चादरों की पीढ़ी का चयन करके बचा जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (high glucose, no added glutamine) Life Technologies 31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone Fisher Scientific SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone  Fisher Scientific SV3007901
Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone Fisher Scientific SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent Life Technologies 12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone  Fisher Scientific SH3002802
Falcon standard 60 mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772B
Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips Fisher Scientific 02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment Variable
ImageJ software  http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing plugin http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software Microsoft Excel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
  2. Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
  3. Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
  4. Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
  5. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  6. Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
  7. Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  9. Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  10. Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
  11. Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
  12. Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
  13. Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
  14. Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
  15. McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
  16. Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
  17. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
  18. Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
  19. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 106 घाव परख खरोंच परख सेल गतिशीलता बायोइन्जिनियरिंग फेफड़ों के रोग ऊतकों की मरम्मत
घाव स्क्रैच परख का अनुकूलन घुलनशील सिगरेट के धुएं निकालें द्वारा क्षति के बाद Murine Mesenchymal stromal सेल प्रवासन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cormier, N., Yeo, A., Fiorentino,… More

Cormier, N., Yeo, A., Fiorentino, E., Paxson, J. Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract. J. Vis. Exp. (106), e53414, doi:10.3791/53414 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter