Introduction
Hücre göçü, doku gelişimi, onarım ve yenileme, hem de kanser metastazı ve damar sertliği 1 gibi patolojik işlemler gibi birçok fizyolojik süreçte yüksek oranda koordine ve hayati önem taşımaktadır. Hücre göçü bir anlayış hasarlı dokuları tamir ve hücre nakli teknolojileri ve yapay doku 2 aşılama dahil patolojik durumların tedavisinde kullanılan gelişmekte olan tedavilere özellikle önemlidir. , Doku tamirini 3 aracılık titizlikle, ölçülebilir uyarlanabilir ve uygun maliyetli ilgi olduğunu bir deney kullanılarak bu hücrelerin göç kapasitesinin miktarının mezenkimal stromal hücreler (MKH) rolü mevcut ilgi dikkate alındığında. Daha da önemlisi, bu tip bir analiz hücre hasarı sonrası göç kapasitesi nispeten küçük değişiklikleri tespit etmek için yeterince hassas olması gerekir. Çizik deneyleri, trans-kuyu göç deneyleri, hücre göçü miktarının da dahil olmak üzere mevcut metodlar (Boyden chamberleri), micropillar diziler ve hücre yasak bölge tahlilleri tekrarlanabilirlik, customizability, ölçümü ve maliyet etkinliği 1,4,5 sınırlamaları bir dizi sahiptir. Burada anlatılan optimize karalama tahlil sonuçlarını sağlam, ölçülebilir ve görüntü tabanlı analiz yetenekleri, maliyet-etkililik ve diğer uygulamalara uyum gösterir.
Kazı deneyleri, farklı deney koşulları altında 5 hücresi yayılmasını ve çoğalmasını değerlendirmek için çok sayıda kapasitelerde kullanılmıştır. Deney veya yakınındaki izdiham tamamlamak için onlara büyüyen belirlenmiş tohum hücreleri ve steril bir iğne veya bir pipet ucu 6 ile elde edilen tek tabakalı çizilmeye gerektirir. Analiz en çok rastgele seçilmiş yerle 7-9 birden fazla zaman noktası boyunca sıfırdan genişliğini karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Onun belirgin kullanılmasına rağmen, çizilmeye tahlil tekrarlanabilirlik ve ölçümü ile ilgili sorunlar ile şaşırmış. Değişkenliğisıfırdan nesil değil, sadece hücrelerin mikro değiştirir, ama aynı zamanda plaka yüzeyi ve altında yatan hücre dışı matriks-5 zarar vererek hücre göçü engelleyebilir. Deneyler genellikle, ancak daha yavaş göç ve daha uzun deney süreleri gösteren hücre hatları için, 12 saat ila 7 üzerinden yürütülmektedir, proliferasyon, bir karıştırıcı bir değişken 7,10 olur. Son olarak, kaşıma işlemi tarafından oluşturulan yaşlanmış hücreler tek tabakalı 1 açığını kapatmak için gerekli dışı sinyalizasyon müdahale faktörleri serbest bırakabilirsiniz. Karalama tahlil Optimize tahlil süresi uzunluğu en aza indirerek, ve manipülasyon sırasında istenmeyen hücre ölümünü engelleyen, yüzey özelliklerine müdahale etmeyen tutarlı bir boşluk yaratılmasını gerektirir. Durdurucu bazlı analiz, bir hücre yasak bölge testinin bir optimizasyon olduğunu. Bu deney, hücre büyümesinin hariç oyuk ortasına yerleştirilen bir stoper kullanılmaktadır ancak bu hücreler, merkezi hariç bırakma bölgesi çevresindeki kaplama sağlar.Göç değerlendirmek için, durdurucu çıkarılmaktadır ve elde edilen dışlama alanı geçiş meydana gelmesi için bir yüzey sağlar. Bununla birlikte, bu deney, özelleştirmek veya 10 adapte zordur ve bazı uygulamalar için, bu teknik, aynı zamanda engelleyici mal olabilir.
Sıfırdan deneyleri ve bunların türevleri, trans-çukurlu göç deneyleri (veya Boyden oda tahlilleri) aksine kemotaktik maddeler 8,11 ihtiva eden bir hazneye, mikro-gözenekli bir filtre zarı içinden bir odacıktan hareket hücre sayısının ölçülmesi ile göç değerlendirmek 12. Gözenekli zarından göç sonrasında, hücreler kemotaktik ajanlara maruz membran tarafına yapışır ve doğru ölçmek için zor olabilir, çünkü bu teknik, MSC gibi yapışık hücreler için programı sınırlıdır. Tahlil bazı üç boyutlu göç yollarını incelemek mümkün olsa da, kısıtlı hücre tipleri hangi için doğru hücre göçü limitini kendi yarar ölçmek mümkün 10. Karalama deneyleri için başka bir alternatif deforme ve bir vekil olarak diziye göç hücrelerinin yeteneği kullanarak üç boyutlu bir uzayda hücresel motilitesini ölçen bir mikro-ayağı dizisi kullanır. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerler kesin bir kalıp üzerine tedavi ve ozon ile tedavi ve fibronektin homojen olmayan parçalanabilir mikro üretir. Dizi 4 girmek için hücrelerinin yeteneği ölçmek için gerektiği gibi mikro-kolonu boşluk da değişebilir. Kalıp, yüksek boy oranı dizisinin 13 negatif bir sürümünü oluşturmak için silikon gofret derin reaktif iyon aşındırma yoluyla oluşturulur. Tahlil onun customizability tarafından güçlendirilmiştir edilirken, yetenek göç hücrelerinin doğrudan görselleştirme yoluyla üç boyutlu göç ve analiz modeli, mikro-ayağı diziler yaratmada güçlük ekonomik yaygın kullanımını engellemektedir.
Bu protokol açıklanan optimize karalama tahlil verimli, cos sağlarserbestçe kullanılabilir yazılımı kullanılarak analiz edilebilir ve tutarlı bir şekilde çiziklerin üretilmesi için T-etkili bir yöntemdir. Bunun yerine önce ve hücre göçü sonrasında sıfırdan genelinde yapılan basit genişlik ölçümleri, yazılım öncesi ve sonrası toplam çizilmeye göç alanlarını belirlemek için kullanıcı sağlar. Bu gelişme nerede genişlik ölçümleri alınmalıdır çizik belirlemeye çalışıyor konusunu sınırlayan ve sıfırdan genişliği olsun o uzunluğu boyunca üniform olduğunu. Buna ek olarak, hücre sayıları, hücre izdiham tipi ve hücrelere verilen hasarı derecesi dikkatli optimizasyonu daha deneyi optimize etmek için ele alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: kullanarak uzak akciğer dokusundan Bu çalışmada, akciğer mezenkimal stromal hücreler (LR-MSC'ler) için izole edilmiştir, ya da hücre yüzey markerlerinin ifadesiyle (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1, yüksek, EpCAM negatif) 14,15 göre eksplant dışı büyüme 16, ya da enzimatik sindirimi 17 kullanarak. Yapışık LR-MSC'ler, yüksek glikoz ve hiçbir glutamin,% 15 FBS, 1 x antibiyotik / antimikotik ve 2 mM glutamin (bundan böyle komple ortamı) ile DMEM içerisinde kültürlendi ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edildi. LR-MSC'ler, migrasyon deneyi ile nispeten homojen bir büyüme özelliklerine sahip bir hücre popülasyonu sağlamak için 3-4 kez geçirilmiştir.
1. konfluent tek tabaka hazırlanması
- Standart 100 mm kültür kaplarından MKH'lerin ayırmak için, 37 ° C önceden ısıtılmış 10 ml PBS ile yıkama hücreleri PBS aspire ve tripsin 4 ml (% 0.25) ilave edin. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 3-5 dakika kuluçkalayın. C aspire5 dk hücreleri aşağı pelet için bir konik tüp içine arşın, 300 g tam medya ve santrifüj eşit miktarda ekleyin.
Not: tripsin içinde uzun inkübasyon hücre yüzey reseptörleri değiştirebilir ve potansiyel geçiş etkileyebilir. - Medya aspire ve taze eksiksiz bir medya tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreleri saymak tripan mavisi dışlanmasını kullanarak ölü hücreleri hariç ve 60 mm hücre kültürü çanak eksiksiz bir medya 4 ml 500.000 mezenkimal stromal hücreler plaka.
Not: hücre kaynağına bağlı olarak, testler gereken hücre optimal sayısını belirlemek için gerekli olabilir. - Plakalar optimum hücre eki ve çoğalması için% 90 konfluent, MSC için genellikle 48-72 saat kadar inkübe hücreleri.
Not:% 100 izdiham onların göç kapasitelerini değiştirebilir birçok ankraj bağımlı hücreleri deneyim temas inhibisyonu, çünkü, tavsiye edilmez. Görüntü analiz yazılımı boşluğu yorumlamak çünkü% 80'den az izdiham ile Tabaklar kullanılamaz fotoğraflar neden olacaktırsıfırdan çevresinin bir parçası olarak hücreler arası s (Şekil 1D bakınız). - Hücreler% 90 izdiham ulaştınız sonra, uygulama için uygun olarak hücrelere zarar. Çözünür sigara dumanı ekstraktı (CSE) maruziyetten sonra hücre hasarı değerlendirmek için, 2 dakika 18 üzerinde bir Büchner şişesi içinde eksiksiz bir medya 25 ml ile 1 University of Kentucky araştırma sigara (3R4F) duman çizerek% 100 CSE üretir.
- Tam ortam içinde seyreltilmiş 4 mi% 1-4 CSE 24 saat süre ile inkübe hücreleri. Kuluçkadan sonra, 4 ml yeni, tam ortam ile değiştirmeden önce, ılık steril PBS ile iki kez 4 ml yıkama hücreleri.
Not: sigara dumanı özü yüksek konsantrasyonda (>% 5) ile zarar görmesi hücreleri esas olarak izdiham azaltabilir.
2. Scratch oluşturma
- Steril bir ortamda, hasarlı MKH 60 mm plaka kapağı çıkarın ve AC (örneğin steril bir plastik cetvel için) bir cetvel yatıyorduross plakanın üst kenar. Ortamı çıkarmadan, yaklaşık 5 mm aralıklı plaka üzerinde bir ila dört paralel çizikler ve uzun 50 mm yapmak için steril düz kenar tarafından yönlendirilen bir steril 200 ul pipet ucu kullanın.
Not: Bir düz kenar o mikroskop sahnede olduğunda plaka için gerekli dönme ayarlamalar miktarını en aza indirir. Bu çizikler ekranda tamamen dikey (veya yatay) görünür olması zorunludur. 60 mm plaka üzerinde birden fazla çizik oluşturma hücre göçü (veriler gösterilmemiştir) etkileyen bir şekilde mikro-değiştirmez, ancak diğer hücre tipleri için bir göz olabilir. Kuyunun kenarına yakın büyüyen hücrelerin değişkenliği daha belirgin hale gelir ve çizilmelere tekdüze nesil etkileyebilir çünkü küçük kuyuların kullanılması tavsiye edilmez. - Ortamı aspire ve yavaşça sıfırdan merkezine yapışan hücreler önlemek için önceden ısıtılmış tam ortam 2 ml plakaları yıkayın ve hücre kaldırmak içinkaşınma gevşetilmiş olan s. Taze tam ortam 4 ml ile değiştirin.
- Steril kalıcı bir kalem kullanarak, çizikler görüntüleme engel olmaz yerde plakanın alt 1-4 her çizik etiket.
Not: çizik genişliği varyasyon olabilir, çünkü aynı sıfırdan görüntüleri öncesi ve göç sonrası karşılaştırıldığında önemlidir.
3. Scratch başlangıç Görüntüleri alarak
Not: çizik deneyi birden plakalar üzerinde yapılırsa, bu çizikler sonraki plaka üzerinde yapılmadan önce tek bir plaka üzerinde tüm çizikler ilk görüntüleri alınması tavsiye edilir.
- Analiz için gerekli görüntüleri oluşturmak için bir kamera ile bir ters faz kontrast mikroskobu kullanın.
- Mikroskop kültür plakası yerleştirin ve çizilmeye # bulmak için düşük güç hedefi (10X) kullanın 1. Kültür plaka kapağına yoğuşma net bir imag engelleyen isehücrelerin e 37 ° C'ye kadar ısıtılmış bir kademeli dizi kullanılır.
- Gerekirse kadar görüntüler elde tamamen yatay ve görüş alanının merkezinde sıfırdan tutulması scratch uzunluğunun% 90 kapsayacak. Görüntüler arasında hiçbir örtüşme ile sıfırdan farklı bölümlerinin görüntüleri elde edebilir.
Not: kültür çanak kenarlarında ışık kırılma analiz etmek, onları imkansız hale görüntüleri overexposes. Bu nedenle, ilk görüntüleri almak ve scratch uzunluğunun% 5 sürmez. - Ayrı bir klasörde her sıfırdan görüntüleri kaydedin.
- Tekrarlama çizilmelere 2, 3 3,2-3,4 ve 4. adımları.
- Hemen ilk görüntüleme sonra inkübatör plakaları dönün. Hücreler 4-7 saat göç edelim.
Not: CSE ile hasarlı MKH'lerin değerlendirirken 7 saat uygunudur. Hücre çoğalması, hücre göçü için karıştırıcı bir değişken olarak hareket edebilir, çünkü daha büyük 7 saat boyunca inkübe (aşağıda isteğe bağlı Not 8.2) tavsiye edilmez.
- (Malzeme / Ekipman Tablo bakınız) ImageJ indirin ve Yara İyileşmesi Aracı eklenti yüklemek.
- ImageJ görüntü dosyasını açın, sonra Yara İyileşmesi Aracı çizik alanı (Şekil 2B) hesaplamak için sıfırdan çevreleyen hücrelerin vurgulamak için "Kenarları Bul'u" "Süreç" linkine tıklayın ve. Sonra, "Görüntü", "ayarlama" "Renk Eşiği" ve "Eşik Renk" etiketli açılır menüden değerini değiştirmek tıklayın "B & W."
- Çizik ve hücre ön arasında optimum kontrast elde edilinceye kadar "Renk Eşiği" menüsü içinde, hem de parlaklık eşik sürgü ayarlayın. Görüntüdeki kontrast oluşturur sağa (tamamen siyah resim) tamamen alt kaydırıcıyı hareket ettirin ve sonra maksimum kontrast oluşturmak için üst kaydırıcıyı ayarlamak için çalışıyoruz büyük aralığı için izin vermek için.
- Yavaş yavaş üst bri ayarlamakGörüntü temiz sıfırdan (Şekil 2C) konturu görüntüler kadar soldan sağa ghtness kaymak. Sıfırdan kenarları tespit edildikten sonra, çizik bölgeyi vurgulamak için, açılır menüden "MRI_Wound_Healing_Tool" seçeneğini seçin ve "m" düğmesine (o ImageJ araç çubuğunda görünecektir) basın ImageJ araç çubuğundaki "Daha Araçlar" tıklayın ve çıkış sonuçları pop-out pencere (Şekil 2B) bilgisayarlı alan.
- Kopyala ve bir excel elektronik tabloya sonuç penceresinde (Şekil 2E) tüm sayıları yapıştırın. Bireysel çizilmelere verileri ayırmak için emin olun.
5. Scratch Final Görüntüleri alarak
- Hücreleri (4-7 saat) göç ettikten sonra, tekrar 3.2-3.4 yineleyin. Görüntü her tabakta hücreleri göç eşit zaman oldu, böylece çizik aynı sırayla plakalar.
Not: Hücreler çoklu zaman noktalarında görüntülü olabilir, bunların sensi bağlı olarakHer iki sıcaklık ve pH değişikliklerine tivity. Alternatif olarak, canlı hücre görüntüleme onlar göç gerçek zamanlı olarak hücreleri izlemek için kullanılabilir.
6. Final Scratch Görüntüler incelendiğinde
- Tekrarlayın son çizik görüntüler için 4.2-4.5 adımları tekrarlayın.
7. Göç belirlememize Scratch Alanını Hesaplama
- İlgili çiziklerin ilk alan değerlerinin ortalaması alınarak ortalama öncesi göç alan hesaplayın.
- Ortalama öncesi göç alanında (adım 7.1) den, 6. adımda hesaplanan her bir görüntü için son göç alan, çıkartılmasıyla göç toplam tutarı hesaplayın. Göç değişikliği temsil eden her sıfırdan değerlerinin bir listesini oluşturun.
- (Yani hücreleri üzerinde tüm tabak ve tüm çizikler% 0 ÖAM'ye maruz) aynı test grubunda birden fazla çizilmelere verileri Havuz. Deney grupları arasındaki farklılıkları analiz etmek için Varyans testi bir analizi kullanın.
- Hücreler geçirmek yavaşsave (büyük 10-12 saat daha az) çizilmemesi sonra uzun bir kuluçka süresi gerektirir, hücreler göç tahlil meydana edildiği dönemde herhangi çoğalmasını geçiren olup olmadığını bir BrdU veya edu kuruluş tahlil 19 belirlemek için gerçekleştirin. Önemli hücre çoğalmasını önlemek için bir geçiş süresi tahlil seçin.
İsteğe bağlı 8.
- Önemli hücre yaşlanması kazıma işleminin bir sonucu olarak meydana gelen olup olmadığını değerlendirmek için, 19 çizilmeye sonra önceden tespit edilmiş zamanlarda, bir test plakası üzerinde yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz deneyi yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan karalama deneyleri fare akciğer ikamet mezenkimal stromal hücreleri (LR-MKH'lerin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve protokol notları başvurulan olarak izole edilmiştir. LR-erişkin 60 mm doku kültürü çanağı içinde 500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanır ve 48 saat% 90 konflüansa büyütülmüştür. Hasar oluşturmak için,% 4 CSE (yukarıda tarif edilmiştir), ilk tohumlama dönemin ardından 24 saat süre ile, ancak sıfırdan analizden önce hücreler ile inkübe edildi. Her bir deney için, sıfırdan 200 ul bir pipet ucu kullanılarak elde edilmiştir. Karalama oluşturulan edildikten sonra, ilk görüntüler alındı ve gevşek hücreleri ve enkaz eksiksiz bir medya ile yıkanıp olmuştu. Şekil 1A ve B'de gösterildiği gibi, uygun izdiham görüntüleme yazılımı doğru sıfırdan sınırlarını belirlemek sağlamak için önemlidir. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, hücreler (ya da yeterli derecede olmadığı için tohumlama yoğunluklarının yetersiz inc yeterli konfluent değildir. Kolayca görüntüleme yazılımı (Şekil 1D) ile ayırt edilmez heterojen sınırları olan çiziklere neden 2 Şekil olabilir ubation süreleri, ya da aşırı hasar), görüntü elde etme ve analiz göstermektedir. Şekil 2A analizden önce orijinal görüntüyü gösteriyor. 2B gösterir Şekil "Süreç" menüsü altında "Kenarları Bul'u" aracı sonucu (4.2 Adım) ve Şekil 2C "Renk Eşiği" kaydırma çubuğundaki (Adım 4.3) ayarlanması aşağıdaki görüntü gösterir. Şekil 2B MRI_Wound_Healing_Tool çalıştırdıktan sonra son olarak analiz görüntü resmediyor eklenti (Adım 4.4). Şekil 2E sonuçları pop-out pencere, vurgulama (kırmızı kutu) oluşturulan sayılar göstermektedir. Temsili öncesi ve sonrası göç görüntüleri görüntüleme yazılımı tarafından tanımlanan karalama alanı sınırları karşılık gelen, Şekil 3'te gösterilmiştir. 4 g Şekilraphically% 4 CSE ile hasar sonrası LR-MKH görülen değişmiş göçmen kapasite göstermektedir. % 0 CSE veya% 4 ya maruz kalma ile% 95 izdiham ya öncesi veya sonrası göç de LR-MKH bir tabak üzerinde yapılan 4 çizik, her biri için Şekil 4A ve B, (piksel olarak) ortalama hesaplanan karalama alanları içinde CSE karşılaştırılır. Şekil 4C çizik alanında% 0 ya da% 4 ÖAM'ye ya maruz LR-MKH (ön göç alanındaki çıkarılır sonrası göç alan) çizik alanı hesaplanan ortalama değişim, daha az göç gösteren (düşük ortalama değişim karşılaştırır ) 4,% ÖAM'ye maruz kaldıktan sonra.
Şekil 1: Doğru izdiham sağlam tekrarlanabilir çizik deneyi üretimi için kritik öneme sahiptir. (A) Fare LR-MKH% 95 izdiham, scr için uygunİzlemekte. (B)% 95 izdiham başarılı bir çizik. Başarılı bir çizik için (C) LR-MKH% 70 izdiham, çok düşük. % 70 izdiham (D) Görüntü edinimi yanlış sınırlarını üretebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: görüntü elde etme ve analiz gösteren Temsilcisi görüntüleri (A) Orijinal görüntü.. (B) "Süreç" menüsünde (Adım 4.2) altında "Kenarları Bul'u" aracı uygulaması aşağıdaki görüntü. (C) Görüntü "Renk Eşiği" kaydırma çubuğundaki (Adım 4.3) ayarlanması şu. MRI_Wound_Healing_Tool eklentisi (Adım 4.4) çalıştırdıktan sonra (D) Görüntü. (E) Rsonuçları · Borçlar pop-up penceresi vurgulama (kırmızı kutu) her bölge için oluşturulan numaralar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: karşılaştıran karalama testte Temsilcisi görüntüler öncesi ve geçişten sonra LR-MKH'lerin çizik (A) Temsilcisi orijinal görüntü ön göçü.. Hesaplanan karalama alanı ön göç (B) Anahat. (C) Temsilcisi orijinal görüntü sonrası göç. Hesaplanan karalama alanı post-göç (D) Anahat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
<img alt = "Şekil 4" src = "/ files / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
Şekil 4: 0 veya% 4,% ÖAM'ye birine çizik öncesi ve LR-MSC geçişten sonra karalama alanının ölçümü karşılaştırarak tahlil ve maruz kalma Temsilcisi sonuçlar. Olarak sunulan verilerle% 0 ÖAM'ye maruz kalma ile% 95 izdiham ya öncesi veya sonrası göç de LR-MKH bir tabak üzerinde yapılan 4 çizilmelere her biri için (A) (piksel olarak) ortalama hesaplanan çizik alanının grafiksel gösterimi, ortalama ve standart sapma. Olarak sunulan verilerle% 4 ÖAM'ye maruz kalma ile% 95 izdiham ya öncesi veya sonrası göç de LR-MKH bir tabak üzerinde yapılan 4 çizilmelere her biri için (B) (piksel) ortalama hesaplanan çizik alanının grafiksel gösterimi, ortalama ve standart sapma. LR-MKH içinde karalama alanı (post-öncesi göç) hesaplanan ortalama değişim (C) Karşılaştırma scr az göç (düşük ortalama değişim gösteren,% 0 ya da% 4 CSE ya maruzortalama ve standart sapma olarak sunulan veriler ile% 4 CSE, maruz kaldıktan sonra atch alan), * p = 2.99 x 10 -8. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek ve çizilmeye deneyleri analiz etmek için kantitatif sağlam, standart bir yöntem sağlar. Basit çizik deneyleri rutin hücresel göç incelemek için çalışmanın çok farklı alanlarda kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel karalama tahlil tekrarlanabilir 7,10 ile ilgili sorunlar yol açmıştır standart bir set-up ve miktar protokolünü yoksun kalmıştır. Modifikasyonlar ve çizik testi geliştirilmesi için optimizasyonlar birçok bireysel canlı hücre görüntüleme, standartlaştırılmış stoper tabanlı deneyleri, ve üç boyutlu mikro-ayağı deneyleri 4,8,10 dahil olmak üzere bu konuları, azalttı. Bununla birlikte, bu deneyler, özelleştirmek veya 10 adapte zor olabilir ve bazı uygulamalar için, bu teknikler, aynı zamanda engelleyici mal olabilir.
Standart bir çizik tahlil protokolü üretmek için, hücreler birinci ciltte, s hakkında özel bilgi gerektiren Burada sunulan protokol birçok kritik adımlar vardırİlgili hücre özelliklerine göre tahlilin ved ve optimizasyonu. Özellikle, deney için% 90-100 (1.3 adım ve 1.4 Adım) de düzgün bir tek tabaka elde etmek için ihtiyaç duyulan hücre sayısı ve gerekli kültür süresini optimize etmek için önemlidir. Çok az sayıda hücre (az% 90 konfluent) ile, hücreler yeterli bir tek tabaka oluşturacak olmaz. Sadece bu hücresel mikro etkileyecek, ama aynı zamanda doğru sıfırdan kenarlarını belirlemek için görüntüleme yazılımı yeteneğini etkiler. Buna karşılık, bir tek tabaka içinde çok fazla hücre (% 100 konfluent veya yığılmış hücre) temas inhibisyonu ile sonuçlanır ve bu nedenle, hücrelerin göç özelliklerini değiştirebilir. Karalama tahlil protokolü bazı varyasyonları% 100 izdiham hücre büyümesini tavsiye ve MSC 8 gibi bazı temas duyarlı hücreler için bu potansiyel sınırlama düşünmüyoruz. Aynı endişeleri infli olan hasarın derecesine uygulanmalıdırhücreler üzerindeki cted (1.5 adım). Burada açıklanan protokol göç kapasite MKH çözünebilir sigara dumanına maruz hasar sonrası hücre göçü değişiklikleri değerlendirmek için tasarlanmıştır, ancak bu testte hücre göçü hasar birçok farklı türde etkisini değerlendirirken aynı derecede yararlı olabilir. Bu etkilenen hasarı deney ve kontrol grupları arasında istatistiksel ayrım sağlamak için yeterli olması önemlidir. Ancak, çok fazla hasar da yine doğru sıfırdan kenarlarını belirlemek için görüntüleme yazılımı yeteneğini etkileyebilir azaltılmış hücre izdiham, neden olabilir.
Hem hücresel yaşlanma ve hücre çoğalması yanlış karalama tahlil sonuçlarını değiştirebilir karıştırıcı faktörler olabilir. Özel olarak, sıfırdan oluşturulması dikkatle yaşlanmada meydana gelebilir çevreleyen hücreler aşırı hasar görmesini önlemek için dikkat edilmelidir. Bir hypoderm yerine plastik bir pipet ile TaraklıAyrıca göç bölgesi ve hücre dışı matris (Adım 2.1) kültür plaka yüzeyinin bütünlüğünü koruyarak ic iğne veya bisturi aşırı zarar görmesini engeller. Buna ek olarak, hücre göçü oluşmasına izin verilen sürenin uzunluğunu dikkatle karıştırıcı bir değişken (Aşama 3.7) kadar önemli hücre çoğalmasını önlemek için göz önüne alınmalıdır. CSE ile hasarlı hücreleri değerlendirirken LR-MSC göç analizi için, 7 saat uygunudur. Genel olarak tavsiye edilmez fazla 12 saat boyunca inkübe, ancak bu, tüm hücre tiplerine çok düşük katlama oranları özellikle geçerli olmayabilir. Her iki hücre yaşlanmasının ve hücre çoğalmasını, yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz ve BrdU ya edu dahil bir arada tahlilinde 19 sonunda hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir değerlendirmek. Önemlisi, burada açıklanan protokol sadece kaliteli bir ters faz kontrast mikroskobu ve kamera gerektiren sınırlı teknik kapasiteye sahip laboratuvarlar, erişilebilir.reaktifler ucuzdur ve görüntüleme yazılımı açık kaynak. Bununla birlikte, iyi bir tekrarlanabilirlik ve titiz istatistiksel analiz yeteneği dahil olmak üzere, bu deneyde en iyi sonuçları sağlamak üzere, dikkatli bir optimizasyon denenir her yeni bir hücre tipi ya da deneysel hasarı senaryosu için dikkate alınmalıdır.
Optimizasyonları bu protokol adresi çizik deneyleri standardize yapılan önceki çalışmalarda bulunan sınırlamalar bazı sundu. Karalama tahlil protokolleri geleneksel karalama 8,9 bir anlık çizik genişlik ölçülerini almak Oysa, burada sunulan protokol istatistiksel titizlik artırmak ve genişliği dikkate tutarsızlıkları dikkate almak sıfırdan tüm uzunluğu boyunca alınan görüntülerden alan ölçümleri kullanır İlk çizik. Tekrarlanan test dayanarak (veriler gösterilmemiştir), çizilmeye genişliği uzunluğu boyunca mükemmel tutarlı olması kabul edilemez. Th geçişten sonra, kenarlarıe çizik giderek zor doğru bir çizik genişliği hesaplamak, ve daha fazla alan hesaplamaları gerektiren yapma, daha heterojen hale gelir. Bu protokol öznelliği azaltmak ve çizik bölgeyi analiz ederken tutarlılığını artırmak amacıyla, MRI_Wound_Healing_Tool, özel bir bilgisayar programı kullanır. Basit genişlik hesaplamaları nedeniyle önceki CSE veya diğer zararlı göç ince farkları ayırt etmek yeterince spesifik sonuçlar verebilir bilinmemektedir iken, bu protokol bu hassasiyeti göstermektedir. Bu protokol sunulan optimizasyonlar özelleştirme için seçenekler sunmak ve hassasiyeti göstermeleri ve sonuçları doğrulamak için ek teknikler sağlamak için, ekonomik açıdan uygulanabilir bir şekilde bu sınırlamaları ele ortak çizik tahlil yenilemek.
Bu protokol açıklanan optimize kantitatif karalama tahlil hala yerine tek tek hücrelerin daha bir hücre popülasyonunu dikkate alarak sınırlıdır. Bu teknik, Assumhücre popülasyonu, nispeten homojen olduğu, ve bu nispeten homojen göç özelliklerine neden olur o es. Uygulamaya bağlı olarak, tek tek hücreler yerine, 8 göçünü kabul etmek daha uygun olabilir. Ayrıca, burada açıklanan sıfırdan deney protokolü 4-7 saatlik bir süre boyunca göç analizi karıştırmak yeterince hızlı bir şekilde prolifere olmaz hücre popülasyonu bağlıdır. Bu kısa bir süre zarfında yoğun Çoğalabilen hücre çizgileri, bu teknik kullanılarak analiz etmek için uygun olmaz. Bu kısıtlamalara rağmen, bu niceliksel çizik tahlil protokolü birçok farklı uygulamalarda kullanım için bir potansiyele sahiptir. Örneğin, bir hücre hasarı-bazlı analiz optimize edilmiş ve daha sonra hücre hasarı sınırlandırmak için, özellikle tedavi kabiliyetini değerlendirmek üzere kullanılabilir. Alternatif olarak, bu deney, O, göçmen kapasite ve bu nedenle metastatik potansiyelini sınırlamaktadır potansiyel tedaviler değerlendirmek için kanser hücresi çizgileri ile kullanılabilecekBu hücrelerin f. Bu optimize karalama tahlil de hala sıfırdan üreten kaçınılmaz hücre mikroçevresinin olası bozukluklar ile sınırlıdır. Bununla birlikte, dikkatli bir şekilde, hücre izdiham düzeyde artmış apoptoz ya da kısmen sıfırdan kenarında ayrılmış hücrelerin tabakaların üretimi seçilerek önlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
