Introduction
A migração celular é altamente coordenada e vital para muitos processos fisiológicos, tais como desenvolvimento do tecido, reparação e regeneração, bem como processos patológicos tais como a metástase do cancro e arteriosclerose 1. Uma compreensão da migração celular é particularmente relevante para as terapias emergentes utilizadas para reparar tecidos danificados e tratar condições patológicas, incluindo as tecnologias de transplante de células e tecidos artificial enxerto 2. Dado o interesse atual no papel de células estromais mesenquimais (MSCs) na mediação de reparação de tecidos 3, quantificando a capacidade migratória destas células usando um ensaio que é rigorosamente quantificável, adaptável e relação custo-benefício é de interesse. É importante ressaltar que tal ensaio deve ser suficientemente sensível para detectar mudanças relativamente sutis na capacidade migratória celular após dano. Os métodos actuais para quantificar a migração de células, incluindo ensaios de risco, os ensaios de migração trans-poços (CH Boydenâmbares), matrizes micropillar e ensaios zona de exclusão de células possuem uma série de limitações na reprodutibilidade, personalização, quantificação e custo-efetividade 1,4,5. O ensaio zero otimizado aqui descrito demonstra resultados robustos, capacidade de análise quantificáveis e baseados em imagem, relação custo-eficácia e capacidade de adaptação a outras aplicações.
Os ensaios de raspadinhas têm sido utilizados em várias capacidades para avaliar a migração celular e proliferação em diferentes condições experimentais 5. O ensaio implica semeando as células designadas, cultivá-las para completar ou próximo da confluência, e coçar a monocamada resultante com uma agulha estéril ou ponta de pipeta 6. Análise é mais vulgarmente efectuada por comparação da largura do zero ao longo de múltiplos pontos de tempo em locais seleccionados aleatoriamente 7-9. Apesar de seu uso proeminente, o ensaio do zero é confundida por problemas com a reprodutibilidade e quantificação. A variabilidade nageração de zero a não apenas altera o microambiente das células, mas também pode impedir a migração de células ao danificar a superfície da placa e da matriz extracelular subjacente 5. Os ensaios são frequentemente realizados ao longo de 7 a 12 h, no entanto, para linhas de células exibindo migração mais lenta e os tempos de ensaio mais longos, a proliferação torna-se uma variável de confusão 7,10. Por último, as células senescentes gerados pelo processo de coçar pode libertar factores que interferem com a sinalização extracelular necessária para fechar a fenda na monocamada 1. Optimizar a zero ensaio requer a criação de uma diferença consistente, que não interfere com as propriedades de superfície, minimizando o comprimento de tempo de ensaio, e a prevenção da morte de células indesejáveis durante a manipulação. O ensaio à base de batente consiste numa optimização do ensaio de uma zona de exclusão de células. Este ensaio utiliza uma rolha colocado no meio do poço que exclui o crescimento celular, mas permite que as células a ser revestida em volta da zona de exclusão central.Para avaliar a migração, a tampa é removida, e a zona de exclusão resultante proporciona uma superfície para a migração ocorra. No entanto, este ensaio é difícil para personalizar ou adaptar a 10 e para algumas aplicações, esta técnica também pode ser um custo proibitivo.
Em contraste com os ensaios de zero e os seus derivados, ensaios de trans-migração bem (ou ensaios de câmara de Boyden) avaliar a migração através da quantificação do número de células que se movem de uma câmara, através de um filtro de membrana microporosa, para uma câmara contendo agentes quimiotácticos 8,11, 12. Esta técnica tem utilidade limitada para as células aderentes como as MSCs porque após a migração através da membrana porosa, as células aderem ao lado da membrana exposta aos agentes quimiotácticos, e pode ser difícil de quantificar com precisão. Enquanto o ensaio é capaz de analisar alguns padrões de migração tridimensionais, os tipos de células restritas para o qual é capaz de quantificar com precisão limite de migração celular sua utilidade 10. Outra alternativa para ensaios de zero usa uma rede de micro-pilar, que mede a motilidade celular através de um espaço tridimensional utilizando a capacidade das células para se deformar e migram para a matriz como um substituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre um molde preciso e tratada com ozono e fibronectina produz um microambiente homogénea e não degradável. Espaçamento Micro-pilar também pode ser variado conforme necessário para avaliar a capacidade das células para introduzir a matriz 4. O molde é criado por meio de gravura de ião reactivo profundo de bolachas de silício para criar uma versão da matriz negativa de alta relação de aspecto 13. Enquanto o ensaio é reforçada pela sua capacidade de personalização, capacidade de modelar a migração tridimensional, e análise através da visualização direta de células que migram, dificuldade em criar micro-pilar matrizes impede economicamente seu uso generalizado.
O ensaio zero otimizado descrito neste protocolo oferece uma eficiente, cosmétodo t-eficaz para produzir arranhões consistentes que podem ser analisados usando o software disponível gratuitamente. Em vez de medidas de largura simples, feitas em toda a zero antes e depois da migração celular, o software permite ao usuário determinar áreas totais scratch antes e depois da migração. Este avanço limita a questão de tentar determinar onde a zero as medidas de largura devem ser tomadas, e se a largura do zero é uniforme ao longo dela de comprimento. Além disso, a optimização cuidadosa dos números de células, confluência celular e o tipo e grau do dano infligido nas células é discutida, a fim de optimizar ainda mais o ensaio.
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Protocol
Nota: Para este estudo, as células estromais mesenquimatosas do pulmão (LR-MSC) a partir de tecido de pulmão distai foram isoladas, quer com base na sua expressão de marcadores de superfície celular (CD45 negativo, CD31 negativo, Sca-1 elevada, EpCAM neg) 14,15, usando explante out-crescimento de 16, ou usando a digestão enzimática 17. Aderente LR-MSC foram cultivadas em DMEM com glucose elevada e sem glutamina, 15% de FBS, glutamina mM de antibiótico / antimicótico 1x e 2 (meio completo daqui em diante) e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO 2. LR-MSC foram passadas 3-4 vezes para assegurar uma população de células com características de crescimento relativamente homogéneas para o ensaio de migração.
1. Preparar uma monocamada confluente
- Para separar as MSCs a partir de placas de cultura padrão de 100 mm, lavar as células com 10 ml de 37 ° C pré-aquecido PBS, aspirar o PBS e adicionar 4 ml de tripsina (0,25%). Incubar em 3-5 min a 37 ° C incubadora. Aspirar o cells para um tubo cónico, adicionar um volume igual de meio completo e centrifugação a 300 g durante 5 min para sedimentar as células para baixo.
Nota: de incubação mais longo em tripsina pode alterar os receptores da superfície celular e, potencialmente, afectar a migração. - Aspirar media e células ressuspender em meio completo fresco. Contagem de células, excluindo as células mortas usando exclusão com azul de tripano e as células do estroma placa 500.000 mesenquimais em 4 ml de meio completo numa célula de 60 mm de cultura prato.
Nota: Dependendo da fonte das células, os testes podem ser necessários para determinar o número óptimo de células necessárias. - Incubar as células até placas são 90% confluentes para fixação celular ideal e proliferação, normalmente 48-72 horas para MSC.
Nota: 100% de confluência não é recomendado, uma vez que muitos inibição células experiência de contato dependentes de ancoragem, o que pode alterar a sua capacidade migratória. Placas com menos de 80% de confluência irá resultar em fotos inutilizáveis porque o software de análise de imagem irá interpretar lacunas entre as células como parte do perímetro do zero (veja a Figura 1D). - Após as células terem atingido confluência de 90%, danificar as células conforme for apropriado para a aplicação. Para avaliar o dano celular após a exposição à fumaça de cigarro extrato solúvel (CSE), geram 100% CSE, chamando a fumaça de um cigarro Universidade de Kentucky pesquisa (3R4F) através de 25 ml de meio completo em um Kitasato mais de 2 min 18.
- Incubam-se as células durante 24 horas em 4 ml de 1-4% de CSE diluído em meio completo. Após incubação, lavam as células duas vezes com 4 ml de PBS estéril quente, antes de substituir com 4 ml de meio completo fresco.
Nota: danificar as células com alta concentração de extrato de fumaça de cigarro (> 5%) pode reduzir substancialmente confluência.
2. Criação da Raspadinha
- Em um ambiente estéril, retire a tampa da placa de 60 milímetros de MSCs danificados, e estabelecer uma borda em linha reta (por exemplo, uma régua de plástico esterilizado) acRoss da borda superior da placa. Sem remover a mídia, use um estéril ponta da pipeta 200 mL guiado pelo straight-edge estéril para fazer um a quatro arranhões paralelos em toda a placa aproximadamente 5 milímetros e 50 mm de comprimento.
Nota: Uma borda reta minimiza a quantidade de ajustes de rotação necessários para a placa quando está no palco microscópio. É imperativo que os arranhões aparecer completamente vertical (ou horizontal) na tela. Gerando múltiplas arranhões em uma placa 60 mm não altera o microambiente de uma forma que afecta a migração de células (dados não mostrados), mas podem ser uma consideração para outros tipos de células. O uso de pequenos poços não é recomendado uma vez que a variabilidade de células crescendo perto da borda do poço se torna mais pronunciada e pode afectar a geração uniforme de arranhões. - Aspirar os meios e lava-se suavemente as placas com 2 ml de meio completo pré-aquecido para impedir que as células adiram ao centro do zero, e para remover célulass que foram soltos pelo coçar. Substitua com 4 ml de meio completo fresco.
- Usando um marcador permanente estéril, etiquetar cada arranhão de 1-4 no lado inferior da placa no local que não interfira com a imagiologia do arranhões.
Nota: É importante que as imagens do mesmo zero são comparadas antes e após a migração, já que pode haver variação na largura zero.
3. Tendo Imagens iniciais da Raspadinha
Nota: Se o ensaio de zero é efectuada em várias placas, recomenda-se que as imagens iniciais de todos os arranhões em uma única placa são tomadas antes arranhões são feitas na placa seguinte.
- Usar um microscópio de contraste de fase invertida com uma câmara para gerar as imagens necessárias para análise.
- Posicione a placa de cultura no microscópio, e use o objectivo de baixa potência (10X) para localizar zero # 1. Se a condensação sobre a tampa da placa de cultura está a impedir uma clara image das células, utilizar um conjunto de fase aquecida a 37 ° C.
- Mantendo a zero completamente horizontal e no centro do campo de vista, obter o número de imagens necessárias para abranger 90% do comprimento do zero. Obter imagens de partes distintas do zero com nenhuma sobreposição entre as imagens.
Nota: A refracção da luz nas bordas da placa de cultura superexpõe as imagens, o que os torna impossível de analisar. Portanto, não tirar fotos a partir do primeiro e duram 5% do comprimento do zero. - Salve imagens de cada arranhão em uma pasta separada.
- Repita os passos de 3,2-3,4 para arranhões 2, 3 e 4.
- Retorno placas para a incubadora imediatamente após a imagem inicial. Deixe as células migram para 4-7 horas.
Nota: 7 horas é o ideal quando se avalia MSCs danificadas com CSE. A incubação de células durante mais de 7 horas não é recomendada porque a proliferação de células pode actuar como uma variável de confusão durante a migração celular (ver Nota Opcional 8.2 abaixo).
- Baixe e instale o ImageJ Ferida plugin de instrumento de cura (consulte a Tabela de Materiais / Equipamentos).
- Abra o arquivo de imagem em ImageJ, clique em "Processo" e "Find Edges" para destacar as células ao redor do zero para a Ferramenta de cicatrização de feridas para calcular a área de rascunho (Figura 2B). Em seguida, clique em "Imagem", "Ajuste", "Limiar de cores" e no menu dropdown rotulado "Limiar de cores" altere o valor para "B & W".
- Dentro do menu "Limiar de cores", ajuste ambos os controles deslizantes de nível de luminosidade até um contraste perfeito entre zero e celular frente a é alcançado. Para permitir o maior alcance ao tentar criar contraste na imagem, mova o controle deslizante inferior completamente para a direita (imagem totalmente preta), e em seguida, ajuste o controle deslizante superior para gerar o máximo de contraste.
- Ajuste lentamente o topo brideslizante lho da esquerda para a direita até que a imagem limpa mostra o contorno do zero (Figura 2C). Uma vez que foram identificadas as bordas do zero, clique em "Mais Ferramentas" na barra de ferramentas ImageJ, selecione "MRI_Wound_Healing_Tool" no menu suspenso, e pressione o botão "m" (que aparecerá na barra de ferramentas ImageJ) para destacar a área de rascunho e saída da área computada em uma janela pop-resultados out (Figura 2D).
- Copiar e colar todos os números da janela de resultados (Figura 2E) em uma planilha excel. Certifique-se de separar os dados de arranhões individuais.
5. Tendo Imagens Finais da Raspadinha
- Depois que as células migraram (4-7 hr), repita os passos de 3,2-3,4. Imagem das placas na mesma ordem em que foram riscados de modo que as células em cada placa tiveram o mesmo tempo para migrar.
Nota: As células podem ser trabalhada em vários pontos de tempo, dependendo da sua sensividade de ambas as mudanças de temperatura e de pH. Alternativamente, imagens de células vivas pode ser usado para seguir as células em tempo real, à medida que migram.
6. Analisando finais de raspadinhas Imagens
- Repita os passos de 4,2-4,5 para imagens finais zero.
7. Cálculo da área de rascunho para quantificar as Migrações
- Calcula-se a área média pré-migração calculando a média dos valores dos respectivos riscos iniciais da área.
- Calcule a quantidade total de migração subtraindo a área de migração final para cada imagem, calculado na etapa 6, a partir da área de pré-migração média (passo 7.1). Gerar uma lista de valores para cada um zero que representa a alteração na migração.
- Reúnem-se os dados a partir de múltiplos arranhões dentro do mesmo grupo de teste (ou seja, todas as placas e todos os arranhões em células expostas a 0% de CSE). Use um teste de análise de variância para analisar as diferenças entre os grupos experimentais.
- Se as células são lentos para migrare necessitam de um tempo de incubação mais longo após arranhão (superior a 10-12 h), executar um ensaio de incorporação de BrDU ou EdU 19 para determinar se as células são submetidos a qualquer proliferação durante o período em que o ensaio de migração está a ocorrer. Escolha um tempo de ensaio de migração para evitar a proliferação celular significativa.
8. Opcional
- Para avaliar se a senescência celular é significativo que ocorre como resultado do procedimento de coçar, realizar um ensaio de beta-galactosidase associada a senescência em uma placa de ensaio em tempos predeterminados após arranhão 19.
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Representative Results
Os ensaios scratch aqui apresentadas foram realizadas utilizando residentes pulmão células estromais mesenquimais murino (LR-MSCs) e isolado como referência nas notas de protocolo. O LR-MSC foram semeadas a uma densidade de 500000 células em 60 mm de cultura de tecidos prato, e cultivadas a 90% de confluência em 48 horas. Para gerar danos, 4% de CSE (descrito acima) foi incubado com as células durante 24 horas após o período de sementeira inicial, mas antes do ensaio zero. Para cada ensaio, o zero foi gerado usando uma pipeta de ponta de 200 ul. As imagens iniciais foram tomadas após a zero tinham sido gerados, e quaisquer células soltas e detritos foram lavados com meio completo. Como mostrado na Figura 1A e B, confluência apropriada é importante para assegurar que o software de imagem pode identificar correctamente os limites do zero. Como mostrado na Figura 1C, as células não são suficientemente confluentes (quer devido a densidades de semeadura inadequadas, Inc inadequadavezes ubation, ou danos em excesso), o que pode resultar em riscos com limites heterogéneos que não são facilmente distinguidos pelo software de imagiologia (Figura 1D). A Figura 2 demonstra a aquisição e análise de imagem. A Figura 2A mostra a imagem original antes da análise. A Figura 2B mostra o resultado da ferramenta "Localizar bordas" no menu "Processo" (Passo 4.2) e Figura 2C mostra a imagem a seguir ajuste da barra deslizante "Limiar de cores" (Passo 4.3). Figura 2D mostra a imagem analisada final após a execução do MRI_Wound_Healing_Tool plugin (Passo 4.4). Figura 2E mostra a janela de resultados pop-out, destacando (caixa vermelha) os números que são gerados. Representante pré e pós-migração imagens são mostradas na Figura 3, com os correspondentes limites da área de zero, tal como definido pelo software de imagem. Figura 4 graphically ilustra a capacidade migratória alterada visto em LR-MSCs após danos com 4% de CSE. Na Figura 4A e B, a média calculada áreas do zero (em pixels) para cada um dos 4 arranhões feitos através de uma placa de LR-MSCs a 95% de confluência seja pré ou pós-migração, com orientação para 0% ou 4% CSE CSE são comparados. Figura 4C compara a mudança calculada média na área do zero (área de pós-migração subtraída da área de pré-migração) em LR-MSCs expostos para 0% ou 4% CSE, demonstrando menor migração (variação média inferior na área do zero ) após exposição a 4% de CSE.
Figura 1: confluência correcta é crítica para a geração do ensaio zero reprodutível robusto. (A) Murino LR-MSCs a 95% de confluência, apropriado para scratching. (B) Um risco bem sucedida em 95% de confluência. (C) LR-MSCs a 70% de confluência, muito baixo para um arranhão bem sucedido. (D) A aquisição de imagens a 70% de confluência pode produzir falsos limites. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas que demonstram aquisição e análise de imagem (A) A imagem original.. (B) Imagem seguinte aplicação do "Arestas" ferramenta no menu "Processo" (Passo 4.2). (C) Imagem seguinte ajuste da barra deslizante "Limiar de cores" (Passo 4.3). (D) Imagem depois de executar o plugin MRI_Wound_Healing_Tool (Passo 4.4). (E) Resultados pop-up realce janela (caixa vermelha) os números que são gerados para cada área. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de ensaio zero comparando riscado LR-MSCs antes e após a migração (A) Representante imagem original pré-migração.. (B) do esboço de calculado área de rascunho pré-migração. (C) Representante imagem original de pós-migração. (D) Esboço de área de rascunho calculado pós-migração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<img alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
Figura 4: Os resultados representativos de ensaio zero comparando quantificação da área de rascunho antes e depois da migração LR-MSC, e exposição para 0% ou 4% CSE. (A) representação gráfica da média da área do zero calculado (em pixels) para cada um dos 4 arranhões feitos através de uma placa de LR-MSCs a 95% de confluência seja pré ou pós-migração, com a exposição a 0% CSE, com os dados apresentados como média e desvio padrão. (B) representação gráfica da média da área do zero calculado (em pixels) para cada um dos 4 arranhões feitos através de uma placa de LR-MSCs a 95% de confluência seja pré ou pós-migração, com a exposição a 4% CSE, com os dados apresentados como média e desvio padrão. (C) Comparação de variação média calculada em área de rascunho (da migração pós-pré) em LR-MSCs expostas a 0% ou 4% CSE, demonstrando menor migração (variação média inferior em scrárea atch) após a exposição a 4% CSE, com os dados apresentados como média e desvio padrão, * P = 2,99 x 10 -8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui fornece um método quantitativo robusto, padronizado para executar e analisar testes de zero. Ensaios simples arranhão são rotineiramente utilizados em muitas áreas diferentes de estudo para analisar a migração celular. No entanto, tradicionalmente o ensaio zero faltou um set-up e quantificação protocolo padronizado, o que levou a problemas com a reprodutibilidade 7,10. Muitas das modificações e otimizações para melhorar o ensaio zero reduziram essas questões, incluindo imagens ao vivo de células individuais, ensaios baseados em bujão padronizados, e três dimensões micro-pilar ensaios 4,8,10. No entanto, estes ensaios podem ser difíceis de personalizar ou adaptar a 10 e para algumas aplicações, essas técnicas também podem ser custo proibitivo.
Para produzir um protocolo de ensaio zero padronizado, existem várias etapas críticas do protocolo aqui apresentados que requerem informações específicas sobre a invol célulasved, e optimização do ensaio com base nas características celulares relevantes. Em particular, é importante para optimizar o número de células necessárias e o tempo em cultura necessário para atingir uma monocamada uniforme a 90-100% de confluência para o ensaio (Passo 1.3 Passo 1.4 e). Com muito poucas células (menos de 90% confluentes), as células não irão formar uma monocamada suficiente. Não só este vai afetar o microambiente celular, mas também afetará a capacidade do software de imagem para identificar corretamente as bordas do zero. Em contraste, muitas células na monocamada (100% confluentes, as células ou empilhadas) podem muito bem resultar em inibição de contacto, e, por conseguinte, alterar as características das células migratórias. Algumas variações do protocolo de ensaio zero recomendar o crescimento celular a 100% de confluência e não consideram essa limitação potencial para certas células sensíveis ao contato, como MSCs 8. As mesmas preocupações deve ser aplicado para o grau de danos que é inflicted nas células (Passo 1.5). O protocolo descrito aqui foi projetado para avaliar as mudanças na migração de células após os danos pela exposição à fumaça do cigarro solúvel nos MSCs capacidade migratórias, mas este ensaio pode ser igualmente útil para avaliar o efeito de diferentes tipos de danos sobre a migração celular. É importante que o dano aflito é suficiente para proporcionar uma distinção estatística entre os grupos experimentais e de controlo. No entanto, muito dano pode também resultar em confluência celular reduzida, que por sua vez podem afectar a capacidade do software de imagem para identificar correctamente as bordas do zero.
Ambos senescência celular e proliferação celular podem ser factores de confusão que podem falsamente alteram os resultados do ensaio de zero. Em particular, a geração do zero deve ser considerada cuidadosamente para evitar dano excessivo às células circundantes que pode resultar em senescência. Arranhando com uma ponta de pipeta de plástico em vez de um hypodermIC agulha ou bisturi evita o dano em excesso ao mesmo tempo que preservando a integridade da superfície da placa de cultura na zona de migração e a matriz extracelular (Passo 2.1). Além disso, o período de tempo durante o qual a migração celular é permitido ocorrer deve ser considerada cuidadosamente para evitar a proliferação celular significativa como uma variável de confusão (Passo 3.7). Para a análise da migração LR-MSC, 7 horas é o ideal quando se avalia as células danificadas com CSE. A incubação de células durante mais de 12 horas geralmente não é recomendado, no entanto, isso pode não se aplicar a todos os tipos de células, especialmente aqueles com taxas muito baixas de duplicação. Para avaliar quer a senescência celular e a proliferação de células, uma combinação de associados a senescência da beta-galactosidase e BrDU ou EdU incorporação pode ser realizada sobre as células no final do ensaio de 19. É importante ressaltar que o protocolo aqui descrito é acessível a laboratórios com capacidade técnica limitada, necessitando apenas de uma boa qualidade fase invertida microscópio de contraste e câmera. oOs reagentes são baratos, e o software de imagem é open source. No entanto, a fim de assegurar os melhores resultados deste ensaio, incluindo a boa reprodutibilidade e a capacidade para realizar uma análise estatística rigorosa, optimização cuidadosa deve ser considerado para cada novo tipo de célula ou danos cenário experimental que é tentada.
Otimizações apresentado neste endereço de protocolo de algumas das limitações presentes no trabalho anterior feito para padronizar ensaios zero. Considerando protocolos de ensaio scratch tradicionalmente tomar medidas de largura arranhão de um instantâneo do 8,9 zero, o protocolo apresentado aqui utiliza a medição da área a partir de imagens tiradas ao longo de todo o comprimento do zero para aumentar o rigor estatístico e levar em consideração inconsistências na largura de o zero inicial. Com base em testes repetidos (dados não mostrados), a largura zero não pode ser assumido como sendo perfeitamente consistente em todo o seu comprimento. Após a migração, as arestas de the zero tornar-se mais heterogênea, tornando-se cada vez mais difícil de calcular com precisão a largura zero, e ainda exigem cálculos de área. Este protocolo usa MRI_Wound_Healing_Tool, um programa de computador especializado, a fim de diminuir a subjetividade e aumentar a consistência quando se analisa área de rascunho. Enquanto não se sabe se os cálculos de largura simples poderiam produzir resultados específicos o suficiente para distinguir diferenças sutis na migração devido ao CSE prévia ou outro prejudicial, este protocolo demonstra essa sensibilidade. Otimizações apresentados neste protocolo renovar o ensaio zero comum para resolver estas limitações de forma economicamente viável, para oferecer opções para a personalização, e para fornecer técnicas adicionais para demonstrar sensibilidade e validar os resultados.
O ensaio quantitativo zero optimizado descrito neste protocolo é ainda limitado, considerando uma população de células, em vez de células individuais. Isto assum técnicaes que a população de células é relativamente homogéneo, e que isto irá resultar em características de migração relativamente homogéneas. Dependendo da aplicação, pode ser mais importante considerar a migração de células individuais em vez 8. Além disso, o protocolo do ensaio aqui descrito é zero dependente de uma população de células que não proliferam rapidamente o suficiente para confundir a análise de migração ao longo de um período de 4-7 horas. As linhas celulares que podem proliferar extensivamente durante este curto período de tempo não seria adequado para a análise utilizando esta técnica. Apesar destas limitações, este protocolo de ensaio zero quantitativa tem o potencial para uso em muitas aplicações diferentes. Por exemplo, um ensaio baseado em danos celulares pode ser optimizado e, em seguida, utilizado para avaliar a capacidade de tratamentos específicos para limitar os danos celulares. Em alternativa, este ensaio pode ser usado com linhas celulares de cancro de avaliar potenciais tratamentos para limitar a capacidade migratória, e, portanto, potencial metastático, of estas células. Este ensaio zero otimizada também é ainda limitada por possíveis perturbações no microambiente celular que são inevitáveis na geração do zero. No entanto, escolhendo cuidadosamente o nível de confluência celular, aumento da apoptose e da geração de folhas de células que foram parcialmente separados na borda do zero pode ser evitado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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