Abstract
עבור רוב פתוגנים יונקים, ביטוי גני פרופיל מחקרים היה מוגבל על ידי קשיים טכניים לכמת במדויק תעתיקי גני הפתוגן מרקמות נגועות. פתוגן RNA מהווה חלק זעיר של רנ"א הכל מבודד מדגימות רקמה נגועות. microarray וטכנולוגיות RNAseq לשניהם יש קשיים ביצירה קוראים אמינה לגנים הפתוגן הביעו בקול חלוש. זני הפתוגן מוטציה עם מופחת בהתפשטות vivo מהווים אתגר גדול עוד יותר. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פרופיל ביטוי גני vivo שהוא מאוד מהיר, מאוד רגיש ומאוד לשחזור. פיתחנו פרוטוקול זה במהלך החקירה שלנו של אלביקנס הפתוגן קנדידה הפטרייה במודל עכברי של פטרת הופץ hematogenously. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו מתועד קורסים של ג המוסדר באופן דינמי בזמן ביטוי אלביקנס גן במהלך זיהום בכליות, ותכונות בלתי צפויות גילו שלתגובות ביטוי גנים לטיפול תרופתי נגד פטריות in vivo.
Introduction
דינמיקת ביטוי גנים מחזיקה מידע חיוני על איך תא מגיב לשינויים סביבתיים. במקרה של חיידק מדביק, נתונים ביטוי גנים יכולים לספק תובנות רלוונטיות מבחינה קלינית על איך הפתוגן מתאים את עצמו לסביבת הזיהום וגורם נזק למארח. בשני העשורים האחרונים, מחקרי ביטוי גנים הן במבחנה in vivo שנוצרו כמות גדולה של נתונים והניחו בסיס להבנת ביולוגיה זיהום 1-3. עם זאת, טכנולוגיות פרופיל הנוכחיות כוללים microarray וRNAseq, אינן אופטימליות לפרופיל של ביטוי גני הפתוגן בזיהום. לארח RNA מהווה חלק מכריע (בדרך כלל> 99%) של RNA הכולל מבודד מדגימות רקמה נגועות. RNA המארח תורם לרקע גבוה בmicroarrays, ושולט רצף קורא מRNAseq. בידוד תא הפתוגן מהרקמה נגועה, בתאוריה, יכול לעזור להעשרה לRNA הפתוגן, אבל זה מציב בנוסףבעיות אל: היא דורשת כמויות גדולות של רקמה נגועה; ההליך יכול להיות מייגע; והכי חשוב, שקשה לשמר את המדינה או שלמות של RNA ילידים בתהליך הארוך. על מנת להפיק נתונים יותר מקיפים ומדויקים על ביטוי גני הפתוגן בזיהומים אמיתיים, יצאנו לפתח פרוטוקול המאפשר כימות אמינה וחסכונית של מיני RNA המיעוט באוכלוסיית RNA מעורבת.
NanoString nCounter היא פלטפורמה שפותחה לאחרונה שעושה מדידה מרובבת ישירה של ביטוי גנים באמצעות זוגות בדיקה מקודד בר דיגיטלי 4, 5. יש פלטפורמה זו רמת רגישות דומה לזה של qRT-PCR אבל אינו דורשת הגברה האנזימטית. הטכנולוגיה אינה הגנום, היא מאפשרת זיהוי של עד 800 גנים שונים בכל assay. לכן, חשוב לבחור גנים אינפורמטיבי כמו בדיקות לפרופיל. כאן אנו משתמשים ביטוי גני פרופיל מחקר של זמזום גדולפתוגן, קנדידה אלביקנס, במהלך זיהום פולשני כדוגמא, כדי להדגים: 1) פרטים טכניים של הפרוצדורות (פרוטוקול), 2) רגישות, שחזור והטווח דינמי של שיטה זו (תוצאות נציג), ו -3) חשובה שיקולים לתכנון וביצוע ניסויים המבוססים על פרוטוקול זה (דיון). פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לפתוגנים שונים ויושם בהצלחה במספר דגמי זיהום 6-9.
Protocol
נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בלוס אנג'לס ביו-רפואי מכון המחקר (פרוטוקול 011,000) ובוצעו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות (NIH) לטיפול האתי בבעלי חיים. העכברים בכלוב במתקן מוכר-AAALAC ממוקם בקמפוס של אוניברסיטת קליפורניה-הארבור מחקר ומכון לחינוך. וטרינר במשרה מלאה המתמחה ברפואת חיות מעבדה פיקח טיפול בם. כליאה והבעלים סופקו על פי ההנחיות ב" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה "שירות בריאות הציבור בארה"ב פרסום. כל נעשה ניסיון לטיפול בעכברים אנושי. ההישרדות והבריאות של העכברים היו פיקוח שלוש פעמים ביום. ברור שעכברים חולים, רדום הופרדו מהקבוצה ומורדמת כדי למזער את הסבל. העכברים מורדמים ידי ממנת יתר pentobarbital (210 מ"ג / קילוגרם), כפי שהומלץ על ידי הפנל על EuthanasIA של האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית.
1. הכנת רקמות, ריאגנטים ומכשירים
- השתמש בעכברי BALB / ג גברי שקלול 20-22 גרם לכל המחקרים. לחסן שלושה עכברים בכל קבוצת ניסוי לוריד עם 1 x 10 6 שמרים-שלב ג תאי אלביקנס. להקריב בעלי חיים וכליות קציר בנקודות זמן ספציפיות לאחר פגיעה. מניחים כל כליה לתוך צינור כובע בורג, להצמיד הקפאה בחנקן נוזלי, וחנות ב -80 ° C להפקת RNA מאוחר יותר 6.
הערה: הניסויים בבעלי החיים בוצעו כפי שתואר בפירוט בet al שו 6.. - הכן את ריאגנטים ומכשירים הבאים לפני הסרת כליות מהמקפיא -80 ° C:
- פתח כוללת ערכת חילוץ RNA. הוסף 2-mercaptoethanol (V 1% / V) לחיץ RLT ומערבבים היטב (להכין 2 מיליליטר לכל דגימה).
- הכן פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול 25: 24: 1 (צריך 600 μl עבור כל דגימה).
- צינורות תווית M-סוג הומוגניזציה (M-צינור) ומקרר על קרח.
- 2 מיליליטר תווית בורג צינורות כובע, ולהוסיף כ -300 חרוזים Zirconia μl לכל צינור.
- מכשירי בדיקה זמינים: Dissociator רקמה, beadbeater, צנטריפוגה שולחן עם מתאמים לצינורות 50 מיליליטר ו 96 צלחות גם, פוטומטר.
2. RNA חילוץ מרקמות נגועות
- הסר צינורות המכילים כליות מהמקפיא -80 ° C ולשים על קרח. להוסיף 1.2 מיליליטר חיץ RLT עם mercaptoethanol-2 לכל כליה. למזוג כליות עם חיץ לצינורות הומוגניזציה M-סוג.
- Homogenize הכליות באמצעות Dissociator רקמה על RNA_02.01 הגדרה טעונה מראש.
- צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 בצנטריפוגה שולחן בRT.
- העבר את homogenate 600 μl לצינור כובע בורג המכיל חרוזים Zirconia. שמור את homogenate שנותר על קרח.
- להוסיף 600 פנול μl: כלורופורם: isoamyl אלכוהול 25: 24: 1 להצינורות מהשלב הקודם.
- סגרו את העפעפיים בחוזקה ומערבולת בbeadbeater 3 דקות בחדר קר 4 מעלות צלזיוס.
- בצנטריפוגה הצינורות ב 15,000 XG במשך 5 דקות בחדר קר 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר בזהירות את השלב המימי לצינור microfuge 1.5 מיליליטר חדש, ומערבב היטב עם נפח שווה של 70% אתנול, ולאחר מכן לטעון על טור הספין (עומס פעמיים).
- לשטוף את עמודת ספין פעם אחת עם 700 RW חיץ μl, ואחריו פעמיים עם 500 הרשתית חיץ μl. צנטריפוגה דקה אחת נוספת בצינור איסוף יבש כדי להסיר נוזל שנותר בעמודת הספין. לבצע את כל צעדי צנטריפוגה ב 8000 x גרם.
- Elute RNA עם 50 μl H 2 O. למדוד ריכוז RNA בOD 260 באמצעות ספקטרופוטומטר.
3. ביטוי גני פרופיל שימוש הדיגיטלי ברקוד
- מערך התוים הפשרת כתב (צינור כובע ירוק) ואת מערך התוים לכידה (צינור כובע אפור) על קרח.
- הוסף חוצץ הכלאה 130 μl למחדשמערך התוים שוער, להפוך לערבב וספין למטה.
- הוסף 20 μl של התערובת לכל אחד מצינורות התגובה 12.
- הוסף 10 מיקרוגרם של RNA הכולל רקמה (בהיקף של 5 μl) על צינור אחד. מערבבים על ידי pipetting.
- להוסיף את המערך התוים לכידה 5 μl לכל צינור. מערבבים על ידי היפוך הצינור ואחרי סיבוב מהיר במורד.
- דגירה תגובות על 65 מעלות צלזיוס בCycler תרמית עם O מכסה מחומם / N (~ 18 שעות).
- הוצא את מחסנית מדגם אחד מ-20 ° C ולתת לו חם לRT.
- הסר את שתי צלחות מגיב מ4 ° C ו צנטריפוגות ב 670 XG למשך 2 דקות בצנטריפוגה שולחן.
- הגדר את תחנת ההכנה הבאה הוראות צעד-אחר-צעד על המסך, בחר באפשרות הרגישות הגבוהה.
- הסר את התגובות מCycler התרמית ומייד לטעון בתחנת ההכנה. בחר כדי להפעיל את תכנית הרגישות הגבוהה (3 שעות).
- כאשר תכנית תחנת ההכנה היא מלאה, להוציא את המחסנית ולאטום את הנתיבים עם קלטת ברורה. Apרובדי שמן מינרלים לחלק התחתון של המחסנית (דור אחד nCounter בלבד, לאחר מכן דורות אינם דורשים שלב זה), ולאחר מכן טען את המחסנית על המנתח הדיגיטלי.
- הגדר את המנתח הדיגיטלי הבאים הוראות צעד-אחר-צעד על המסך, בחר באפשרות הסריקה ברזולוציה הגבוהה.
- בחר ברזולוציה הגבוהה אופציה (600 שדות), להפעיל את תכנית הסריקה (~ 4.5 שעות).
- כאשר תכנית הסריקה הושלמה, להוריד את התוצאות (או לבחור לקבל את התוצאות בדואר אלקטרוני), ולייבא את הנתונים גולמיים לתוך התוכנה של היצרן. התוכנה באופן אוטומטי לבדוק את איכות הנתונים ולהעלות דגלים אם איכות הנתונים נופלת מחוץ לטווח הנורמלי. לבצע התאמה טכנית באמצעות הפונקציה מובנית (האופציונלית, בצע את ההוראות בתוכנה), ואז לייצא את הנתונים כקובץ Excel.
- לנרמל את הנתונים באמצעות אחת מהשיטות הבאות: ספירה כוללת מכל הגנים במערך התוים; אחד או כמה גני בקרה פנימיים; ממוצע גיאומטריגנים של הביעו ביותר (ראה דיון).
- חשב את ערכי ביטוי הממוצעים עבור כל גן (אם הניסוי שנעשה במשכפל או triplicates), ואז לחשב את היחס של רמות ביטוי בין קבוצות ניסוי שונות.
- (לא חובה) לנתח ולחזות את תוצאות הפרופיל בפונקציות מובנות בתוכנת nSolver או תכנית אשכולות כגון MultiExperiment Viewer 10.
Representative Results
אתגר עיקרי אחת עבור ביטוי גני הפתוגן פרופיל in vivo הוא להשיג מספיק קוראת מRNA הפתוגן. בהתחשב באחוז הנמוך של תמלילי הפתוגן ברנ"א הכל, כמות גדולה של רנ"א הכל (10 מיקרוגרם>) יש להשתמש לכל תגובה. יש פלטפורמת יתרון ייחודי בנקודת מבט זו: הוא משתמש בשניהם בדיקה לכידה ובדיקת דו"ח להגדיל את הספציפיות, כך שהכמות העצומה של RNA המארח אינה גורמת לרמה משמעותית של רעש. כפי שניתן לראות באיור 1 (מותאם מRef. 6), ספירת רקע גלם מדגימת רקמה נגוע (נקודות אדומות) היו כל מתחת ל -10, ואילו סעיפי גלם משתי דגימות רקמה נגועות (נקודות כחולות) היו כל מעל 10. נתוני ביטוי שנוצרו השימוש בפרוטוקול זה הם מאוד לשחזור. כפי שניתן לראות באיור 1 (מותאם מRef. 6), ספירת גלם משני משכפל ביולוגי (נקודות כחולות, דגימות כליות לאחר זיהום 48 שעות) היה מאוד gooמתאם ד, עם ערך R-מרובע שווה 0.945. הפלטפורמה מספקת גם טווח דינמי מספיק כדי להקיף רמות טבעיות ביולוגיות ביטוי (איור 1, ספירת גלם נעה בין 10 1 ו -10 6).
שימוש בערכת בדיקה המפרטת 248 גני תגובה סביבתיים, היינו יכול להבחין בשני שלבים של ביטוי גני הפתוגן (איור 2, המותאם מאסמכתא 6.): תגובת ביטוי גנים מוקדמת כוללת גנים עם רמות RNA שונות באופן משמעותי בין הבידוד והשעה 12 דגימות לאחר פגיעה (P <0.05 ו> שינוי פי 2 בביטוי), ותגובת ביטוי גנים מאוחר כוללים גנים עם רמות RNA שהם שונים באופן משמעותי בין נקודת זמן 12 שעות בדגימות שלאחר זיהום 48 שעות (P <0.05 ו> פי 2 שינוי בביטוי). תוצאות אלו מצביעות כי ג ביטוי גני אלביקנס מוסדר באופן דינמי במהלך infectio פולשניתn של מארח יונקים.
איור 1. גלם סופר מרקמות כליה נגועות נגועות (מותאם מRef. 6). בדיקה נחשבת לשתיים (לאחר זיהום 48 שעות, נקודות נתונים כחולות) נגוע ו( נקודות אדומות נתונים) אחת נגוע דגימות כליות מוצגות כפיזור עלילה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ביטוי של ג אלביקנס גנים מגיבים לסביבה בזיהום פולשני (מותאמים מRef. 6). שינויים ברמות הביטוי במהלך פלישת כליות עכבר על 248 ג גני אלביקנס מוצגים במ 'חוםפורמט AP. ערכים ממוצעים של triplicates הביולוגי מוצגים ל( צהוב) עד-רגולציה ומטה-רגולציה (כחולה) של גנים בגיל 12, 24, וקרוב משפחה לאחר זיהום 48 שעות למתכוונים רמות הבידוד (0 שעה). רוויית צבע מייצגת את מידת שינוי הביטוי, עם רוויה מלאה ב 10 לקפל למעלה או למטה-רגולציה. חלקים של מפת החום מורחבים כדי להמחיש נציג המוקדם עד מוסדר גנים (למעלה), גנים מאוחר (באמצע), וגנים מטה-מוסדרים המוקדם (למטה). בחלקים אלה, דגימות בודדות מוצגות בנפרד כדי להמחיש שחזור. אנו מגדירים מוקדם ביטוי שינויים כהבדלים משמעותיים בין הבידוד ו -12 דגימות שעות. אנו מגדירים מאוחר ביטוי שינויים כהבדלים משמעותיים בין דגימות 12 שעות ו- 48. משמעות מתייחסת לשינויים של> 2 קיפול וp-value <0.05. הנתונים עבור כל דגימה היו מנורמלים לרמות RNA מTDH3 גן השליטה לפני ערכים ממוצעים חושבו. הקריטריונים לשיוך שלנו מאפשרים כמה דינמיקהגנים מוסדרים lly ליפול לשתי כיתות ביטוי המוקדמות ומאוחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
פרוטוקול זה פותח על מנת לייעל את פרופיל תעתיק של הדבקת חיידקים באמצעות פלטפורמת nanoString nCounter. ההליך כולו, מאוסף רקמות לנתונים ביטוי, דורש פחות מ 48 שעות. הידיים על הזמן היא סביב 4 שעות במשך 12 דגימות. משתנה אחד מפתח בפרוטוקול זה הוא הסכום של RLT חיץ נוסף לרקמה בצעד הראשון. יותר מדי חיץ יהיה לדלל את homogenate ולהוביל להורדת ריכוז RNA, ואילו מאגר קטן מדי עלול להוביל להיווצרות של ג'לי צמיג לאחר שלב חילוץ כלורופורם פנול ולא משאיר שלב המימי להתאוששות RNA. הכרכים אופטימליים באופן אמפירי שנקבעו של RLT חיץ לרקמות עכבר (בהנחת גדלים אופייניים) הם: כליות (1.2 מיליליטר), לשון (1.0 מיליליטר) וריאות (2.0 מיליליטר). לפתוגנים חיידקים, במיוחד אלה גדלו בצורת פילמנטיות, צעד מכות-חרוז עוזר לשבור קיר תא עבה פתוח לשחרר באופן מלא תוכן סלולארי. בשלב elution, על מנת להגדיל את RNA הסופיריכוז, eluate הסיבוב הראשון ניתן להוסיף לראש הטור, וelute בפעם שנייה. כ 100 מיקרוגרם של RNA הכולל רקמה ניתן לשחזר מעמודה אחת ספין RNeasy (~ 2 מיקרוגרם / μl x 50 μl). אם יש צורך בכמות גדולה יותר של רנ"א, הכנה שנייה יכולה להיות עשויה מhomogenate הרקמות שנותר. אין להשליך את homogenate שנותר עד ריכוז RNA כבר נמדד, רק במקרה.
בהתאם לדגם הזיהום, גודל הבידוד ומתח הפתוגן, אחוז RNA הפתוגן בסך RNA רקמה משתנים בין 0% -2%, ובדרך כלל נופלים בטווח של 0.05% -0.5%. לדוגמא, 10 מיקרוגרם של רנ"א רקמות המוחלט מג אלביקנס נגוע בכליות יכולות ליצור ספירת גלם שווה לזה של 10 ng של ג הטהור אלביקנס RNA מתרבות במבחנה (10 ng / 10 מיקרוגרם = 0.1%). בגלל אחוז RNA הפתוגן בסך RNA רקמה משתנה במגוון רחב, קשה לדעת את כמות pathogeRNA n בכמות נתונה של רנ"א הכל. כדי להימנע מבזבוז מערך התוים (250 x 192 תגובות גנים, העלות לכל תגובה היא סביב 200 $) על דגימות עם RNA הפתוגן מתחת לרמת זיהוי, צעד בקרת איכות RNA עשוי להתבצע כדי לקבוע את רמת RNA הפתוגן בתוך מדגם זה. ניתן לעשות זאת על ידי שני Q-RTPCR או מערך התוים קטן המכיל כמה גני משק בית.
נורמליזציה באמצעות גני הפתוגן היא שלב קריטי לפני פרופילי הביטוי ניתן להשוות בין מדגמים שונים. ישנן שלוש שיטות נפוצות לנורמליזציה. 1. ספירה כוללת שימוש מכל הגנים במערך התוים. 2. השתמש באחת או כמה גנים "משק בית". 3. השתמשו בממוצע הגיאומטרי (ה שורש של המוצר של מספרי N N) של גנים הביעו מאוד. למערך התוים גדול (> 100 גנים) המכיל בדיקות שנבחרו באקראי, תוך שימוש בספירה כוללת של נורמליזציה יכולה להיות בחירה טובה, כי הספירה הכוללת של מספר גדול של גנים שאינם קשורים רשאית אמונהלשקף באופן מלא את כמות קלט RNA. למערך התוים קטן (<100 גנים) המכילים בדיקות התמקדו בתהליך מסוים (כגון צמיחת hyphal, בהתחשב בכך שגנים של צמיחת hyphal נוטים להיות שותף מוסדר), בחירה אחת או כמה גני משק בית כשליטה לנורמליזציה היא חיונית. TDH3, גן חילוף חומרים הביע חסונה, שימש גם כשליטה לניסויים רבים. השיטה השלישית היא שיטה היברידית של 1 ו -2, בדגש על תרומה שווה מהגנים הביעו מאוד.
למרות שפלטפורמת nCounter לא הגנום, היא מאפשרת כימות של רמת ביטוי של עד 800 גנים בassay אחד. לכן, בחירת גנים אינפורמטיבי ביותר לנתח היא קריטית להצלחה של הפרופיל. שתי גישות כדי לבחור לבדיקות כבר בשימוש. הגישה הראשונה היא "ידע מבוסס". מידע מביטוי שפורסם ונתונים פונקציונליים נערך למסך לגנים שיש בם עניין הפוטנציאל הנוכחיללמוד, כגון גני התגובה הסביבתיים 6-9. גישה זו מאפשרת השוואה קלה של פרופיל in vivo נתונים למערכי נתונים קיימים רבים, ולכן מתן הקשר לפרשנות הנתונים. הגישה השנייה היא "חקר מבוסס". קטגוריה של גנים בגנום חיידק, כגון כל הגנים המפרטים גורמי שעתוק, קינאז או קיר תא חלבונים שנבחרו לבדיקות. גישה זו מאפשרת זיהוי של גורמי רומן אלימות וגילוי של יחסי רגולציה רומן המבוססים על in vivo פרופיל נתונים 6.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), וR01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E.
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
