Gene Expression Profilering infisere Mikrober bruke et digitalt Bar-koding Platform

Abstract

For de fleste pattedyr patogener, har genuttrykk profilering studier blitt begrenset av tekniske vanskeligheter å nøyaktig kvantifisere patogen gentranskriptene fra infiserte vev. Patogen RNA utgjør en liten del av det totale RNA isoleres fra infiserte vevsprøver. Både microarray og RNAseq teknologiene har vanskeligheter med å generere pålitelige leser for svakt uttrykt patogen gener. Mutant patogene stammer med redusert in vivo spredning utgjøre en enda større utfordring. Her beskriver vi en in vivo genuttrykk profilering protokoll som er svært rask, ekstremt følsom og reproduserbar. Vi utviklet denne protokollen under etterforskning av sopp patogen Candida albicans i en musemodell hematogen disseminert candidiasis. Ved hjelp av denne protokollen, har vi dokumentert gang kurs av dynamisk regulert C. albicans genuttrykk under nyre infeksjon, og oppdaget uventede trekkgenuttrykk svar på soppdrepende behandling in vivo.

Introduction

Genuttrykk dynamikk har viktig informasjon om hvordan en celle reagerer på endringer i miljøet. I tilfelle av en infiserer mikrobe, kan genekspresjonsdata gi klinisk relevante innsikt i hvordan en patogen tilpasser seg infeksjonen miljøet og forårsaker skade på verten. I de siste to tiårene, har genuttrykkstudier både in vitro og in vivo generert store mengder data og lagt et grunnlag for å forstå infeksjon biologi ^1-3. Men dagens profilering teknologier inkludert microarray og RNAseq, er ikke optimal for profilering av patogen genuttrykk under infeksjon. Verts RNA utgjør en overveldende del (vanligvis> 99%) av den totale RNA isoleres fra infiserte vevsprøver. Verten RNA bidrar til høy bakgrunn på mikromatriser, og dominerer sekvens leser fra RNAseq. Patogen celle isolert fra infisert vev, i teorien, kan hjelpe til å anrike for patogen RNA, men det utgjør tilsetningal problemer: det krever store mengder infisert vev; prosedyren kan være kjedelig; og viktigst av alt, er det vanskelig å bevare den opprinnelige tilstand eller integritet RNA under langvarig prosess. For å generere mer omfattende og nøyaktige data om patogen genuttrykk under reelle infeksjoner, setter vi ut for å utvikle en protokoll som gjør det mulig pålitelig og kostnadseffektiv kvantifisering av minoritets RNA arter i en blandet RNA befolkning.

NanoString NCounter er en nylig utviklet plattform som gjør direkte multiplex måling av genuttrykk ved hjelp av digitale strekkodet probe par ^{4, 5.} Har denne plattformen en følsomhetsnivå sammenlignes med QRT-PCR, men krever ikke enzymatisk forsterkning. Teknologien er ikke genom-wide, det tillater påvisning av opptil 800 forskjellige gener i hver analyse. Derfor er det viktig å velge informative gener som prober for profilering. Her bruker vi genuttrykk profilering studie av et større humet patogen, Candida albicans, i løpet av en invasiv infeksjon som et eksempel, for å demonstrere: 1) Tekniske data for den eksperimentelle prosedyrer (Protocol), 2) Følsomheten, reproduserbarhet og dynamisk område av denne metoden (representative resultater), og 3) Viktig betraktninger for å utforme og utføre eksperimenter basert på denne protokollen (diskusjon). Denne protokollen kan enkelt tilpasses for ulike patogener og har blitt brukt i en rekke smittemodeller ^6-9.

Protocol

Alle dyre prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Los Angeles Biomedical Research Institute (protokoll 011 000) og utført i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for etisk behandling av dyr. Musene ble bur i en AAALAC-akkreditert anlegget ligger på campus av Harbor-UCLA Research and Education Institute. En heltids veterinær som er spesialist på forsøksdyr medisin overså deres omsorg. Caging og dyrehold ble gitt i henhold til retningslinjene i US Public Health Service publikasjonen "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr". Alle forsøk ble gjort for å behandle musene humant. Overlevelsen og helse av musene ble målt tre ganger daglig. Tydeligvis syke, lethargic mus ble segregert fra gruppen og avlives for å minimere lidelse. Musene ble avlivet av pentobarbital overdose (210 mg / kg), som anbefalt av Panel on Euthanasia of American Veterinary Medical Association.

1. Utarbeidelse av vev, reagenser og instrumenter

1. Bruk hann Balb / c-mus som veier 20-22 g i alle studier. Vaksinere tre mus per eksperimentelle gruppen intravenøst ​​med 1 x 10 ⁶ gjær-fase C. albicans celler. Ofre dyr og slakte nyrer på bestemte tidspunkter etter infeksjonen. Plasser hver nyre inn i en skrukork, snap fryse i flytende nitrogen, og oppbevar ved -80 ° C for senere RNA ekstraksjon ^6.
   Merk: De dyreforsøk ble utført som beskrevet i detalj i Xu et al ^6..
2. Forbered følgende reagenser og instrumenter før du fjerner nyrene fra -80 ° C fryser:
   1. Åpne en total RNA ekstraksjon kit. Tilsett 2-merkaptoetanol (1% v / v) for å bufre RLT og bland godt (forberede 2 ml for hver prøve).
   2. Forbered fenol: kloroform: isoamylalkohol 25: 24: 1 (trenger 600 mL for hver prøve).
   3. Merk M-type homogenisering rør (M-tube) og kulden på is.
   4. Merk 2 ml skrukork rør, og legge til ca 300 mL Zirconia perler i hvert rør.
   5. Sjekk instrumenter er tilgjengelige: vev dissociator, beadbeater, tabletop sentrifuge med adaptere for 50 ml rør og 96 brønners plater, fotometer.

2. RNA Utvinning fra Infiserte Vev

1. Fjern rør som inneholder nyrer fra -80 ° C fryser og lagt på is. Tilsett 1,2 ml buffer RLT med 2-merkaptoetanol til hver nyre. Dekanter nyre med buffer til et M-type homogenisering rør.
2. Homogen nyrene ved hjelp av en vev dissociator på pre-loaded innstilling RNA_02.01.
3. Sentrifuger ved 1000 x g i 1 minutt i en bordsentrifuge ved RT.
4. Overfør 600 mL homogenate til skrukork som inneholder Zirconia perler. Lagre de rester homogenate på is.
5. Legg 600 ul fenol: kloroform: isoamylalkohol 25: 24: 1 tilrørene fra det forrige trinnet.
6. Lukk dekslene tett og virvle på beadbeater for 3 min i en 4 ° C kaldt rom.
7. Sentrifuger ved 15.000 xg rørene i 5 minutter i et 4 ° C kaldt rom.
8. Overføre nøye den vandige fasen til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør, bland godt med like stort volum av 70% etanol, og deretter legger på spinnkolonne (last to ganger).
9. Vask spin kolonne gang med 700 mL buffer RW, etterfulgt av to ganger med 500 mL buffer RPE. Sentrifuger en ekstra minutt i en tørr oppsamlingsrør for å fjerne gjenværende væsken i spinnkolonne. Utfør alle sentrifugeringstrinn på 8000 x g.
10. Elute RNA med 50 pl H _to O. Mål RNA konsentrasjon på OD ₂₆₀ ved hjelp av et spektrofotometer.

3. Gene Expression profilering Bruke Digital Bar-koding

1. Tine reporter codeset (grønn cap tube) og fangst codeset (grå cap tube) på is.
2. Legg 130 mL hybridiseringsbuffer til reporter kodesett, invertere å mikse og spinne ned.
3. Tilsett 20 pl av blandingen for hver av de 12 reaksjonsrørene.
4. Tilsett 10 ug av total RNA vev (i et volum på 5 pl) til hvert rør. Bland ved pipettering.
5. Tilsett 5 ul fange kodesett til hvert rør. Bland ved å vende røret etterfulgt av en rask spinn ned.
6. Inkuber reaksjonene ved 65 ° C i en termosykler med oppvarmet lokk O / N (~ 18 timer).
7. Fjern én prøve patron fra -20 ° C og la den varme til RT.
8. Fjern to reagens-plater fra 4 ° C og sentrifuger ved 670 xg i 2 minutter i en bordsentrifuge.
9. Sett opp prep stasjonen følgende steg-for-steg instruksjoner på skjermen, velger du den høye følsomheten alternativet.
10. Fjern reaksjonene fra termosykleren og umiddelbart laste på prep stasjonen. Velg å kjøre høy følsomhet programmet (tre timer).
11. Når prep stasjonen programmet er fullført, fjerner kassetten og forsegle baner med en klar tape. Apply mineralolje til bunnen av patronen (for generasjon én NCounter bare, senere generasjoner ikke krever dette trinnet), og legg deretter kassetten på digital analysator.
12. Sett opp den digitale analysator følgende steg-for-steg instruksjoner på skjermen, velg høy oppløsning skannealternativ.
13. Velg høy oppløsning (600 felt) alternativet, kjører skanneprogram (~ 4,5 time).
14. Når skanneprogram er fullført, laste resultatene (eller velge å motta resultatene via e-post), og importere rådata til produsentens programvare. Programvaren vil automatisk sjekke datakvalitet og heve flagg hvis kvaliteten på dataene faller ut av normalområdet. Utføre teknisk justering ved hjelp av den innebygde funksjonen (valgfritt, følg instruksjonene i programvaren), deretter eksportere data som en Excel-fil.
15. Normalisere data ved hjelp av en av følgende metoder: totaltellinger fra alle gener i codeset; en eller noen få interne kontroll gener; geometrisk gjennomsnittav høyt uttrykte gener (se diskusjon).
16. Beregn middelverdien uttrykket verdiene for hvert gen (dersom forsøket ble gjort i replikater eller triplikater), deretter beregne forholdet mellom ekspresjonsnivåer mellom ulike forsøksgrupper.
17. (valgfritt) Analyser og visualisere profilering resultatene etter innebygde funksjoner i nSolver programvare eller en gruppering program som MultiExperiment Viewer ^10.

Representative Results

En hovedutfordring for patogen genuttrykk profilering in vivo er å få nok leser fra patogen RNA. Gitt den lave prosentandelen av patogen transkripter i total RNA, store mengder av total-RNA (> 10 ug) har til å bli anvendt for hver reaksjon. Plattformen har en unik fordel i dette perspektivet er: den bruker både en capture probe og en rapport probe for å øke spesifisiteten, slik at den overveldende mengden av vert-RNA ikke forårsaker en betydelig grad av støy. Som vist i figur 1 (tilpasset fra Ref. 6), var bakgrunns rå teller fra en infisert vevsprøve (røde prikker) alle under 10, mens rå teller fra to infiserte vevsprøver (blå prikker) var alle over 10. Expression data generert ved hjelp av denne protokollen er reproduserbar. Som vist i figur 1 (tilpasset fra Ref. 6), rå tellinger fra to biologiske replikater (blå prikker, 48 timer etter infeksjon nyre prøver) hadde veldig good korrelasjon, med R-kvadrat verdi lik 0,945. Plattformen har også tilstrekkelig dynamisk område til å omfatte naturlige biologiske ekspresjonsnivåer (figur 1, rå tellinger lå mellom 10 ¹ og 10 ^6).

Ved hjelp av en sonde sett spesifiserer 248 miljøresponsgener, var vi i stand til å skjelne to faser av patogen genuttrykk (Figur 2, tilpasset fra Ref. 6): en tidlig genuttrykk respons omfatter gener med RNA-nivåer vesentlig forskjellig mellom inokulumet og 12 timers etter infeksjon prøver (p <0,05 og> to gangers endring i ekspresjon), og en sen genekspresjon reaksjon omfatter gener med RNA-nivåer som er signifikant forskjellig i den 12 timers tidspunkt ved 48 timer etter infeksjon prøvene (P <0,05 og> 2 ganger endring i uttrykket). Disse resultatene indikerer at C. albicans genuttrykk er dynamisk regulert under invasive infection av en pattedyrvert.

Figur 1. Raw teller fra infiserte og ikke-infiserte nyre vev (tilpasset fra Ref. 6). Probe teller for to infisert (48 timer etter infeksjon, blå datapunkter) og en ikke-infiserte (røde datapunkter) nyreprøver presenteres som et strø plot. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Expression of C. albicans miljø responsive gener under invasive infeksjoner (tilpasset fra Ref. 6). Endringer i uttrykk nivåer under musen nyre invasjonen for 248 C. albicans gener er presentert i en varme map format. Middelverdiene for biologiske triplikater er vist i opp-regulering (gul) og nedregulering (blå) av gener ved 12, 24 og 48 timer etter infeksjon i forhold til bety podestoff nivåer (0 time). Fargemetning representerer omfanget av uttrykket forandring, med full metning ved 10 folde opp- eller nedregulering. Deler av kart varmen er utvidet til å illustrere representative tidlig up-regulerte gener (øverst), sene gener (midten), og tidlig nedregulert gener (nederst). I disse delene, er individuelle prøvene presenteres separat for å illustrere reproduserbarhet. Vi definerer tidlig uttrykk endringer som signifikante forskjeller mellom inokulumet og 12 timers prøver. Vi definerer sene uttrykk endringer som signifikante forskjeller mellom de 12 og 48 timers prøver. Betydning refererer til endringer i> 2 ganger og en p-verdi <0,05. Dataene for hver prøve ble normalisert til RNA-nivåer fra kontroll-genet TDH3 før middelverdiene ble beregnet. Våre oppdrags kriterier tillate noen Dynamically regulerte gener til å falle inn i begge de tidlige og sene uttrykk klasser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen er utviklet for å optimalisere transcriptional profilering for å infisere mikrober ved hjelp av en nanoString NCounter plattform. Hele prosedyren, fra vev samlingen til uttrykk data, krever mindre enn 48 timer. Hands-on tid er rundt 4 timer for 12 prøver. En sentral variabel i denne protokollen er mengden av buffer RLT lagt til vevet i den aller første skritt. For mye buffer vil fortynne homogenatet og føre til lavere RNA-konsentrasjon, mens for lite buffer kan føre til dannelse av viskøse geler etter fenol-kloroform-ekstraksjon trinn, og etterlater ingen vandig fase for gjenvinning av RNA. De empirisk bestemte optimale volumer av buffer RLT for musevev (forutsatt typiske størrelser) er: nyre (1,2 ml), tunge (1,0 ml) og lungen (2,0 ml). For mikrobielle patogener, spesielt disse dyrket i trådformede form, hjelper perle-slo skritt å bryte åpne tykk celleveggen til fullt frigjøre celleinnholdet. I elueringstrinnet, for å øke den endelige RNAkonsentrasjon, kan den første runden eluatet tilsettes tilbake til kolonnen, og eluering av en andre gang. Omtrent 100 mikrogram av total RNA vev kan gjenvinnes fra en RNeasy spinnkolonne (~ 2 ug / ul x 50 mL). Hvis større mengder RNA er nødvendig, kan en andre prep fremstilles fra den gjenværende vev homogenat. Ikke kast den gjenværende homogenate til RNA-konsentrasjon har blitt målt, bare i tilfelle.

Avhengig av infeksjonsmodell, inokulumet størrelse og patogen stamme, andelen av patogenet RNA samlet vev RNA varierer fra 0% -2%, og typisk faller innenfor 0,05% -0,5% rekkevidde. For eksempel, 10 pg av total RNA fra vev C. albicans infiserte nyre kan generere rå tellinger som tilsvarer antall 10 ng av ren C. albicans RNA fra en in vitro-kultur (10 ng / 10 ug = 0,1%). På grunn av at andelen av patogenet RNA samlet vev RNA varierer i et vidt område, er det vanskelig å vite hvor mye pathogen RNA i en gitt mengde av total RNA. For å unngå å sløse codeset (for 250 gener x 192 reaksjoner, er kostnaden per reaksjon rundt $ 200) på prøver med patogen RNA under deteksjonsnivå, kan en RNA kvalitetskontroll trinnet utføres for å bestemme patogenet RNA nivå innen hver prøve. Dette kan gjøres enten ved Q-rtPCR eller en liten kodesett som inneholdt noen få husholdningsgener.

Normalisering ved hjelp av patogene gener er et kritisk trinn før ekspresjonsprofiler kan sammenlignes mellom forskjellige prøver. Det er tre vanlige metoder for normalisering. 1. Bruk totaltellinger fra alle gener i codeset. 2. Bruk en eller noen få "housekeeping gener. 3. Bruk geometriske middel (N ^th roten av produktet av N tall) i høyt uttrykte gener. For en stor kodesett (> 100 gener) som inneholder tilfeldig utvalgte prober, ved hjelp av totaltellinger for normalisering kan være et godt valg, fordi de totale tellinger av et stort antall urelaterte gener kan trorepresentative mengden av RNA-inngang. For en liten kodesett (<100 gener) som inneholder prober fokusert på en bestemt prosess (som hyphal vekst, gitt at hyphal vekst gener tendens til å være co-regulert), velge ett eller noen få husholdningsgener som kontroll for normalisering er viktig. TDH3, et robust uttrykk metabolsk genet, har fungert godt som kontroll for mange eksperimenter. Den tredje metoden er en hybrid av fremgangsmåte 1 og 2, med en vekt på lik bidraget fra sterkt uttrykte gener.

Selv om NCounter plattformen ikke er genom-wide, gjør det kvantifisering av uttrykksnivået for opptil 800 gener i en enkelt analyse. Derfor velger de mest informative gener å analysere er avgjørende for suksessen til profilering. To metoder for å velge for prober er blitt brukt. Den første tilnærmingen er "kunnskapsbasert". Informasjon fra publiserte uttrykk og funksjonelle data er kompilert til skjerm for gener som er av potensiell interesse for den aktuellestudie, slik som de miljømessige responsgener ^6-9. Denne tilnærmingen gir enkel sammenligning av in vivo profilering data til mange eksisterende datasett, og dermed gir kontekst til data tolkning. Den andre metode er "letebasert". En kategori av gener i en mikrobe genom, som alle genene som spesifiserer transkripsjonsfaktorer, kinaser eller cellevegg proteiner er valgt for sonder. Denne tilnærmingen gjør identifisering av nye virulensfaktorer og oppdagelsen av nye regulatoriske relasjoner basert på in vivo profilering data ^6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotec	130-093-235
gentelMACS M tube	Miltenyl Biotec	130-093-236
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
2-mercaptoethanol	Sigma	M-3148
Phenol:CHCl3:IAA	Sigma	P-2069
Zirconia beads	Biospec Products	11079110zx
Mini-Beadbeater-16	Biospec Products	607
nCounter Analysis system	nanoString Technologies
nCounter Gene Expression Codesets	nanoString Technologies
nSolver Analysis tool	nanoString Technologies