Abstract
Para a maioria de agentes patogénicos de mamíferos, a expressão do gene profiling estudos têm sido limitados por dificuldades técnicas de quantificar com precisão a partir de transcritos de genes patógeno tecidos infectados. Hospedeiro ARN constitui uma pequena porção do ARN total isolado a partir de amostras de tecido infectado. Ambos microarray e tecnologias RNAseq tem dificuldades em gerar lê confiável para genes do patógeno fracamente expressas. Estirpes mutantes de patógenos com redução na proliferação vivo representar um desafio ainda maior. Aqui, descrevemos uma expressão in vivo do gene protocolo de perfil que é muito rápido, sensível e extremamente altamente reprodutível. Nós desenvolvemos este protocolo durante a nossa investigação dos fungos Candida albicans patógeno num modelo murino de candidíase hematologicamente disseminada. Usando este protocolo, temos documentado os períodos de C. dinamicamente reguladas expressão gênica albicans durante infecção nos rins, e características inesperadas descobertas derespostas de expressão gênica para tratamento da droga antifúngica in vivo.
Introduction
Dinâmica de expressão gênica detém informações vitais sobre como uma célula responde às mudanças ambientais. No caso de um microorganismo infectante, dados de expressão de genes pode fornecer informações clinicamente relevantes sobre como um agente patogénico se adapta ao ambiente infecção e causa danos ao hospedeiro. Nas últimas duas décadas, estudos de expressão gênica in vitro e in vivo têm gerado grande quantidade de dados e estabeleceu uma base para a compreensão da biologia da infecção 1-3. No entanto, as tecnologias de perfis atuais, incluindo microarray e RNAseq, não são ideais para criação de perfis de expressão gênica do patógeno durante a infecção. Host ARN constitui uma porção esmagadora (normalmente> 99%) do ARN total isolado a partir de amostras de tecido infectado. O ARN do hospedeiro contribui para a elevada interferência de fundo em microarrays, e domina sequência lê a partir RNAseq. Isolamento de células patógeno de tecidos infectados, em teoria, pode ajudar a enriquecer a RNA patógeno, mas coloca dissoproblemas AL: ele requer grandes quantidades de tecido infectado; o procedimento pode ser tedioso; e mais importante ainda, é difícil conservar o estado nativo ou a integridade do RNA durante o processo demorado. De modo a gerar dados mais completos e precisos sobre a expressão gênica do patógeno durante infecções reais, nos propusemos a desenvolver um protocolo que permite a quantificação confiável e rentável de espécies de RNA minoria em uma população mista RNA.
NanoString nCounter é uma plataforma recentemente desenvolvido que torna a medição multiplexado directa da expressão do gene utilizando pares de sondas de código de barras digital de 4, 5. Esta plataforma tem um nível de sensibilidade comparável à de qRT-PCR, mas não requer amplificação enzimática. A tecnologia não está à escala do genoma, que permite a detecção de até 800 genes diferentes em cada ensaio. Portanto, é fundamental para selecionar genes informativos como sondas para profiling. Aqui usamos perfil de expressão gênica estudo de uma grande humum patógeno, Candida albicans, durante uma infecção invasiva como um exemplo, para demonstrar: 1) As características técnicas dos procedimentos experimentais (protocolo), 2) A sensibilidade, reprodutibilidade e faixa dinâmica deste método (resultados representativos), e 3) Importante Considerações para a concepção e realização de experimentos baseados neste protocolo (discussão). Este protocolo pode ser facilmente adaptado para vários patogénios e tem sido aplicado com sucesso num número de modelos de infecção de 6-9.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional do Instituto de Pesquisa Biomédica de Los Angeles (protocolo 011000) e realizada de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) diretrizes para o tratamento ético dos animais. Os ratos foram engaiolados em uma instalação AAALAC credenciados localizado no campus de Porto-UCLA Instituto de Pesquisa e Educação. Um veterinário a tempo inteiro que se especializou em medicina de animais de laboratório supervisionou seus cuidados. Enjaulamento e pecuária foi fornecido de acordo com as diretrizes da publicação "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos. Foi feito todos os esforços para tratar os ratos humanamente. A sobrevivência ea saúde dos ratos foi monitorado três vezes ao dia. Obviamente doentes, ratos letárgicos foram segregados do grupo e sacrificados para minimizar o sofrimento. Os ratinhos foram eutanizados por overdose de pentobarbital (210 mg / kg), como recomendado pelo Painel em Euthanasia da American Veterinary Medical Association.
1. Preparação de Tecidos e Reagentes e Instrumentos
- Use ratinhos macho Balb / c pesando 20-22 g para todos os estudos. Inocular três murganhos por grupo experimental por via intravenosa com 1 x 10 6 de levedura em fase C. células albicans. Sacrificar animais e rins colheita em momentos específicos pós-infecção. Coloque cada rim para um tubo de tampa de rosca, encaixe congelamento em nitrogênio líquido, e armazenar a -80 ° C para posterior extração de RNA 6.
Nota: As experiências em animais foram realizados tal como descrito em detalhe em Xu et ai 6.. - Prepare os seguintes reagentes e instrumentos antes de retirar os rins do freezer -80 ° C:
- Abra um kit total de extração de RNA. Adicionar 2-mercaptoetanol (1% v / v) de tampão RLT e misturar bem (preparar 2 ml para cada amostra).
- Prepare fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1 (600 ul precisa para cada amostra).
- Etiqueta M-tipo tubos de homogeneização (M-tubo) e frio no gelo.
- Etiqueta 2 ml tubos com tampas de parafuso, e adicionar cerca de 300 contas de Zirconia ul a cada tubo.
- Verifique instrumentos estão disponíveis: Dissociator tecido, beadbeater, centrífuga de mesa com adaptadores para tubos de 50 ml e placas de 96 poços, fotômetro.
2. Extracção de ARN a partir de tecidos infectados
- Remover tubos contendo rins de -80 ° C freezer e colocar no gelo. Adicionar 1,2 ml de tampão RLT com 2-mercaptoetanol para cada rim. Decantar rim com tampão em um tipo M tubos de homogeneização.
- Homogeneizar o rim usando uma Dissociator tecido em ambiente pré-carregado RNA_02.01.
- Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min numa centrífuga de mesa à temperatura ambiente.
- Transferir 600 ul homogeneizado para o tubo de tampa de rosca contendo esferas de zircônia. Salve o homogeneizado restante no gelo.
- Adicionar 600 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1 aos tubos da etapa anterior.
- Fechar as tampas firmemente e vortex em beadbeater por 3 min em um 4 ° C câmara fria.
- Centrifugar os tubos a 15.000 xg durante 5 minutos numa sala fria a 4 ° C.
- Transferir cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, misturar bem com um volume igual de etanol a 70%, em seguida, carrega-se na coluna de centrifugação (de carga, duas vezes).
- Lava-se a coluna de centrifugação uma vez com 700 ul de tampão RW, seguido por duas vezes com 500 ul de tampão de EPR. Centrifugar um minuto adicional em um tubo de recolha de seco para remover o líquido remanescente na coluna de centrifugação. Execute todas as etapas de centrifugação a 8000 x g.
- Eluir com 50 ul de ARN H 2 O. Medir a concentração de OD de RNA em 260 utilizando um espectrofotómetro.
3. Perfil de expressão gênica Usando Digital Bar-codificante
- Codeset Thaw repórter (tubo de tampa verde) e captura de codeset (cinza tubo cap) em gelo.
- Adicionar 130 ul de tampão de hibridação para a reporter codeset, inverta para misturar e spin down.
- Adicionar 20 ul da mistura de cada um dos 12 tubos de reacção.
- Adiciona-se 10 ug de ARN total dos tecidos (em um volume de 5 ul) a cada tubo. Misturar por pipetagem.
- Adicionar 5 mL de captura codeset a cada tubo. Misture invertendo o tubo seguido por um giro rápido para baixo.
- Incubam-se as reacções a 65 ° C num termociclador com tampa aquecida S / N (~ 18 horas).
- Remova um cartucho de amostra de -20 ° C e deixe aquecer a RT.
- Remover duas placas de reagentes a partir de 4 ° C e centrifugação a 670 xg durante 2 minutos numa centrífuga de mesa.
- Configurar a estação prep seguindo as instruções passo-a-passo na tela, selecione a opção de alta sensibilidade.
- Retirar as reacções do termociclador e carregar imediatamente na estação de preparação. Selecione para executar o programa de alta sensibilidade (3 h).
- Quando o programa da estação prep for concluída, remova o cartucho e selar as pistas com uma fita adesiva transparente. Apcamada de óleo mineral para a parte inferior do cartucho (para a geração de uma única nCounter, gerações posteriores não requerem este passo), em seguida carregar o cartucho para o analisador digital.
- Configure o analisador digital de acordo com as instruções passo-a-passo na tela, selecione a opção varredura de alta resolução.
- Selecione a opção (600 campos) de alta resolução, execute o programa de digitalização (~ 4,5 horas).
- Quando o programa de digitalização estiver concluída, baixar os resultados (ou optar por receber os resultados por e-mail) e importe os dados brutos em software do fabricante. O software irá automaticamente verificar a qualidade dos dados e levantar bandeiras se a qualidade dos dados cai fora da faixa normal. Execute ajustamento técnico utilizando a função built-in (opcional, siga as instruções do software), em seguida, exportar os dados como um arquivo do Excel.
- Normalizar os dados utilizando um dos métodos seguintes: contagens totais de todos os genes no conjunto de códigos; um ou alguns genes de controlo interno; média geométricagenes de altamente expressos (ver discussão).
- Calcular os valores médios de expressão para cada gene (se o experimento foi realizado em triplicado ou repetições), em seguida, calcular a relação entre os níveis de expressão entre diferentes grupos experimentais.
- (opcional) analisar e visualizar os resultados de perfis de funções embutidas no software nSolver ou um programa de agrupamento, como MultiExperiment Visualizador 10.
Representative Results
Um desafio principal para a expressão do gene profiling patógeno in vivo é conseguir o suficiente lê a partir de RNA patógeno. Dada a baixa percentagem de transcritos de ARN total em organismos patogénicos, grande quantidade de ARN total (> 10 ug) tem de ser utilizado em cada reacção. A plataforma tem uma vantagem única nesta perspectiva: utiliza tanto uma sonda de captura e uma sonda de relatório para aumentar a especificidade, de modo a que a enorme quantidade de ARN do hospedeiro não causa um significativo nível de ruído. Como mostrado na Figura 1 (adaptado a partir de Ref. 6), as contagens de fundo a partir de uma amostra em bruto de tecido não infectado (pontos vermelhos) foram todos inferiores a 10, enquanto que as contagens a partir de matérias duas amostras de tecidos infectados (pontos azuis) foram todos acima 10. Os dados gerados Expressão usando este protocolo são altamente reprodutível. Como mostrado na Figura 1 (adaptado a partir de Ref. 6), as contagens de matérias de duas réplicas biológicas (pontos azuis, 48 hr amostras de rim pós-infecção) tinha viscosidade muitocorrelação d, com valor de R ao quadrado é igual a 0,945. A plataforma também prevê uma gama dinâmica suficiente para abranger os níveis de expressão biológicas naturais (Figura 1, a contagem de matérias variou entre 10 e 10 1 6).
Usando um conjunto de sonda especificando 248 genes de resposta ambiental, fomos capazes de discernir duas fases de expressão gênica do patógeno (Figura 2, adaptada de Ref. 6): um gene de expressão resposta precoce compreende genes com níveis de RNA significativamente diferentes entre o inóculo e 12 hr amostras pós-infecção (p <0,05> mudança de 2 vezes na expressão), e uma expressão de resposta de um gene tardio compreende genes com níveis de ARN que são significativamente diferente entre o ponto de tempo de 12 h a amostras de pós-infecção de 48 h (P <0,05 e> mudança na expressão de 2 vezes). Estes resultados indicam que a C. a expressão do gene é regulada albicans dinamicamente durante INFECTIO invasivan de um hospedeiro mamífero.
Figura 1. Raw conta a partir de tecidos renais infectados e não infectados (adaptado de Ref. 6). Probe conta para dois infectado (48 horas pós-infecção, pontos de dados azul) e um não infectados (pontos de dados vermelhos) amostras de rim são apresentados como uma dispersão enredo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Expressão de C. albicans genes ambientalmente sensíveis durante a infecção invasiva (adaptado de Ref. 6). As alterações nos níveis de expressão durante a invasão do rim do rato para 248 C. albicans genes são apresentados em um calor mformato ap. Os valores médios de triplicados biológicas são mostrados para up-regulação (amarelo) e sub-regulação (azul) de genes, às 12, 24 e 48 horas após a infecção em relação à média dos níveis de inóculo (0 h). Saturação de cor representa a extensão da mudança de expressão, com saturação completa em 10 vezes para cima ou para baixo-regulação. Partes do mapa de calor são expandidos para ilustrar representante início de up-regulamentados genes (em cima), genes tardios (meio) e genes cedo para baixo-regulado (em baixo). Nestas porções, as amostras individuais são apresentados separadamente para ilustrar a reprodutibilidade. Nós definimos as mudanças de expressão adiantados como diferenças significativas entre o inóculo e 12 amostras h. Nós definimos as mudanças de expressão final como diferenças significativas entre os 12 e 48 amostras h. Significância refere-se a alterações de> 2 vezes e um valor de p <0,05. Os dados para cada amostra foram normalizadas para os níveis de ARN de controlo do gene TDH3 antes de os valores médios foram calculados. Nossos critérios de atribuição permitem que alguns Dynamically genes regulados a cair em ambas as classes de expressão precoce e tardio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo é desenvolvido para otimizar o perfil transcricional de infectar micróbios usando uma plataforma nanoString nCounter. Todo o processo, desde a recolha de dados de expressão de tecido, requer menos do que 48 h. Os hands-on tempo é de cerca de 4 horas para 12 amostras. Uma variável-chave neste protocolo é a quantidade de RLT tampão adicionado ao tecido na primeira etapa. O excesso de tampão irá diluir o homogenato e levar a uma concentração mais baixa de ARN, enquanto muito pouco tampão pode levar à formação de géis viscosos após o passo de extracção com fenol clorofórmio e não deixam fase aquosa para a recuperação de ARN. Os volumes óptimos determinados empiricamente de RLT tampão para tecidos de ratinho (assumindo que os tamanhos típicos) são: rim (1,2 ml), a língua (1,0 ml) e pulmão (2,0 mL). Para patógenos microbianos, especialmente estes cultivadas em forma filamentosa, o passo-batendo talão ajuda a quebrar parede celular espessa para liberar totalmente conteúdo celular. No passo de eluição, a fim de aumentar o final de ARNconcentração, o primeiro eluato redonda pode ser adicionado de volta para a coluna, e elui-se uma segunda vez. Cerca de 100 ug de ARN total de tecido pode ser recuperada a partir de uma coluna de centrifugação RNeasy (~ 2 mg / mL x 50 mL). Se for maior quantidade de ARN é necessária, uma segunda preparação pode ser feita a partir do homogeneizado de tecido remanescente. Não descarte do homogeneizado restante até concentração de RNA foi medido, apenas no caso.
Dependendo do modelo de infecção, o tamanho do inoculo e a estirpe de agente patogénico, a percentagem de ARN patógeno em ARN total dos tecidos varia de 0% a 2%, e cai tipicamente dentro da gama de 0,05% -0,5%. Por exemplo, 10? G de RNA total de tecido de C. albicans infectados rim poderia gerar contagens bruto igual a de 10 ng de puro C. albicans de ARN a partir de uma cultura in vitro (10 ng / 10 g = 0,1%). Uma vez que a percentagem de ARN patógeno no RNA total de tecido varia de uma vasta gama, é difícil saber a quantidade de pathogeARN n numa dada quantidade de ARN total. Para evitar o desperdício de conjunto de códigos (por 250 x 192 genes de reacções, o custo por reacção é de cerca de $ 200) em amostras de ARN com patógeno abaixo do nível de detecção, um passo de controlo de qualidade de ARN pode ser realizada para determinar o nível de ARN de agentes patogénicos no interior de cada amostra. Isto pode ser feito por qualquer uma das Q-RT-PCR ou um pequeno conjunto de códigos contendo alguns genes housekeeping.
Normalização usando genes do patógeno é um passo crítico antes de os perfis de expressão podem ser comparados entre diferentes amostras. Existem três métodos comumente usados para a normalização. 1. Use as contagens totais de todos os genes no conjunto de códigos. 2. Use um ou poucos genes 'limpeza'. 3. Utilização da média geométrica (N ° raiz do produto de N números) de genes altamente expressos. Para um grande conjunto de código (> 100 genes) contendo sondas seleccionadas aleatoriamente, utilizando as contagens totais para a normalização pode ser uma boa escolha, pois as contagens totais de um grande número de genes independentes podem férefletir completamente a quantidade de entrada RNA. Para um pequeno conjunto de códigos (<100 genes) contendo sondas focados em um processo específico (como o crescimento de hifas, dado que os genes de crescimento de hifas tendem a ser co-regulado), a escolha de um ou alguns genes de limpeza como controle para a normalização é essencial. TDH3, um gene metabólico robustamente expressa, tem servido bem como o controle de muitas experiências. O terceiro método é um híbrido de método 1 e 2, com ênfase para a contribuição igual a partir de genes altamente expressos.
Embora a plataforma nCounter não está à escala do genoma, que permite a quantificação do nível de expressão para 800 genes de um único ensaio. Portanto, a escolha dos genes mais informativos para analisar é crítico para o sucesso do perfil. Duas abordagens para selecionar para as sondas têm sido utilizados. A primeira abordagem é "baseada no conhecimento". Informações de expressão publicados e dados funcionais é compilado para a tela para genes que são de interesse potencial para a correnteestudar, tais como os genes de resposta ambientais 6-9. Esta abordagem permite a fácil comparação de perfis de dados in vivo para muitos conjuntos de dados existentes, portanto, fornecendo contexto para interpretação dos dados. A segunda abordagem é "exploração baseado". Uma categoria de genes no genoma de um microrganismo, tal como todos os genes que especificam os factores de transcrição ou proteínas, cinases de parede celular são escolhidos para sondas. Esta abordagem permite a identificação de novos fatores de virulência e descoberta de relações reguladoras novos com base no perfil de dados in vivo 6.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH concede R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), e R01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E.
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
